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摘要：将不同来源的60株菌株进行致病性试验及血清补体抗性检测，探讨补体抗性与鸡大肠埃希菌致病力的相互关系。结果表明，大肠杆菌在血清中的存活能力与其致病力间相关系数为0.259，P值=0.046<0.05，即大肠杆菌的补体抗性与其致病力显著相关。
关键词：鸡；大肠杆菌；致病性；血清补体；抗性
中图分类号： S858.31文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0301-02
收稿日期：2014-11-18
基金项目：国家自然科学基金青年项目（编号：31302128）。
作者简介：李贵萧（1991—），女，山东德州人，主要从事食品营养与卫生方面的研究。
通信作者：樊琛。E-mail：[email protected]。 鸡大肠杆菌病是由大肠杆菌中的某些致病性菌株引起的鸡感染性疾病的总称，是养鸡生产中常见的一种传染病，该病可增加其他病原体感染机会，对养殖及食品安全有较大影响[1-3]。为了解典型大肠杆菌的特性，了解大肠杆菌血清抗性与致病性的关系，对60株菌进行血清补体抗性试验，并结合鸡胚致死率探索鸡大肠杆菌的致病力及其补体抗性的作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源BL21、TG1为感受态细菌；SL1、SL3、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7、SD8、SD10、SD11、SD12、SD13、SD14、SD15、SD17、SD18、SD19、SD20、SD21、SD22、SD23、SD24、SD25、SD26、SD27、SD28、SD29、SD30、SD31、SD32、SD33、SD34、SD35，共34株，采自于山东地区健康鸡粪便，聊城大学食品安全教研室保存；cvcc1551、cvcc1553、cvcc1562、cvcc1568、O1、O78，购于中国兽医药品监察所；O2、新大、田大、北京1、北京3、贵州分别为来自北京市、贵州省、黑龙江省3个发病鸡场分离的强毒株，由东北农业大学预防兽医教研室保存；E1、E4、E5、E7、E8、E9、E10、E11、E14、E18、E21、E27从外观健康的不同雏鸡粪便中分离鉴定获得，由东北农业大学预防兽医教研室保存。
1.1.2试剂伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、LB普通营养肉汤培养基、普通营养琼脂、生化试验鉴定管、各种生物化学试剂，均购自青岛海博生物技术有限公司。
1.1.3试验动物11日龄鸡胚购于山东省聊城市阳谷县。
1.2方法
1.2.1细菌的活化挑取活化的菌种接种于伊红美蓝培养基于37 ℃恒温箱培养24 h后，挑取紫黑色带绿色金属光泽的菌落，连续2次接种于麦康凯琼脂平板，继续培养 24 h[4-6]。选纯红色菌落，以无菌操作进行抹片、革兰氏染色镜检，进行IMViC生化鉴定试验，确定后于LB普通营养肉汤进行纯扩增培养24 h[7-11]，记录试验结果，纯培养物置于 4 ℃ 冰箱备用。
1.2.2细菌的致病性试验用接种环挑取平板上的单菌落，在普通营养肉汤中37 ℃摇床培养10～12 h。取1 mL的菌液4 000 r/min离心2 min，弃去上清液，再用生理盐水洗2次，倍比稀释。取0.1 mL稀释液经尿囊腔注射11日龄SPF鸡胚，100～300 CFU/只，每组10只，同时取0.1 mL稀释液涂板，做细菌计数。对照组注射生理盐水，共注射10只。于恒温培养箱37 ℃培养，每日检蛋，记录每日死亡数，至第4天，记录胚胎的死亡率。
1.2.3血清制备无菌操作取鸡血于已灭菌的离心管中，37 ℃ 放置1～2 h，再于4 ℃静置3～4 h，3 000 r/min离心 20 min，取上清液于-20 ℃保存[8-9]。
1.2.4菌株血清抗性检测用接种环挑取平板上的单菌落，在LB液体培养基中37 ℃培养至对数期。取500 μL菌液 4 000 r/min 离心2 min，弃掉上清液，用0.06 mol/L的NaCl洗1次，重悬于0.9%的生理盐水，倍比稀释2次。再将 0.1 mL 细菌悬液与0.4 mL血清相混合，37 ℃温育2 h，分别于0、2 h取样平板计数。平行2次取平均值，计算培养0、2 h活菌数的对数差值，通过统计学分析，判定菌株的血清抗性强弱[5-6]。
2结果与分析
2.1细菌的活化
试验中58株自然菌在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色带金属光泽的菌落；麦康凯琼脂上为表面光滑湿润中央轻微隆起、边缘整齐菌落；在营养琼脂上形成圆形微凸起、表面光滑湿润、边缘整齐、半透明灰白色菌落；肉汤中培养呈现混浊，轻摇呈絮状物存在，部分菌株可在肉汤表面形成菌环；M-R试验、吲哚试验呈阳性，枸橼酸盐、V-P试验呈阴性，符合大肠杆菌的特征。
2.2菌株血清抗性检测结果
经SPSS软件分析60株菌培养0、2 h活菌数的对数差值，得补体抗性在90%的置信区间为[-2.120 5，-1.538 9]，大于上限（-1.538 9）的即具有血清抗性的共22株，介于上限（-1.538 9）与下限（-2.120 5）之间的即血清抗性处于中间态的共12株，小于下限的即血清敏感菌株共26株（表1）。
2.3菌株致病性试验结果
经SPSS软件分析，60株菌的致死率在90%的置信区间[0.095 5，0.194 5]，大于上限（0.194 5）的共32株菌，即具有高致病性的菌株共32株，在上限（0.194 5）和下限（0.095 5）之间的共13株，即中等致病性菌株的共10株，下限（0.095 5）以下的共有15株，即无致病性/低致病性的菌株共15株（表1）。
由表1可见，60株菌的补体抗性在90%的置信区间为[-2.120 5，-1.538 9]，大于上限的共22株菌，即具有血清抗性的共22株，其Δlg的平均值为-0.319 0，相应菌株的致死率的平均值为34%。在上限（-1.538 9）和下限（-2.120 5）之间的共12株，即血清抗性处于中间态的共12株，其Δlg的平均值为-1.844 7，相应菌株的致死率的平均值为23%。在下限（-2.120 5）的共有26株，即血清敏感的共26株，其Δlg的平均值为-2.870 2，相应菌株的致死率的平均值为18%。结果表明，血清抗性菌株的平均致死率高于血清敏感性菌株的平均致死率。 经SPSS软件分析可知，60株大肠杆菌在血清中的存活能力与其致病力间相关系数为0.259，P=0.046<0.05，即大肠杆菌的补体抗性与其致病力显著相关。
3讨论
试验从健康鸡粪便中分离到60株大肠杆菌，对其中58株自然菌进行分离培养、生化鉴定，均符合大肠杆菌的结构特征，确定58株菌株均为大肠杆菌。致病力试验目前通常采用雏鸡致死试验及鸡胚致死试验，如常新耀等在鸡大肠杆菌的生化特性、致病性及药敏试验研究试验中，对试验组10日龄蛋鸡颈部皮下接种菌株培养物，每羽0.1 mL，对照组腹腔接种相同剂量的灭菌生理盐水[11]；赖平安等在鸡大肠杆菌致病力与某些生物特性的相关性探讨试验中，每一菌株分别 0.5 mL/羽于颈部皮下接种5羽1日龄雏鸡，对照组于颈部皮下接种同等量的灭菌生理盐水[12]；刘静等在中国部分地区禽源性大肠杆菌分离株的致病性试验中，取0.1 mL的LB培养物于静行气管内注射1日龄罗曼商品代蛋公鸡，对照组注射同剂量肉汤[13]，本试验采用尿囊腔注射11日龄SPF鸡胚，对照组注射同剂量生理盐水，结果显示，此方法可分析大肠杆菌致病力。对60株菌株进行致病性试验及血清抗性试验，结果表明，大肠杆菌在血清中的存活能力与其致病力间相关系数为0.259，P=0.046<0.05，即大肠杆菌的补体抗性与其致病力显著相关。王晶钰等在鸡源大肠杆菌某些生物学持性与致病力相关性研究中表明大肠杆菌的致病力与血清型和溶血性无关，而与刚果红表型、盐凝集性和补体抗性呈明显正相关[7]。陈祥等在禽源大肠杆菌的生物表型特性试验中，比较243个禽分离株的血清耐受和致病性的关系中，结果说明血清耐受与致病性呈现一定的规律性，血清耐受与致病力呈良好的相关性[8]。牛明福等在多杀性巴氏杆菌的血清抗性及毒力比较研究中提到一些巴氏杆菌菌株和其他革兰氏阴性菌血清抵抗力与对动物的毒力有关[9]。本试验结果显示，大肠杆菌的补体抗性与其致病力具有相关性。
参考文献：
[1]卡尔尼可. 禽病学[M]. 北京：中国农业出版社，1999：158-171.
[2]陈文静，韩先干，何亮，等. 鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析[J]. 中国动物传染病学报，2010，18（2）：34-40.
[3]王双山，张敬礼，刘庆昌，等. 豫鲁冀接壤地区肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 河南农业大学学报，2004，38（1）：119-122.
[4]杨滴，王耀兵，李冬梅，等. 粪便中大肠埃希菌的分离鉴定[J]. 微生物学杂志，2007，27（3）：1-5.
[5]樊琛，刘桂芹，王宇，等. 鸡源致病性大肠杆菌iss基因原核表达产物的免疫保护作用[J]. 畜牧与兽医，2010，42（11）：84-86.
[6]Johnson T J，Giddings C W，Horne S M，et al. Location of in-creased serum survival gene and selected virulence traits on a conju-gative R plasmid in an avian Escherichia coli isolate[J]. Avian Diseases，2002，46（2）：342-352.
[7]王晶钰，鱼艳荣，张彦明，等. 鸡源大肠杆菌某些生物学特性与致病力相关性研究[J]. 中国家禽，1999，21（11）：10-12.
[8]陈祥，赵李祥，高崧，等. 禽源大肠杆菌的生物表型特性[J]. 中国预防兽医学报，2008，30（10）：770-774.
[9]牛明福，皇甫和平. 多杀性巴氏杆菌的血清抗性及毒力比较研究[J]. 上海畜牧兽医通讯，2003（1）：16-17.
[10]邵华斌，杨峻，黎秋华，等. 湖北省鸡大肠杆菌病流行情况调查及病原分离鉴定[J]. 中国兽医科技，1998，28（9）：14-16.
[11]常新耀，谢红兵，魏刚才，等. 鸡大肠杆菌的生化特性·致病性及药敏试验研究[J]. 安徽农业科学，2008，36（11）：4536-4538.
[12]赖平安，杜春辉.鸡大肠杆菌致病力与某些生物特性的相关性探讨[J]. 中国兽医科技，1992，22（8）：27-30.
[13]刘静，贺生中，陈祥，等. 中国部分地区禽源性大肠杆菌分离株的致病性试验[J]. 江苏农业科学，2012，40（11）：230-231.刘永宏，亚克甫·玉苏普，玉苏普·卡斯木，等. 南疆鸡群感染H9N2亚型AIV诊断分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（11
：303-305.
关键词：鸡；大肠杆菌；致病性；血清补体；抗性
中图分类号： S858.31文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0301-02
收稿日期：2014-11-18
基金项目：国家自然科学基金青年项目（编号：31302128）。
作者简介：李贵萧（1991—），女，山东德州人，主要从事食品营养与卫生方面的研究。
通信作者：樊琛。E-mail：[email protected]。 鸡大肠杆菌病是由大肠杆菌中的某些致病性菌株引起的鸡感染性疾病的总称，是养鸡生产中常见的一种传染病，该病可增加其他病原体感染机会，对养殖及食品安全有较大影响[1-3]。为了解典型大肠杆菌的特性，了解大肠杆菌血清抗性与致病性的关系，对60株菌进行血清补体抗性试验，并结合鸡胚致死率探索鸡大肠杆菌的致病力及其补体抗性的作用。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源BL21、TG1为感受态细菌；SL1、SL3、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7、SD8、SD10、SD11、SD12、SD13、SD14、SD15、SD17、SD18、SD19、SD20、SD21、SD22、SD23、SD24、SD25、SD26、SD27、SD28、SD29、SD30、SD31、SD32、SD33、SD34、SD35，共34株，采自于山东地区健康鸡粪便，聊城大学食品安全教研室保存；cvcc1551、cvcc1553、cvcc1562、cvcc1568、O1、O78，购于中国兽医药品监察所；O2、新大、田大、北京1、北京3、贵州分别为来自北京市、贵州省、黑龙江省3个发病鸡场分离的强毒株，由东北农业大学预防兽医教研室保存；E1、E4、E5、E7、E8、E9、E10、E11、E14、E18、E21、E27从外观健康的不同雏鸡粪便中分离鉴定获得，由东北农业大学预防兽医教研室保存。
1.1.2试剂伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、LB普通营养肉汤培养基、普通营养琼脂、生化试验鉴定管、各种生物化学试剂，均购自青岛海博生物技术有限公司。
1.1.3试验动物11日龄鸡胚购于山东省聊城市阳谷县。
1.2方法
1.2.1细菌的活化挑取活化的菌种接种于伊红美蓝培养基于37 ℃恒温箱培养24 h后，挑取紫黑色带绿色金属光泽的菌落，连续2次接种于麦康凯琼脂平板，继续培养 24 h[4-6]。选纯红色菌落，以无菌操作进行抹片、革兰氏染色镜检，进行IMViC生化鉴定试验，确定后于LB普通营养肉汤进行纯扩增培养24 h[7-11]，记录试验结果，纯培养物置于 4 ℃ 冰箱备用。
1.2.2细菌的致病性试验用接种环挑取平板上的单菌落，在普通营养肉汤中37 ℃摇床培养10～12 h。取1 mL的菌液4 000 r/min离心2 min，弃去上清液，再用生理盐水洗2次，倍比稀释。取0.1 mL稀释液经尿囊腔注射11日龄SPF鸡胚，100～300 CFU/只，每组10只，同时取0.1 mL稀释液涂板，做细菌计数。对照组注射生理盐水，共注射10只。于恒温培养箱37 ℃培养，每日检蛋，记录每日死亡数，至第4天，记录胚胎的死亡率。
1.2.3血清制备无菌操作取鸡血于已灭菌的离心管中，37 ℃ 放置1～2 h，再于4 ℃静置3～4 h，3 000 r/min离心 20 min，取上清液于-20 ℃保存[8-9]。
1.2.4菌株血清抗性检测用接种环挑取平板上的单菌落，在LB液体培养基中37 ℃培养至对数期。取500 μL菌液 4 000 r/min 离心2 min，弃掉上清液，用0.06 mol/L的NaCl洗1次，重悬于0.9%的生理盐水，倍比稀释2次。再将 0.1 mL 细菌悬液与0.4 mL血清相混合，37 ℃温育2 h，分别于0、2 h取样平板计数。平行2次取平均值，计算培养0、2 h活菌数的对数差值，通过统计学分析，判定菌株的血清抗性强弱[5-6]。
2结果与分析
2.1细菌的活化
试验中58株自然菌在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色带金属光泽的菌落；麦康凯琼脂上为表面光滑湿润中央轻微隆起、边缘整齐菌落；在营养琼脂上形成圆形微凸起、表面光滑湿润、边缘整齐、半透明灰白色菌落；肉汤中培养呈现混浊，轻摇呈絮状物存在，部分菌株可在肉汤表面形成菌环；M-R试验、吲哚试验呈阳性，枸橼酸盐、V-P试验呈阴性，符合大肠杆菌的特征。
2.2菌株血清抗性检测结果
经SPSS软件分析60株菌培养0、2 h活菌数的对数差值，得补体抗性在90%的置信区间为[-2.120 5，-1.538 9]，大于上限（-1.538 9）的即具有血清抗性的共22株，介于上限（-1.538 9）与下限（-2.120 5）之间的即血清抗性处于中间态的共12株，小于下限的即血清敏感菌株共26株（表1）。
2.3菌株致病性试验结果
经SPSS软件分析，60株菌的致死率在90%的置信区间[0.095 5，0.194 5]，大于上限（0.194 5）的共32株菌，即具有高致病性的菌株共32株，在上限（0.194 5）和下限（0.095 5）之间的共13株，即中等致病性菌株的共10株，下限（0.095 5）以下的共有15株，即无致病性/低致病性的菌株共15株（表1）。
由表1可见，60株菌的补体抗性在90%的置信区间为[-2.120 5，-1.538 9]，大于上限的共22株菌，即具有血清抗性的共22株，其Δlg的平均值为-0.319 0，相应菌株的致死率的平均值为34%。在上限（-1.538 9）和下限（-2.120 5）之间的共12株，即血清抗性处于中间态的共12株，其Δlg的平均值为-1.844 7，相应菌株的致死率的平均值为23%。在下限（-2.120 5）的共有26株，即血清敏感的共26株，其Δlg的平均值为-2.870 2，相应菌株的致死率的平均值为18%。结果表明，血清抗性菌株的平均致死率高于血清敏感性菌株的平均致死率。 经SPSS软件分析可知，60株大肠杆菌在血清中的存活能力与其致病力间相关系数为0.259，P=0.046<0.05，即大肠杆菌的补体抗性与其致病力显著相关。
3讨论
试验从健康鸡粪便中分离到60株大肠杆菌，对其中58株自然菌进行分离培养、生化鉴定，均符合大肠杆菌的结构特征，确定58株菌株均为大肠杆菌。致病力试验目前通常采用雏鸡致死试验及鸡胚致死试验，如常新耀等在鸡大肠杆菌的生化特性、致病性及药敏试验研究试验中，对试验组10日龄蛋鸡颈部皮下接种菌株培养物，每羽0.1 mL，对照组腹腔接种相同剂量的灭菌生理盐水[11]；赖平安等在鸡大肠杆菌致病力与某些生物特性的相关性探讨试验中，每一菌株分别 0.5 mL/羽于颈部皮下接种5羽1日龄雏鸡，对照组于颈部皮下接种同等量的灭菌生理盐水[12]；刘静等在中国部分地区禽源性大肠杆菌分离株的致病性试验中，取0.1 mL的LB培养物于静行气管内注射1日龄罗曼商品代蛋公鸡，对照组注射同剂量肉汤[13]，本试验采用尿囊腔注射11日龄SPF鸡胚，对照组注射同剂量生理盐水，结果显示，此方法可分析大肠杆菌致病力。对60株菌株进行致病性试验及血清抗性试验，结果表明，大肠杆菌在血清中的存活能力与其致病力间相关系数为0.259，P=0.046<0.05，即大肠杆菌的补体抗性与其致病力显著相关。王晶钰等在鸡源大肠杆菌某些生物学持性与致病力相关性研究中表明大肠杆菌的致病力与血清型和溶血性无关，而与刚果红表型、盐凝集性和补体抗性呈明显正相关[7]。陈祥等在禽源大肠杆菌的生物表型特性试验中，比较243个禽分离株的血清耐受和致病性的关系中，结果说明血清耐受与致病性呈现一定的规律性，血清耐受与致病力呈良好的相关性[8]。牛明福等在多杀性巴氏杆菌的血清抗性及毒力比较研究中提到一些巴氏杆菌菌株和其他革兰氏阴性菌血清抵抗力与对动物的毒力有关[9]。本试验结果显示，大肠杆菌的补体抗性与其致病力具有相关性。
参考文献：
[1]卡尔尼可. 禽病学[M]. 北京：中国农业出版社，1999：158-171.
[2]陈文静，韩先干，何亮，等. 鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析[J]. 中国动物传染病学报，2010，18（2）：34-40.
[3]王双山，张敬礼，刘庆昌，等. 豫鲁冀接壤地区肉鸡大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 河南农业大学学报，2004，38（1）：119-122.
[4]杨滴，王耀兵，李冬梅，等. 粪便中大肠埃希菌的分离鉴定[J]. 微生物学杂志，2007，27（3）：1-5.
[5]樊琛，刘桂芹，王宇，等. 鸡源致病性大肠杆菌iss基因原核表达产物的免疫保护作用[J]. 畜牧与兽医，2010，42（11）：84-86.
[6]Johnson T J，Giddings C W，Horne S M，et al. Location of in-creased serum survival gene and selected virulence traits on a conju-gative R plasmid in an avian Escherichia coli isolate[J]. Avian Diseases，2002，46（2）：342-352.
[7]王晶钰，鱼艳荣，张彦明，等. 鸡源大肠杆菌某些生物学特性与致病力相关性研究[J]. 中国家禽，1999，21（11）：10-12.
[8]陈祥，赵李祥，高崧，等. 禽源大肠杆菌的生物表型特性[J]. 中国预防兽医学报，2008，30（10）：770-774.
[9]牛明福，皇甫和平. 多杀性巴氏杆菌的血清抗性及毒力比较研究[J]. 上海畜牧兽医通讯，2003（1）：16-17.
[10]邵华斌，杨峻，黎秋华，等. 湖北省鸡大肠杆菌病流行情况调查及病原分离鉴定[J]. 中国兽医科技，1998，28（9）：14-16.
[11]常新耀，谢红兵，魏刚才，等. 鸡大肠杆菌的生化特性·致病性及药敏试验研究[J]. 安徽农业科学，2008，36（11）：4536-4538.
[12]赖平安，杜春辉.鸡大肠杆菌致病力与某些生物特性的相关性探讨[J]. 中国兽医科技，1992，22（8）：27-30.
[13]刘静，贺生中，陈祥，等. 中国部分地区禽源性大肠杆菌分离株的致病性试验[J]. 江苏农业科学，2012，40（11）：230-231.刘永宏，亚克甫·玉苏普，玉苏普·卡斯木，等. 南疆鸡群感染H9N2亚型AIV诊断分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（11
：303-305.