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摘 要:目的：探讨慢支咳喘宁胶囊治疗慢性支气管炎(Chronic Bronchitis,CB)的作用机制。方法:大鼠气管内注入脂多糖制造动物模型，放射免疫法测定各组大鼠肺组织中EGF和IL-1β的含量。结果：模型组大鼠肺组织中EGF和IL-1β的含量均较空白组明显升高(P<0.05)；与模型对照组比较，治疗各组肺组织中EGF和IL-1β含量明显降低(P<0.05)。结论：慢支咳喘宁胶囊可降低EGF和IL-1β的含量，减轻炎症反应。
关键词：慢支咳喘宁胶囊；慢性支气管炎；EGF；IL-1β
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2007）24-038-03
1 材料
1.1 动物
SPF级大鼠44只，体重(200±20g),雌雄各半，实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2004-0006，由甘肃中医学院科研实验中心提供。
1.2 试剂盒
EGF放免试剂盒(批号:060102)、IL-1β放免试剂盒(批号:060302)均购自博士得生物工程有限公司。
1.3 药品
慢支咳喘宁胶囊由甘肃中医学院科研实验中心中药制剂实验室提供，每克胶囊含生药5g。临用时，用蒸馏水将咳喘宁胶囊配制成所需浓度的混悬液。蛤蚧定喘胶囊(批号：060728)，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产。
2 方法
2.1 分组
SPF级大鼠44只，随机分为空白对照组、模型对照组、慢支咳喘宁胶囊低剂量组、慢支咳喘宁胶囊中剂量组、慢支咳喘宁胶囊高剂量组、蛤蚧定喘胶囊6组，模型对照组9只，其余各组每组7只。
2.2 造模与给药
大鼠慢性支气管炎(以下简称慢支)模型的制备,参照文献[1，5]改进。除空白对照组外，其余各组用2%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台，常规消毒，纵向切开颈部，分离皮下，暴露气管，4号针头穿刺气管，注入脂多糖(LPS Sigma公司，用生理盐水稀释成200mg/200mL)0.2mL。第8天时，随机选取模型对照组大鼠雌雄各1只,断颈处死，取右肺中部组织在4%甲醛溶液中固定，再经过脱水、浸蜡、包埋等处理后切片,常规HE染色，作成病理切片，光镜下观察。
从造模第8天起，空白对照组，灌服0.9%氯化钠溶液10ml/kg,1次/天；模型对照组，灌服0.9%氯化钠溶液10ml/kg，1次/天；慢支咳喘宁胶囊低剂量组，每日用药剂量0.44g/kg(相当于临床用量5倍)以0.44g/ml的慢支咳喘宁混悬液灌服；慢支咳喘宁胶囊中剂量组，每日用药剂量为0.89g/kg（相当于临床用量10倍）以0.89g/ml的慢支咳喘宁混悬液灌服；慢支咳喘宁胶囊高剂量组，每日用药剂量1.78g/kg(相当于临床用量20倍)以1.78g/ml的慢支咳喘宁混悬液，1次/天灌胃；阳性对照组用蛤蚧定喘胶囊，每日用药剂量1.0g/kg(相当于临床用量20倍)，以1.0g/ml的蛤蚧定喘胶囊混悬液，1次/天灌胃，给药共20天。
2.3 标本制备与检测方法
给药结束后第2天，所有大鼠断头处死，取肺组织，将肺组织用冰生理盐水冲洗，滤纸吸湿后，称取湿重0.3g左右加入预冷的生理盐水，用电动匀浆器制成10%的肺组织匀浆，4℃6000r/min离心5分钟，提取上清液，-20℃冻存待检测。
指标检测采用放射免疫法检测,严格按试剂盒说明书操作。
2.4 统计学处理
数据用均数±标准差(X±s)表示,采用SPSS10.0统计软件进行方差分析。
3 结果
3.1 空白对照组与模型对照组大鼠支气管和肺泡组
织形态学比较
空白对照组：可见细支气管粘膜上皮完整，细胞排列整齐，细支气管壁及肺泡无明显病理形态学改变。
模型对照组：可见支气管纤毛柱状上皮细胞部分脱落，支气管粘膜下肌层局部增生，粘膜层、粘膜下层出现大量以淋巴细胞为主的慢性炎细胞浸润。肺泡上皮细胞部分坏死脱落，肺泡间隔明显增宽，伴有大量慢性炎细胞浸润。
3.2 慢支咳喘宁胶囊对慢性支气管炎大鼠肺组织中
EGF和IL-1β含量的影响
结果显示，模型对照组大鼠肺组织中EGF和IL-1β含量较正常组明显升高(P<0.05)；经治疗用药，治疗各组肺组织EGF和IL-1β含量均低于模型组(P<0.05)；慢支咳喘宁胶囊高剂量组中EGF和IL-1β含量低于慢支咳喘宁胶囊中剂量组(P<0.05)；慢支咳喘宁胶囊中剂量组低于慢支咳喘宁胶囊低剂量组，说明高、中、低剂量间有一定的量效关系；慢支咳喘宁胶囊高剂量组与蛤蚧定喘胶囊组之间无明显统计学差异(P>0.05)。
4 讨论
本实验采用气管内注入脂多糖的方法建立大鼠慢性支气管炎模型。造模后大鼠的全身状态：模型组大鼠出现倦怠，活动减少，毛发逐渐失去光泽，造模后的最初几天，模型组大鼠饮水增加，1周后进食饮水均减少，体重增加较正常组慢。大鼠造模后，可见明显的气道痰鸣音,各治疗组治疗10d后，痰鸣音逐渐减轻；而模型组大鼠气道痰鸣音改变不明显。
光镜下可见模型组大鼠各组支气管有不同程度的慢性炎细胞(淋巴细胞、浆细胞和单核细胞),以及少量中性粒细胞浸润。黏膜上皮细胞严重受损(呈现为纤毛倒伏、粘连),杯状细胞增多,肺泡隔增宽,有炎细胞浸润及毛细血管扩张、充血,肺边缘可见支气管扩张，其组织病理学改变与文献报道相近[6]。
近年的研究结果显示，慢支存在明显的以中性粒细胞为主的慢性气道炎症反应。慢支的气道病理改变正是慢性炎症的表现或结果[1~4]。慢性支气管炎的病理改变主要表现为气管、支气管壁的、慢性炎性细胞浸润，腺体的粘液泡增生、肥大，浆液型及混合型腺泡发生粘液变，腺泡及导管因粘液潴留而扩张，粘液上皮的杯细胞增生，分泌亢进。如果慢支反复急性发作，则会逐渐出现气管壁增厚，支气管软骨破坏，病变继续向细支气管、肺泡蔓延[5]。而慢支气道的这些病理变化与慢性气道炎症关系密切，通过慢支咳喘宁胶囊治疗后，病理改变明显改善。
LPS是革兰阴性菌细胞壁层结构，它可刺激单核细胞、内皮细胞及中性粒细胞等合成释放一系列炎性介质如（TNFa、IL-1β），介导气道及肺组织的炎症反应。
IL-1β通过促进趋化因子、环化加氧酶-2（cox-2）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和细胞黏附分子的表达而引起炎症反应；可诱导血管内皮细胞合成黏附分子（ICAM-1）增加；还可激活白细胞表面的黏附分子，使其表达上调。并与内皮细胞上相应的黏附分子相互作用，导致白细胞快速黏附，并跨过内皮转移到炎症部位参与炎症反应。
表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是一种含53个氨基酸的单链多肽类生长因子，最初因其能刺激表皮的生长和角化而得名，EGF作为一种生长因子对上皮细胞以及许多其它细胞有促进分裂作用。对细胞代谢，EGF具有短期和长期作用。EGF与靶细胞上特异性的EGFR结合能激动并维持一系列与细胞生长、增殖、转化等有关的生化过程。在炎症反应及变态反应中具有重要的调节作用。研究表明,慢性支气管炎患者肺组织中EGF的含量增高,且与病情轻重程度相关。
研究结果显示,模型对照组大鼠肺组织中EGF和IL-1β含量较空白对照组均明显升高，表明EGF和IL-1β的表达在慢性支气管炎发病中起重要作用，EGF和IL-1β的过多释放介导了慢性支气管炎的呼吸道损伤过程。治疗各组肺组织中EGF和IL-1β含量均低于模型对照组，说明慢支咳喘宁胶囊及蛤蚧定喘胶囊均能通过降低EGF和IL-1β的含量以减少炎性细胞的趋化和炎性因子的释放，进而控制慢性支气管炎的发展。
综上所述，经动物实验证实，EGF和IL-1β对慢性支气管炎的形成和发展过程产生重要影响,慢支咳喘宁胶囊可有效抑制EGF和IL-1β的生成，控制慢性炎症反应。本实验的结果为研制治疗慢支等气道炎症性疾病有效中药复方制剂提供了一定的实验依据。慢性支气管炎属于中医咳嗽、痰饮、喘证的范畴。其病因病机与外邪入侵和内伤有关，病位主要在肺，但与脾、肾的关系也十分密切。病机以本虚标实为特点，本虚多为肺、脾、肾三脏虚损,标实多为气滞、痰凝、血瘀互结，导致病情缠绵不愈，最终形成慢性虚性病理损害。慢支咳喘宁胶囊以烈香杜鹃为君药,以止咳、祛痰、平喘；以黄芩、浙贝、百部为臣药,黄芩苦寒，善清肺热，浙贝苦寒，既可化痰止咳，又可清肺热，百部甘苦，长于润肺止咳，三药相伍，既可清肺，又可润肺，配合君药,共奏止咳、祛痰、平喘之功。脾为生痰之源,肺为储痰之器，肺病日久，内有郁结之痰，复感外邪,肺气郁闭，血行无力，积而为瘀，以致痰瘀互结，故佐以莪术以行气破血祛瘀，肾阳为一身阳气之根本，肺之宣降有赖于肾阳的推动，且肾主纳气，故佐以淫羊藿以补肾壮阳，纳气平喘。诸药配伍，共成清热化痰，润肺止咳平喘之剂。
参考文献：
［1］ Hill AT, Bayley DL, Campbell EJ, et al. Airways inflammation in chronic bronchitis: the effects of smoking and alpha1-anti-Trypsin deficiency［J］. Eur Respir J, 2000,15(5):886-890.
［2］ 马楠,崔德健,梁延杰.气管内注入脂多糖建立大鼠慢性支气管炎模型［J］.中华结核和呼吸杂志,1999,22(6):371-372.
［3］ 马楠,崔德健,黎君.慢性支气管炎大鼠肿瘤坏死因子a巨噬细胞炎症蛋白-2及髓过氧化物酶的研究［J］.中华内科杂志,1999,38(8):523-526.
［4］ Thurlbeck WM. Pathophysiology of chronic obstructive pulmo2 Nary disease［J］.Clin Chest Med,1990,11(3):389-403.
［5］ 唐光华, 黄启福, 姜良铎.艾麻口服液对慢性支气管炎大鼠支气管TNFa ICAM-1蛋白及mRNA表达的影响［J］.中国病理生理杂志,2002,18(7):834-836.
［6］ 任勃,陶庆丰,马淑扬.慢性支气管炎动物模型的复制及病理形态学观察［J］.天津医药,1995,23(2):102-103.
关键词：慢支咳喘宁胶囊；慢性支气管炎；EGF；IL-1β
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-2197（2007）24-038-03
1 材料
1.1 动物
SPF级大鼠44只，体重(200±20g),雌雄各半，实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2004-0006，由甘肃中医学院科研实验中心提供。
1.2 试剂盒
EGF放免试剂盒(批号:060102)、IL-1β放免试剂盒(批号:060302)均购自博士得生物工程有限公司。
1.3 药品
慢支咳喘宁胶囊由甘肃中医学院科研实验中心中药制剂实验室提供，每克胶囊含生药5g。临用时，用蒸馏水将咳喘宁胶囊配制成所需浓度的混悬液。蛤蚧定喘胶囊(批号：060728)，北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂生产。
2 方法
2.1 分组
SPF级大鼠44只，随机分为空白对照组、模型对照组、慢支咳喘宁胶囊低剂量组、慢支咳喘宁胶囊中剂量组、慢支咳喘宁胶囊高剂量组、蛤蚧定喘胶囊6组，模型对照组9只，其余各组每组7只。
2.2 造模与给药
大鼠慢性支气管炎(以下简称慢支)模型的制备,参照文献[1，5]改进。除空白对照组外，其余各组用2%戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于操作台，常规消毒，纵向切开颈部，分离皮下，暴露气管，4号针头穿刺气管，注入脂多糖(LPS Sigma公司，用生理盐水稀释成200mg/200mL)0.2mL。第8天时，随机选取模型对照组大鼠雌雄各1只,断颈处死，取右肺中部组织在4%甲醛溶液中固定，再经过脱水、浸蜡、包埋等处理后切片,常规HE染色，作成病理切片，光镜下观察。
从造模第8天起，空白对照组，灌服0.9%氯化钠溶液10ml/kg,1次/天；模型对照组，灌服0.9%氯化钠溶液10ml/kg，1次/天；慢支咳喘宁胶囊低剂量组，每日用药剂量0.44g/kg(相当于临床用量5倍)以0.44g/ml的慢支咳喘宁混悬液灌服；慢支咳喘宁胶囊中剂量组，每日用药剂量为0.89g/kg（相当于临床用量10倍）以0.89g/ml的慢支咳喘宁混悬液灌服；慢支咳喘宁胶囊高剂量组，每日用药剂量1.78g/kg(相当于临床用量20倍)以1.78g/ml的慢支咳喘宁混悬液，1次/天灌胃；阳性对照组用蛤蚧定喘胶囊，每日用药剂量1.0g/kg(相当于临床用量20倍)，以1.0g/ml的蛤蚧定喘胶囊混悬液，1次/天灌胃，给药共20天。
2.3 标本制备与检测方法
给药结束后第2天，所有大鼠断头处死，取肺组织，将肺组织用冰生理盐水冲洗，滤纸吸湿后，称取湿重0.3g左右加入预冷的生理盐水，用电动匀浆器制成10%的肺组织匀浆，4℃6000r/min离心5分钟，提取上清液，-20℃冻存待检测。
指标检测采用放射免疫法检测,严格按试剂盒说明书操作。
2.4 统计学处理
数据用均数±标准差(X±s)表示,采用SPSS10.0统计软件进行方差分析。
3 结果
3.1 空白对照组与模型对照组大鼠支气管和肺泡组
织形态学比较
空白对照组：可见细支气管粘膜上皮完整，细胞排列整齐，细支气管壁及肺泡无明显病理形态学改变。
模型对照组：可见支气管纤毛柱状上皮细胞部分脱落，支气管粘膜下肌层局部增生，粘膜层、粘膜下层出现大量以淋巴细胞为主的慢性炎细胞浸润。肺泡上皮细胞部分坏死脱落，肺泡间隔明显增宽，伴有大量慢性炎细胞浸润。
3.2 慢支咳喘宁胶囊对慢性支气管炎大鼠肺组织中
EGF和IL-1β含量的影响
结果显示，模型对照组大鼠肺组织中EGF和IL-1β含量较正常组明显升高(P<0.05)；经治疗用药，治疗各组肺组织EGF和IL-1β含量均低于模型组(P<0.05)；慢支咳喘宁胶囊高剂量组中EGF和IL-1β含量低于慢支咳喘宁胶囊中剂量组(P<0.05)；慢支咳喘宁胶囊中剂量组低于慢支咳喘宁胶囊低剂量组，说明高、中、低剂量间有一定的量效关系；慢支咳喘宁胶囊高剂量组与蛤蚧定喘胶囊组之间无明显统计学差异(P>0.05)。
4 讨论
本实验采用气管内注入脂多糖的方法建立大鼠慢性支气管炎模型。造模后大鼠的全身状态：模型组大鼠出现倦怠，活动减少，毛发逐渐失去光泽，造模后的最初几天，模型组大鼠饮水增加，1周后进食饮水均减少，体重增加较正常组慢。大鼠造模后，可见明显的气道痰鸣音,各治疗组治疗10d后，痰鸣音逐渐减轻；而模型组大鼠气道痰鸣音改变不明显。
光镜下可见模型组大鼠各组支气管有不同程度的慢性炎细胞(淋巴细胞、浆细胞和单核细胞),以及少量中性粒细胞浸润。黏膜上皮细胞严重受损(呈现为纤毛倒伏、粘连),杯状细胞增多,肺泡隔增宽,有炎细胞浸润及毛细血管扩张、充血,肺边缘可见支气管扩张，其组织病理学改变与文献报道相近[6]。
近年的研究结果显示，慢支存在明显的以中性粒细胞为主的慢性气道炎症反应。慢支的气道病理改变正是慢性炎症的表现或结果[1~4]。慢性支气管炎的病理改变主要表现为气管、支气管壁的、慢性炎性细胞浸润，腺体的粘液泡增生、肥大，浆液型及混合型腺泡发生粘液变，腺泡及导管因粘液潴留而扩张，粘液上皮的杯细胞增生，分泌亢进。如果慢支反复急性发作，则会逐渐出现气管壁增厚，支气管软骨破坏，病变继续向细支气管、肺泡蔓延[5]。而慢支气道的这些病理变化与慢性气道炎症关系密切，通过慢支咳喘宁胶囊治疗后，病理改变明显改善。
LPS是革兰阴性菌细胞壁层结构，它可刺激单核细胞、内皮细胞及中性粒细胞等合成释放一系列炎性介质如（TNFa、IL-1β），介导气道及肺组织的炎症反应。
IL-1β通过促进趋化因子、环化加氧酶-2（cox-2）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和细胞黏附分子的表达而引起炎症反应；可诱导血管内皮细胞合成黏附分子（ICAM-1）增加；还可激活白细胞表面的黏附分子，使其表达上调。并与内皮细胞上相应的黏附分子相互作用，导致白细胞快速黏附，并跨过内皮转移到炎症部位参与炎症反应。
表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)是一种含53个氨基酸的单链多肽类生长因子，最初因其能刺激表皮的生长和角化而得名，EGF作为一种生长因子对上皮细胞以及许多其它细胞有促进分裂作用。对细胞代谢，EGF具有短期和长期作用。EGF与靶细胞上特异性的EGFR结合能激动并维持一系列与细胞生长、增殖、转化等有关的生化过程。在炎症反应及变态反应中具有重要的调节作用。研究表明,慢性支气管炎患者肺组织中EGF的含量增高,且与病情轻重程度相关。
研究结果显示,模型对照组大鼠肺组织中EGF和IL-1β含量较空白对照组均明显升高，表明EGF和IL-1β的表达在慢性支气管炎发病中起重要作用，EGF和IL-1β的过多释放介导了慢性支气管炎的呼吸道损伤过程。治疗各组肺组织中EGF和IL-1β含量均低于模型对照组，说明慢支咳喘宁胶囊及蛤蚧定喘胶囊均能通过降低EGF和IL-1β的含量以减少炎性细胞的趋化和炎性因子的释放，进而控制慢性支气管炎的发展。
综上所述，经动物实验证实，EGF和IL-1β对慢性支气管炎的形成和发展过程产生重要影响,慢支咳喘宁胶囊可有效抑制EGF和IL-1β的生成，控制慢性炎症反应。本实验的结果为研制治疗慢支等气道炎症性疾病有效中药复方制剂提供了一定的实验依据。慢性支气管炎属于中医咳嗽、痰饮、喘证的范畴。其病因病机与外邪入侵和内伤有关，病位主要在肺，但与脾、肾的关系也十分密切。病机以本虚标实为特点，本虚多为肺、脾、肾三脏虚损,标实多为气滞、痰凝、血瘀互结，导致病情缠绵不愈，最终形成慢性虚性病理损害。慢支咳喘宁胶囊以烈香杜鹃为君药,以止咳、祛痰、平喘；以黄芩、浙贝、百部为臣药,黄芩苦寒，善清肺热，浙贝苦寒，既可化痰止咳，又可清肺热，百部甘苦，长于润肺止咳，三药相伍，既可清肺，又可润肺，配合君药,共奏止咳、祛痰、平喘之功。脾为生痰之源,肺为储痰之器，肺病日久，内有郁结之痰，复感外邪,肺气郁闭，血行无力，积而为瘀，以致痰瘀互结，故佐以莪术以行气破血祛瘀，肾阳为一身阳气之根本，肺之宣降有赖于肾阳的推动，且肾主纳气，故佐以淫羊藿以补肾壮阳，纳气平喘。诸药配伍，共成清热化痰，润肺止咳平喘之剂。
参考文献：
［1］ Hill AT, Bayley DL, Campbell EJ, et al. Airways inflammation in chronic bronchitis: the effects of smoking and alpha1-anti-Trypsin deficiency［J］. Eur Respir J, 2000,15(5):886-890.
［2］ 马楠,崔德健,梁延杰.气管内注入脂多糖建立大鼠慢性支气管炎模型［J］.中华结核和呼吸杂志,1999,22(6):371-372.
［3］ 马楠,崔德健,黎君.慢性支气管炎大鼠肿瘤坏死因子a巨噬细胞炎症蛋白-2及髓过氧化物酶的研究［J］.中华内科杂志,1999,38(8):523-526.
［4］ Thurlbeck WM. Pathophysiology of chronic obstructive pulmo2 Nary disease［J］.Clin Chest Med,1990,11(3):389-403.
［5］ 唐光华, 黄启福, 姜良铎.艾麻口服液对慢性支气管炎大鼠支气管TNFa ICAM-1蛋白及mRNA表达的影响［J］.中国病理生理杂志,2002,18(7):834-836.
［6］ 任勃,陶庆丰,马淑扬.慢性支气管炎动物模型的复制及病理形态学观察［J］.天津医药,1995,23(2):102-103.