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摘要 开展了狐狸脑炎活疫苗免疫效力试验，确定最小免疫剂量为1.0 mL（103.5TCID50/mL），免疫剂量1.0 mL（104.5TCID50/mL），免疫后180 d用强毒攻击均获得了100%保护，-20 ℃保存期为180 d。
关键词 狐狸脑炎；活疫苗；免疫效力
中图分类号 S858.315.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）05-0288-01
Abstract Test of protective efficacy of live vaccine of fox encephalitis was done in this study.The results showed that the minimum immune dose was 1.0 ml（103.5TCID50/mL），the immunizing dose was 1.0 mL（104.5TCID50/mL），and immunity period was up to 180 days.The live vaccine could induce completely protection in foxes against lethal challenge with virulent strain.The shelf life of vaccine was 180 days at -20 ℃.
Key words fox encephalitis；live vaccine；protective efficacy
我国狐狸饲养业发展迅速，目前全国养殖量约为1 500万只，分布在北方12个省市。通过对分离鉴定的我国流行狐狸腺病毒毒株的驯化致弱，获得了CAV-2C弱毒株，适合于中国狐狸腺病毒流行株特点的疫苗毒株，首次筛选和优化出狐狸脑炎活疫苗制苗毒种。采用犬肾传代细胞（MDCK）培养犬腺病毒Ⅱ型CAV-2C弱毒株，成功地研制出狐狸脑炎活疫苗。本项研究重点开展了狐狸脑炎活疫苗最小免疫剂量、免疫剂量和效力试验、免疫期和保存期试验，以及临床应用试验，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 狐狸脑炎活疫苗最小免疫剂量试验
应用不同稀释度的狐狸脑炎活疫苗免疫断乳21 d未接种任何疫苗的健康北极狐，同时设对照组5只。
1.2 狐狸脑炎活疫苗免疫剂量和效力试验
取狐狸脑炎活疫苗批号为201401、201402、201403等3批，疫苗效价为104.5～5.0TCID50/mL，免疫断乳21 d未接种任何疫苗的健康北极狐，每批疫苗免疫狐5只，每只1.0 mL，免疫后21 d用100个ID50 CAV-1株强毒攻击，同时设对照组5只，观察30 d[1-3]。
1.3 狐狸脑炎活疫苗免疫期试验
选断乳21 d未接种任何疫苗的健康北极狐50只，用批号为201401、201402、201403等3批狐狸脑炎活疫苗分别免疫10只，每只接种1.0 mL，分别在免疫后7、21、60、180 d采血分离血清，测定CAV抗体情况，CAV抗体测定采用中和试验方法，免疫180 d后，进行攻毒试验，随机选取每批疫苗免疫狐5只，用100个ID50 CAV1株强毒攻击，同时设对照组5只，观察30 d[4-6]。
1.4 狐狸脑炎活疫苗保存期试验
取批号为201401、201402、201403等3批狐貍脑炎活疫苗，对分别在室温条件下保存1～5 d，在4 ℃条件下保存7～21 d，在-20 ℃条件下保存30～180 d，然后进行效价测定，确定疫苗保存期。每批疫苗应用MDCK细胞做狐狸脑炎活疫苗效价测定。
1.5 狐狸脑炎活疫苗田间试验
对3批狐狸脑炎活疫苗免疫的养狐场，进行了安全性检验均合格，并分别在接种后3个月和6个月随机选300只狐狸采血做抗体检测。
2 结果与分析
2.1 狐狸脑炎活疫苗最小免疫剂量试验
免疫狐狸分别在第7天开始产生抗体，14 d与21 d抗体效价基本相同，不同稀释度疫苗产生的抗体效价不同，结果见表1。
试验结果表明，10-1倍稀释1.0 mL剂量在7 d产生抗体，14 d效价达到1∶16以上，而10-3倍稀释1.0 mL剂量仅为1∶8。免疫21 d后用100个ID50犬腺病毒CAV1株强毒攻击，10-1倍稀释1.0 mL剂量获得100%保护，而10-2倍稀释1.0 mL剂量未获得全部保护，对照组全部发病，出现典型的脑炎症状，根据试验结果，确定狐狸脑炎活疫苗最小免疫剂量为10-1倍稀释1.0 mL，即103.5TCID50/mL。
2.2 狐狸脑炎活疫苗免疫剂量和效力试验
疫苗效价为104.5～5.0TCID50/mL，接种剂量为1.0 mL，免疫后21 d经强毒攻击可获得100%保护，结果表明，狐狸脑炎活疫苗免疫剂量为1.0 mL，免疫动物产生了很好的免疫力，证明该疫苗的免疫原性好，安全可靠，免疫效果好（表2）。
2.3 狐狸脑炎活疫苗免疫期试验
狐狸脑炎活疫苗免疫180 d攻毒试验结果见表3。可以看出，3批狐狸脑炎活疫苗免疫180 d后，用强毒攻击均获得了100%保护，结果表明狐狸脑炎活疫苗免疫期180 d。
2.4 狐狸脑炎活疫苗保存期试验
室温15～20 ℃条件下保存3 d，效价保持不变，5 d效价下降101.0 个滴度。4 ℃冰箱条件下保存14 d，效价保持不变，保存21 d，每批狐狸脑炎活疫苗效价都有所下降，效价下降最多为101.0个滴度。-20 ℃条件下保存，120 d时测定狐狸脑炎活疫苗效价均未发生变化。180 d时测定狐狸脑炎活疫苗效价也未发生变化。根据试验结果，确定狐狸脑炎活疫苗-20 ℃的保存期为180 d（表4）。
2.5 狐狸脑炎活疫苗田间试验
结果表明，在3个月CAV抗体阳转率为100%。6个月CAV抗体阳转率为98%，抗体效价在1∶64以上达98%，以上结果表明，该狐狸脑炎活疫苗免疫后6个月临床保护率为98%。
3 结论与讨论
狐狸脑炎活疫苗（CAV-2C株）免疫效力试验结果表明，最小免疫剂量为1.0 mL（103.5TCID50/mL），免疫剂量1.0 mL（104.5TCID50/mL），免疫后180 d用强毒攻击均获得了100%保护，-20 ℃保存期为180 d。
狐狸脑炎活疫苗应用于吉林、辽宁等地养狐场，用于预防免疫接种，未发生狐狸脑炎，免疫效果良好，安全可靠，具有广阔的应用前景。
4 参考文献
[1] 俞永新.流行性乙型脑炎减毒活疫苗的发展和应用[J].上海预防医学杂志，2006（3）：110-112.
[2] 许树林，洪运太，李雁冰，等.狐狸脑炎病毒细胞培养灭活疫苗的研究[J].黑龙江畜牧兽医，1994（9）：10-12.
[3] 柴秀丽，闫喜军，姜莉莉，等.狐狸传染性脑炎中和试验监测方法的建立和应用[J].特产研究，2006（4）：8-10.
[4]闫喜军，姜莉莉，柴秀丽，等.狐传染性脑炎活疫苗抗体消长规律的研究[J].经济动物学报，2006（2）：70-72.
[5] 程世鹏，杨汉春，吴威，等.狐犬瘟热、细小病毒性肠炎和脑炎三联活疫苗免疫效力试验[J].中国兽医杂志，2008，43（8）：28-29.
[6] 张艳英，王晓珊，吴楠，等.狐狸脑炎活疫苗的免疫效果监测[C]//青岛：中国毛皮动物科学研究进展：2014年全国毛皮动物专业学术研讨会.中国毛皮动物科学研究进展：2014年全国毛皮动物专业学术研讨会论文集，2014：81-86.
关键词 狐狸脑炎；活疫苗；免疫效力
中图分类号 S858.315.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）05-0288-01
Abstract Test of protective efficacy of live vaccine of fox encephalitis was done in this study.The results showed that the minimum immune dose was 1.0 ml（103.5TCID50/mL），the immunizing dose was 1.0 mL（104.5TCID50/mL），and immunity period was up to 180 days.The live vaccine could induce completely protection in foxes against lethal challenge with virulent strain.The shelf life of vaccine was 180 days at -20 ℃.
Key words fox encephalitis；live vaccine；protective efficacy
我国狐狸饲养业发展迅速，目前全国养殖量约为1 500万只，分布在北方12个省市。通过对分离鉴定的我国流行狐狸腺病毒毒株的驯化致弱，获得了CAV-2C弱毒株，适合于中国狐狸腺病毒流行株特点的疫苗毒株，首次筛选和优化出狐狸脑炎活疫苗制苗毒种。采用犬肾传代细胞（MDCK）培养犬腺病毒Ⅱ型CAV-2C弱毒株，成功地研制出狐狸脑炎活疫苗。本项研究重点开展了狐狸脑炎活疫苗最小免疫剂量、免疫剂量和效力试验、免疫期和保存期试验，以及临床应用试验，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 狐狸脑炎活疫苗最小免疫剂量试验
应用不同稀释度的狐狸脑炎活疫苗免疫断乳21 d未接种任何疫苗的健康北极狐，同时设对照组5只。
1.2 狐狸脑炎活疫苗免疫剂量和效力试验
取狐狸脑炎活疫苗批号为201401、201402、201403等3批，疫苗效价为104.5～5.0TCID50/mL，免疫断乳21 d未接种任何疫苗的健康北极狐，每批疫苗免疫狐5只，每只1.0 mL，免疫后21 d用100个ID50 CAV-1株强毒攻击，同时设对照组5只，观察30 d[1-3]。
1.3 狐狸脑炎活疫苗免疫期试验
选断乳21 d未接种任何疫苗的健康北极狐50只，用批号为201401、201402、201403等3批狐狸脑炎活疫苗分别免疫10只，每只接种1.0 mL，分别在免疫后7、21、60、180 d采血分离血清，测定CAV抗体情况，CAV抗体测定采用中和试验方法，免疫180 d后，进行攻毒试验，随机选取每批疫苗免疫狐5只，用100个ID50 CAV1株强毒攻击，同时设对照组5只，观察30 d[4-6]。
1.4 狐狸脑炎活疫苗保存期试验
取批号为201401、201402、201403等3批狐貍脑炎活疫苗，对分别在室温条件下保存1～5 d，在4 ℃条件下保存7～21 d，在-20 ℃条件下保存30～180 d，然后进行效价测定，确定疫苗保存期。每批疫苗应用MDCK细胞做狐狸脑炎活疫苗效价测定。
1.5 狐狸脑炎活疫苗田间试验
对3批狐狸脑炎活疫苗免疫的养狐场，进行了安全性检验均合格，并分别在接种后3个月和6个月随机选300只狐狸采血做抗体检测。
2 结果与分析
2.1 狐狸脑炎活疫苗最小免疫剂量试验
免疫狐狸分别在第7天开始产生抗体，14 d与21 d抗体效价基本相同，不同稀释度疫苗产生的抗体效价不同，结果见表1。
试验结果表明，10-1倍稀释1.0 mL剂量在7 d产生抗体，14 d效价达到1∶16以上，而10-3倍稀释1.0 mL剂量仅为1∶8。免疫21 d后用100个ID50犬腺病毒CAV1株强毒攻击，10-1倍稀释1.0 mL剂量获得100%保护，而10-2倍稀释1.0 mL剂量未获得全部保护，对照组全部发病，出现典型的脑炎症状，根据试验结果，确定狐狸脑炎活疫苗最小免疫剂量为10-1倍稀释1.0 mL，即103.5TCID50/mL。
2.2 狐狸脑炎活疫苗免疫剂量和效力试验
疫苗效价为104.5～5.0TCID50/mL，接种剂量为1.0 mL，免疫后21 d经强毒攻击可获得100%保护，结果表明，狐狸脑炎活疫苗免疫剂量为1.0 mL，免疫动物产生了很好的免疫力，证明该疫苗的免疫原性好，安全可靠，免疫效果好（表2）。
2.3 狐狸脑炎活疫苗免疫期试验
狐狸脑炎活疫苗免疫180 d攻毒试验结果见表3。可以看出，3批狐狸脑炎活疫苗免疫180 d后，用强毒攻击均获得了100%保护，结果表明狐狸脑炎活疫苗免疫期180 d。
2.4 狐狸脑炎活疫苗保存期试验
室温15～20 ℃条件下保存3 d，效价保持不变，5 d效价下降101.0 个滴度。4 ℃冰箱条件下保存14 d，效价保持不变，保存21 d，每批狐狸脑炎活疫苗效价都有所下降，效价下降最多为101.0个滴度。-20 ℃条件下保存，120 d时测定狐狸脑炎活疫苗效价均未发生变化。180 d时测定狐狸脑炎活疫苗效价也未发生变化。根据试验结果，确定狐狸脑炎活疫苗-20 ℃的保存期为180 d（表4）。
2.5 狐狸脑炎活疫苗田间试验
结果表明，在3个月CAV抗体阳转率为100%。6个月CAV抗体阳转率为98%，抗体效价在1∶64以上达98%，以上结果表明，该狐狸脑炎活疫苗免疫后6个月临床保护率为98%。
3 结论与讨论
狐狸脑炎活疫苗（CAV-2C株）免疫效力试验结果表明，最小免疫剂量为1.0 mL（103.5TCID50/mL），免疫剂量1.0 mL（104.5TCID50/mL），免疫后180 d用强毒攻击均获得了100%保护，-20 ℃保存期为180 d。
狐狸脑炎活疫苗应用于吉林、辽宁等地养狐场，用于预防免疫接种，未发生狐狸脑炎，免疫效果良好，安全可靠，具有广阔的应用前景。
4 参考文献
[1] 俞永新.流行性乙型脑炎减毒活疫苗的发展和应用[J].上海预防医学杂志，2006（3）：110-112.
[2] 许树林，洪运太，李雁冰，等.狐狸脑炎病毒细胞培养灭活疫苗的研究[J].黑龙江畜牧兽医，1994（9）：10-12.
[3] 柴秀丽，闫喜军，姜莉莉，等.狐狸传染性脑炎中和试验监测方法的建立和应用[J].特产研究，2006（4）：8-10.
[4]闫喜军，姜莉莉，柴秀丽，等.狐传染性脑炎活疫苗抗体消长规律的研究[J].经济动物学报，2006（2）：70-72.
[5] 程世鹏，杨汉春，吴威，等.狐犬瘟热、细小病毒性肠炎和脑炎三联活疫苗免疫效力试验[J].中国兽医杂志，2008，43（8）：28-29.
[6] 张艳英，王晓珊，吴楠，等.狐狸脑炎活疫苗的免疫效果监测[C]//青岛：中国毛皮动物科学研究进展：2014年全国毛皮动物专业学术研讨会.中国毛皮动物科学研究进展：2014年全国毛皮动物专业学术研讨会论文集，2014：81-86.