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摘要 目的：探討丹七片对缺血性心脏病大鼠模型能量代谢的调节作用。方法：通过结扎左前降支冠状动脉建立缺血性心脏大鼠模型，将48只大鼠分为假手术组、模型组、丹七片组和曲美他嗪组，每组12只。丹七片组大鼠以500.0 mg/kg的剂量灌胃丹七片溶液，曲美他嗪组大鼠以6.0 mg/kg的剂量灌胃曲美他嗪溶液，其他组大鼠灌胃生理盐水。治疗1个月后评价各组大鼠的心脏功能、心肌组织和细胞病理改变、心肌ATP水平及AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路及其下游分子表达水平。结果：超声心动图显示，与模型组比较，丹七片组大鼠的LVIDs和LVIDd分别减少了26.35%和20.73%，而EF和FS分别增加了31.61%和42.82%，差异有统计学意义（P<0.05）。HE染色结果显示，丹七片组的心肌细胞排列较为整齐，细胞水肿减轻，细胞间隙减小，炎性细胞减少。与模型组比较，丹七片组大鼠的心肌ATP水平显著增加（P<0.05）。免疫组织化学染色结果显示，与模型组比较，丹七片组大鼠PGC-1α的阳性染色评分显著升高（P<0.05）。Western Blotting结果显示，与模型组比较，丹七片组大鼠的AMPK、SIRT1、PGC-1α、MFN1、MFN2和SOD2蛋白表达均显著升高（P<0.05）。结论：丹七片可以在缺血性心脏病大鼠模型中发挥心脏保护功能，并上调ATP的产生。丹七片可激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路及其下游分子，改善能量代谢并还调节线粒体的生物合成，从而改善大鼠心脏功能并防止心肌损伤。
关键词 丹七片;缺血性心脏病;能量代谢;线粒体;心肌损伤;三磷酸腺苷;AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路
Regulatory Effect of Danqi Tablet on Energy Metabolism in a Rat Model of Ischemic Heart Disease
LIU Hui，LIU Jing，LIU Cong，DANG Jingyi，WANG Haiyan
（Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital，Air Force Medical University
of People′s Liberation Army of China，Xi′an 710032，China）
Abstract Objective：To investigate the regulation of energy metabolism with Danqi Tablet in a rat model of ischemic heart disease.Methods：A rat model of ischemic heart was established by ligation of the left anterior descending coronary artery.A total of 48 rats were divided into a sham an operation group，a Danqi tablet group and trimetazidine group，with 12 rats in each group.Rats in the Danqi Tablets were given a solution of Danqi Tablets at a dose of 500.0 mg/kg.Rats in the trimetazidine group were given a solution of trimetazidine at a dose of 6.0 mg/kg.The other groups were given normal saline.After 1 month of treatment，cardiac function，myocardial tissue cytopathological changes，myocardial ATP levels，and AMPK/SIRT1/PGC-1α signaling pathway and downstream molecular expression were evaluated.Results：Echocardiography showed that compared with the model group，LVIDs and LVIDd in the Danqi tablet group were reduced by 26.35% and 20.73%，while EF and FS increased by 31.61% and 42.82%，and the difference was significant（P<0.05）.The results of HE staining showed that the cardiomyocytes in the Danqi tablet group were arranged neatly，the cell edema was reduced，the cell gap was reduced，and the inflammatory cells were decreased.Compared with the model group，the myocardial ATP level of the Danqi tablet group increased significantly（P<0.05）.Immunohistochemical staining showed that the PGC-1α positive staining score of rats in the Danqipian group was significantly higher than that of the model group（P<0.05）.Western Blotting showed that the expression levels of AMPK，SIRT1，PGC-1α，MFN1，MFN2 and SOD2 were significantly increased in the Danqi Tablets group compared with the model group（P<0.05）.Conclusion：Danqi Tablet can play a cardioprotective function in the rat model of ischemic heart disease and up-regulate ATP production.Danqi Tablets activate the AMPK/SIRT1/PGC-1α signaling pathway and its downstream molecules，improve energy metabolism and also regulate mitochondrial biogenesis，thereby improving rat cardiac function and preventing myocardial damage. Keywords Danqi tablets; Ischemic heart disease; Energy metabolism; Mitochondrial; Myocardial damage; ATP; AMPK/SIRT1/PGC-1α signaling pathway
中图分类号：R289.5;R542文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.019
心血管疾病是世界范围内引起人类死亡的主要疾病类型，而急性缺血诱发的心肌梗死又是心血管疾病患者死亡的主要原因之一[1-3]。心肌细胞的收缩需要三磷酸腺苷（ATP）持续提供能量。在缺血条件下，由于氧气和营养供应不足，心肌能量代谢会受到干扰[4-5]。因此，能量代谢的调节是提高心肌梗死治疗效果的关键途径。
心肌细胞所需的大部分能量是通过氧化磷酸化在线粒体内产生的。线粒体的动态平衡和能量代谢受到多种因子调节。几个转录因子在代谢相关基因的转录中起关键作用。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅激活因子-1α（Peroxlsome Proliferator-activated Receptor Gamma Coactivator-1α，PGC-1α）是控制能量代谢的主要转录调节因子[6]。PGC-1α调节多种过程，包括线粒体的生物合成、呼吸作用、糖异生作用和氧化磷酸化等[7]。然而，目前对PGC-1α活性的调节机制尚待完全了解。最近的研究表明，AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）和Sirtuin 1（SIRT1）在代谢调节中起主要作用，并影响PGC-1α转录调控能量代谢[8-9]。AMPK是主要的代谢能量传感器之一，能量不足时，AMP/ATP比值增加，AMPK被激活并增强与葡萄糖转运、糖酵解和线粒体呼吸有关的基因表达[10]。AMPK还可以通过增加细胞中NAD+水平来增强NAD+依赖性脱乙酰基酶SIRT1的活性[11]。此外，AMPK的激活会导致PGC-1α的表达增加。SIRT1是哺乳动物的沉默调节蛋白之一，其参与调节能量代谢、细胞增殖和成活[12]。SIRT1的激活可能增加线粒体功能和能量生成[13]。此外，据报道，SIRT1通过与PGC-1α相互作用以增加PGC-1α的表达水平和线粒体生物合成[14]。有研究报道，AMPK/SIRT1/PGC-1α通路在缺血条件下会发生异常，因此该通路可能会成为治疗心血管疾病的药理靶标[15]。
丹七片是一种著名的中成药，主要由中药丹参和三七组成，已广泛用于心血管疾病治疗[16]。目前，丹七片已被2010年《中华人民共和国药典》收录。研究表明，丹七片可以调节缺血性心脏病动物模型中脂肪酸和葡萄糖的代谢[17]。但是，丹七片对能量代谢上游转录调节因子的影响仍然未知。本研究通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉建立了缺血性心脏大鼠模型，并探讨了丹七片对AMPK/SIRT1/PGC-1α途径的作用机制，并探讨了丹七片对参与了线粒体的生物合成和抗氧化过程的PGC-1α的下游靶标的影响，旨在进一步揭示丹七片治疗心血管疾病的药理机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 选取无特定病原体（SPF）级的60只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由第四军医大学唐都医院功能性脑疾病研究所提供，大鼠体质量为212～228 g，平均体质量为（218.32±9.90）g，将大鼠饲养在23～25 ℃、55%相对湿度、12 h光照黑暗循环照明的实验室内，给予大鼠实验室自制蒸馏水和标准大鼠饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司）。本研究经过医院医学伦理委员会审核通过（伦理审批号：201901180039）。
1.1.2 药物 丹七片（福州闽海药业有限公司，国药准字Z35020175），曲美他嗪（施维雅（天津）制药有限公司，国药准字H20055465）。
1.1.3 试剂与仪器 苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0105S），PGC-1α一抗（免疫组织化学）（Abcam公司，英国，货号：ab118603），生物素化的二抗（北京博奥森生物技术有限公司，货号：SP-0024），ATP分析试剂盒（南京建成生物科技有限公司，货号：A095-1-1），RIPA裂解缓冲液（Sigma公司，美国，货号：R0278），蛋白质定量试剂盒（南京建成生物科技有限公司，货号：A045-1），PGC-1α一抗（Abcam公司，英国，货号：ab176328），mitofusin 1一抗（MFN1）（Abcam公司，英国，货号：ab221661），mitofusin 2一抗（MFN2）（Abcam公司，英国，货号：ab124773），SIRT1一抗（Abcam公司，英国，货号：ab76039），AMPK一抗（Abcam公司，英国，货号：ab133448），超氧化物歧化酶2（SOD2）一抗（Abcam公司，英国，货号：ab137037）3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）一抗（Abcam公司，英国，货号：ab8245），辣根過氧化物酶（HRP）标记的二抗（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bse-0361P），增强型ECL化学发光底物试剂盒（上海炎熙生物科技有限公司，货号：Mqt-wen-20），微小超声心动图仪（Visualsonics公司，加拿大，型号：Vevo2100型）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 结扎手术完成24 h后，在成活的大鼠中选择48只进行后续实验，将大鼠根据随机数表随机分为4组，分别为假手术组、模型组、丹七片组和曲美他嗪组，每组12只。缺血性心脏病大鼠模型的建立参考文献[18]的方法通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉建立缺血性心脏大鼠模型。大鼠按照标准饲养条件进行1周适应性饲养后，对大鼠注射50 mg/kg剂量的1%戊巴比妥进行麻醉。通过口腔气管插管并连接到呼吸机，然而结扎LAD冠状动脉。假手术组的大鼠进行相同的操作步骤但不结扎LAD。 1.2.2 给药方法 丹七片组的大鼠以剂量500.0 mg/kg的丹七片溶液灌胃。曲美他嗪组的大鼠以剂量6.0 mg/kg的曲美他嗪溶液灌胃。通过参照人体和动物体表面积的当量剂量比计算剂量，大鼠的当量剂量是人的6倍左右。假手术组和模型组的大鼠灌胃相同体积的生理盐水。灌胃1个月后，所有大鼠禁食24 h后进行超声心动图检查，然后处死大鼠，对梗死边界区域的心脏组织进行灌注并取出，-80 ℃保存。
1.2.3 超声心动图检查 通过Vevo2100型微小超声心动图仪评估大鼠的心脏功能。超声心动图的主要指标包括：收缩末期左心室内径（LVIDs）、舒张末期左心室内径（LVIDd）、射血分数（EF）和缩短分数（FS），通过3个心动周期记录平均值。
1.2.4 苏木精-伊红（HE）染色 收集大鼠的心肌组织并用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后将心脏组织在4%多聚甲醛中固定72 h，将心肌组织用切片机切成4 μm切片并用HE染色。实验步骤严格按照HE染色试剂盒说明进行，然后在显微镜下观察病理切片。
1.2.5 免疫组织化学染色 使用细胞和组织染色试剂盒进行免疫组织化学染色。将切片在二甲苯中脱蜡，然后用梯度乙醇洗脱。室温下用0.3% H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶15 min，然后将切片与PGC-1α（1∶1 000稀释）一抗在4 ℃孵育过夜，然后在室温下用正常山羊血清中封闭30 min。将切片用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后与生物素化的二抗在室温孵育1 h，然后用二氨基联苯胺（DAB）和苏木精染色。在光学显微镜下观察染色情况，阳性区域被染成棕黄色。PGC-1α阳性染色评分为阳性细胞计数评分×染色强度评分。阳性细胞计数评分：阳性细胞数为<10%、10%～25%、25%～75%和>75%分别为0、1、2和3分。染色强度评分：未染色、淡黄色、棕黄色、深棕色依次为0、1、2和3分。
1.2.6 ATP检测 将新鲜心肌组织用500 μL热蒸馏水匀浆并提取1 min。根据ATP分析试剂盒检测ATP水平。通过参考相应的标准曲线计算样品中的水平，单位为μmol/g prot。
1.2.7 Western Blotting分析 将心肌组织在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中裂解。使用蛋白质定量试剂盒检测蛋白质水平。通过煮沸15 min使蛋白质变性，然后按照每孔50 μg蛋白（10 μL）的水平将样品用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂牛奶封闭1 h后，将膜与不同的一抗在4 ℃孵育过夜，其中包括PGC-1α（1∶1 000）、mitofusin 1（MFN1，1∶1 000）、mitofusin 2（MFN2，1∶1 000）、SIRT1（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、超氧化物歧化酶2（SOD2，1∶1 000）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，1∶5 000）。洗滌后将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1 h。室温下用增强型ECL化学发光底物试剂盒进行显影，然后通过Image-Lab软件测量条带强度，GAPDH作为内部对照。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，使用单因素方差分析和LSD检验进行组间差异比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 丹七片对缺血性心脏病大鼠LVIDs、LVIDd、EF和FS的影响 与假手术组比较，模型组大鼠的LVIDs和LVIDd分别增加了159.32%和69.17%，EF和FS分别降低了48.58%和61.78%，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，丹七片组大鼠的LVIDs和LVIDd分别减少了26.35%和20.73%，而EF和FS分别增加了31.61%和42.82%，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，曲美他嗪组的LVIDs和LVIDd明显降低，且EF和FS也明显升高（P<0.05）。见表1。
2.2 丹七片保护缺血性心脏病模型大鼠的心肌细胞结构 HE染色结果显示，假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，未出现病理改变，而模型组大鼠心肌细胞出现水肿，且间隙明显增大，炎性细胞浸润明显。丹七片组和曲美他嗪组大鼠心肌细胞排列较为整齐，细胞水肿减轻，细胞间隙减小，炎性细胞减少。见图1。
2.3 丹七片改善缺血性心脏病模型大鼠的心肌ATP的产生 与假手术组比较，模型组大鼠心肌ATP水平明显降低了57.89%（P<0.05）;与模型组比较，丹七片组大鼠心肌ATP水平显著增加了108.57%（P<0.05），曲美他嗪组大鼠心肌ATP水平显著提高了59.29%（P<0.05）。见图2。
2.4 丹七片调节缺血性心脏病模型大鼠心肌AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路 与假手术组比较，模型组大鼠PGC-1α的阳性染色评分显著降低了58.24%（P<0.05）;与模型组比较，丹七片组大鼠PGC-1α的阳性染色评分显著上升了76.32%（P<0.05）。Western Blotting显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中的AMPK、SIRT1和PGC-1α蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;与模型组比较，丹七片组大鼠的AMPK、SIRT1和PGC-1α蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）;曲美他嗪组大鼠上述蛋白的表达水平也显著上调（P<0.05）。见图3、图4。
2.5 丹七片调节PGC-1α的下游靶标 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中的PGC-1α的下游靶标MFN1、MFN2和SOD2的蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;与模型组比较，丹七片组大鼠的MFN1、MFN2和SOD2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）;曲美他嗪组大鼠上述蛋白的表达水平也显著上调（P<0.05）。见图5。 3 讨论
ATP生成速率对于心肌细胞的收缩功能至关重要。PGC-1α是转录共激活因子，在调节参与心肌能量代谢的基因表达中起关键作用。在缺血性心脏病中，心肌细胞的能量代谢能力受到不同程度的损害。目前，多种传统中药制剂已经被广泛应用于心血管疾病的治疗中，并且取得了较好的效果。丹七片是一种由中药丹参和三七组成的著名中成药，研究表明，丹七片可以调节缺血性心脏病动物模型中脂肪酸和葡萄糖的代谢，从而发挥心脏保护作用[16-18]。本研究探讨了丹七片在缺血性心脏病大鼠模型能量代谢中的作用，并考察了丹七片对AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路相关组分的影响。
本研究通过结扎大鼠LAD冠状动脉建立了缺血性心脏病模型，超声心动图检查发现大鼠在经过1个月的丹七片和阳性对照曲美他嗪治疗后，LVIDs、LVIDd、EF和FS均明显改善。HE染色结果也显示，丹七片明显抑制了大鼠结扎LAD冠状动脉引起的心肌组织和细胞病理改变。上述结果说明丹七片对缺血性心脏病具有保护作用，可改善心脏功能并防止心肌损伤。丹七片具有活血化瘀、理气止痛等功效，并且可以改善血脂代谢，纠正脂质代谢紊乱，在佐治冠心病方面疗效显著[20]。郭淑贞等[21]研究发现，丹七片可有效减小小型猪心肌缺血模型的缺血范围并改善心室重构。目前，丹参和三七在治疗缺血性心脏病方面的效果已经得到临床证实，而本研究结果也发现该2种中药制成的丹七片在改善缺血性心脏病模型方面疗效显著，与曲美他嗪的效果相当。曲美他嗪是一种用于治疗心绞痛的成熟的代谢药物，曲美他嗪通过阻断长链3-酮酰基-CoA硫解酶来提高葡萄糖利用率并抑制脂肪酸代谢[22]。
研究表明丹七片可以调节冠心病的能量代谢，而能量代谢缺陷则会促进心力衰竭等心血管疾病的发展[18]。本研究发现丹七片处理可提高大鼠心肌ATP水平。PGC-1α在能量代谢的转录调控中起着非常重要的作用。PGC-1α可诱导4条呼吸链、ATPase复合物以及三羧酸循环中所有8种酶的70%以上的亚基[23]。在本研究中，丹七片处理显著上调了PGC-1α。这表明丹七片可能通过PGC-1α在主要代谢过程中诱导编码关键酶的基因表达。
PGC-1α的活性和表达可以通过能量传感器（包括AMPK和SIRT1）进行调节。本研究发现丹七片可以上调AMPK的表达，从而上调PGC-1α。Sirtuins是在衰老和长寿中起关键作用的蛋白质家族[24]。SIRT1是NAD+依赖性脱乙酰基酶，可调节包括代谢在内的多种细胞过程[25]。在本研究中，丹七片可上调SIRT1的表达水平。本研究推测丹七片可通过作用于AMPK、SIRT1和PGC-1α这3种调节剂来增加心肌细胞中ATP的产生。
PGC-1α不仅调节基因表达，而且还调节线粒体的生物合成[6]。维持心肌细胞的稳定性需要线粒体裂变与融合之间的动态平衡。线粒体平衡是维持心脏代谢需求并保护心肌细胞免受凋亡刺激所必需的。线粒体稳态的破坏可直接導致疾病的发生[26]。线粒体融合素（包括MFN1和MFN2）在线粒体的生物合成中起重要作用，并且MGC1和MFN2的表达受到PGC-1α的调节[27]。本研究发现模型组心肌组织中MFN1和MFN2的表达下调，而丹七片的处理可上调其表达，表明丹七片可以通过PGC-1α调节线粒体的生物合成。PGC-1α的另一个下游靶标是SOD2，SOD2是清除线粒体中活性氧（ROS）的关键抗氧化酶之一[28]。线粒体是ROS形成的主要位点，ROS的积累可破坏细胞大分子结构和细胞膜，对细胞功能危害非常大。本研究发现丹七片可以上调SOD2的表达，从而减轻缺血引起的氧化应激损伤。
总之，本研究表明丹七片可以在缺血性心脏病模型中发挥心脏保护功能，并上调ATP的产生。丹七片可激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路及其下游分子，改善能量代谢并还调节线粒体的生物合成，从而改善心脏功能并防止心肌损伤。
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（2020-11-05收稿 責任编辑：杨觉雄）
基金项目：陕西省重点研发计划项目（2018YBXM-SF-12-1）;唐都医院创新发展基金资助项目（2018QYTS011）
作者简介：刘慧（1978.09—），女，硕士，副主任医师，研究方向：冠心病和高血压，E-mail：[email protected]
通信作者：王海燕（1975.05—），女，博士，副主任医师，研究方向：冠心病和心律失常，E-mail：[email protected]
关键词 丹七片;缺血性心脏病;能量代谢;线粒体;心肌损伤;三磷酸腺苷;AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路
Regulatory Effect of Danqi Tablet on Energy Metabolism in a Rat Model of Ischemic Heart Disease
LIU Hui，LIU Jing，LIU Cong，DANG Jingyi，WANG Haiyan
（Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital，Air Force Medical University
of People′s Liberation Army of China，Xi′an 710032，China）
Abstract Objective：To investigate the regulation of energy metabolism with Danqi Tablet in a rat model of ischemic heart disease.Methods：A rat model of ischemic heart was established by ligation of the left anterior descending coronary artery.A total of 48 rats were divided into a sham an operation group，a Danqi tablet group and trimetazidine group，with 12 rats in each group.Rats in the Danqi Tablets were given a solution of Danqi Tablets at a dose of 500.0 mg/kg.Rats in the trimetazidine group were given a solution of trimetazidine at a dose of 6.0 mg/kg.The other groups were given normal saline.After 1 month of treatment，cardiac function，myocardial tissue cytopathological changes，myocardial ATP levels，and AMPK/SIRT1/PGC-1α signaling pathway and downstream molecular expression were evaluated.Results：Echocardiography showed that compared with the model group，LVIDs and LVIDd in the Danqi tablet group were reduced by 26.35% and 20.73%，while EF and FS increased by 31.61% and 42.82%，and the difference was significant（P<0.05）.The results of HE staining showed that the cardiomyocytes in the Danqi tablet group were arranged neatly，the cell edema was reduced，the cell gap was reduced，and the inflammatory cells were decreased.Compared with the model group，the myocardial ATP level of the Danqi tablet group increased significantly（P<0.05）.Immunohistochemical staining showed that the PGC-1α positive staining score of rats in the Danqipian group was significantly higher than that of the model group（P<0.05）.Western Blotting showed that the expression levels of AMPK，SIRT1，PGC-1α，MFN1，MFN2 and SOD2 were significantly increased in the Danqi Tablets group compared with the model group（P<0.05）.Conclusion：Danqi Tablet can play a cardioprotective function in the rat model of ischemic heart disease and up-regulate ATP production.Danqi Tablets activate the AMPK/SIRT1/PGC-1α signaling pathway and its downstream molecules，improve energy metabolism and also regulate mitochondrial biogenesis，thereby improving rat cardiac function and preventing myocardial damage. Keywords Danqi tablets; Ischemic heart disease; Energy metabolism; Mitochondrial; Myocardial damage; ATP; AMPK/SIRT1/PGC-1α signaling pathway
中图分类号：R289.5;R542文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.019
心血管疾病是世界范围内引起人类死亡的主要疾病类型，而急性缺血诱发的心肌梗死又是心血管疾病患者死亡的主要原因之一[1-3]。心肌细胞的收缩需要三磷酸腺苷（ATP）持续提供能量。在缺血条件下，由于氧气和营养供应不足，心肌能量代谢会受到干扰[4-5]。因此，能量代谢的调节是提高心肌梗死治疗效果的关键途径。
心肌细胞所需的大部分能量是通过氧化磷酸化在线粒体内产生的。线粒体的动态平衡和能量代谢受到多种因子调节。几个转录因子在代谢相关基因的转录中起关键作用。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅激活因子-1α（Peroxlsome Proliferator-activated Receptor Gamma Coactivator-1α，PGC-1α）是控制能量代谢的主要转录调节因子[6]。PGC-1α调节多种过程，包括线粒体的生物合成、呼吸作用、糖异生作用和氧化磷酸化等[7]。然而，目前对PGC-1α活性的调节机制尚待完全了解。最近的研究表明，AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）和Sirtuin 1（SIRT1）在代谢调节中起主要作用，并影响PGC-1α转录调控能量代谢[8-9]。AMPK是主要的代谢能量传感器之一，能量不足时，AMP/ATP比值增加，AMPK被激活并增强与葡萄糖转运、糖酵解和线粒体呼吸有关的基因表达[10]。AMPK还可以通过增加细胞中NAD+水平来增强NAD+依赖性脱乙酰基酶SIRT1的活性[11]。此外，AMPK的激活会导致PGC-1α的表达增加。SIRT1是哺乳动物的沉默调节蛋白之一，其参与调节能量代谢、细胞增殖和成活[12]。SIRT1的激活可能增加线粒体功能和能量生成[13]。此外，据报道，SIRT1通过与PGC-1α相互作用以增加PGC-1α的表达水平和线粒体生物合成[14]。有研究报道，AMPK/SIRT1/PGC-1α通路在缺血条件下会发生异常，因此该通路可能会成为治疗心血管疾病的药理靶标[15]。
丹七片是一种著名的中成药，主要由中药丹参和三七组成，已广泛用于心血管疾病治疗[16]。目前，丹七片已被2010年《中华人民共和国药典》收录。研究表明，丹七片可以调节缺血性心脏病动物模型中脂肪酸和葡萄糖的代谢[17]。但是，丹七片对能量代谢上游转录调节因子的影响仍然未知。本研究通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉建立了缺血性心脏大鼠模型，并探讨了丹七片对AMPK/SIRT1/PGC-1α途径的作用机制，并探讨了丹七片对参与了线粒体的生物合成和抗氧化过程的PGC-1α的下游靶标的影响，旨在进一步揭示丹七片治疗心血管疾病的药理机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 选取无特定病原体（SPF）级的60只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由第四军医大学唐都医院功能性脑疾病研究所提供，大鼠体质量为212～228 g，平均体质量为（218.32±9.90）g，将大鼠饲养在23～25 ℃、55%相对湿度、12 h光照黑暗循环照明的实验室内，给予大鼠实验室自制蒸馏水和标准大鼠饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司）。本研究经过医院医学伦理委员会审核通过（伦理审批号：201901180039）。
1.1.2 药物 丹七片（福州闽海药业有限公司，国药准字Z35020175），曲美他嗪（施维雅（天津）制药有限公司，国药准字H20055465）。
1.1.3 试剂与仪器 苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0105S），PGC-1α一抗（免疫组织化学）（Abcam公司，英国，货号：ab118603），生物素化的二抗（北京博奥森生物技术有限公司，货号：SP-0024），ATP分析试剂盒（南京建成生物科技有限公司，货号：A095-1-1），RIPA裂解缓冲液（Sigma公司，美国，货号：R0278），蛋白质定量试剂盒（南京建成生物科技有限公司，货号：A045-1），PGC-1α一抗（Abcam公司，英国，货号：ab176328），mitofusin 1一抗（MFN1）（Abcam公司，英国，货号：ab221661），mitofusin 2一抗（MFN2）（Abcam公司，英国，货号：ab124773），SIRT1一抗（Abcam公司，英国，货号：ab76039），AMPK一抗（Abcam公司，英国，货号：ab133448），超氧化物歧化酶2（SOD2）一抗（Abcam公司，英国，货号：ab137037）3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）一抗（Abcam公司，英国，货号：ab8245），辣根過氧化物酶（HRP）标记的二抗（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bse-0361P），增强型ECL化学发光底物试剂盒（上海炎熙生物科技有限公司，货号：Mqt-wen-20），微小超声心动图仪（Visualsonics公司，加拿大，型号：Vevo2100型）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 结扎手术完成24 h后，在成活的大鼠中选择48只进行后续实验，将大鼠根据随机数表随机分为4组，分别为假手术组、模型组、丹七片组和曲美他嗪组，每组12只。缺血性心脏病大鼠模型的建立参考文献[18]的方法通过结扎左前降支（LAD）冠状动脉建立缺血性心脏大鼠模型。大鼠按照标准饲养条件进行1周适应性饲养后，对大鼠注射50 mg/kg剂量的1%戊巴比妥进行麻醉。通过口腔气管插管并连接到呼吸机，然而结扎LAD冠状动脉。假手术组的大鼠进行相同的操作步骤但不结扎LAD。 1.2.2 给药方法 丹七片组的大鼠以剂量500.0 mg/kg的丹七片溶液灌胃。曲美他嗪组的大鼠以剂量6.0 mg/kg的曲美他嗪溶液灌胃。通过参照人体和动物体表面积的当量剂量比计算剂量，大鼠的当量剂量是人的6倍左右。假手术组和模型组的大鼠灌胃相同体积的生理盐水。灌胃1个月后，所有大鼠禁食24 h后进行超声心动图检查，然后处死大鼠，对梗死边界区域的心脏组织进行灌注并取出，-80 ℃保存。
1.2.3 超声心动图检查 通过Vevo2100型微小超声心动图仪评估大鼠的心脏功能。超声心动图的主要指标包括：收缩末期左心室内径（LVIDs）、舒张末期左心室内径（LVIDd）、射血分数（EF）和缩短分数（FS），通过3个心动周期记录平均值。
1.2.4 苏木精-伊红（HE）染色 收集大鼠的心肌组织并用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后将心脏组织在4%多聚甲醛中固定72 h，将心肌组织用切片机切成4 μm切片并用HE染色。实验步骤严格按照HE染色试剂盒说明进行，然后在显微镜下观察病理切片。
1.2.5 免疫组织化学染色 使用细胞和组织染色试剂盒进行免疫组织化学染色。将切片在二甲苯中脱蜡，然后用梯度乙醇洗脱。室温下用0.3% H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶15 min，然后将切片与PGC-1α（1∶1 000稀释）一抗在4 ℃孵育过夜，然后在室温下用正常山羊血清中封闭30 min。将切片用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后与生物素化的二抗在室温孵育1 h，然后用二氨基联苯胺（DAB）和苏木精染色。在光学显微镜下观察染色情况，阳性区域被染成棕黄色。PGC-1α阳性染色评分为阳性细胞计数评分×染色强度评分。阳性细胞计数评分：阳性细胞数为<10%、10%～25%、25%～75%和>75%分别为0、1、2和3分。染色强度评分：未染色、淡黄色、棕黄色、深棕色依次为0、1、2和3分。
1.2.6 ATP检测 将新鲜心肌组织用500 μL热蒸馏水匀浆并提取1 min。根据ATP分析试剂盒检测ATP水平。通过参考相应的标准曲线计算样品中的水平，单位为μmol/g prot。
1.2.7 Western Blotting分析 将心肌组织在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中裂解。使用蛋白质定量试剂盒检测蛋白质水平。通过煮沸15 min使蛋白质变性，然后按照每孔50 μg蛋白（10 μL）的水平将样品用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂牛奶封闭1 h后，将膜与不同的一抗在4 ℃孵育过夜，其中包括PGC-1α（1∶1 000）、mitofusin 1（MFN1，1∶1 000）、mitofusin 2（MFN2，1∶1 000）、SIRT1（1∶1 000）、AMPK（1∶1 000）、超氧化物歧化酶2（SOD2，1∶1 000）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，1∶5 000）。洗滌后将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1 h。室温下用增强型ECL化学发光底物试剂盒进行显影，然后通过Image-Lab软件测量条带强度，GAPDH作为内部对照。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，使用单因素方差分析和LSD检验进行组间差异比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 丹七片对缺血性心脏病大鼠LVIDs、LVIDd、EF和FS的影响 与假手术组比较，模型组大鼠的LVIDs和LVIDd分别增加了159.32%和69.17%，EF和FS分别降低了48.58%和61.78%，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，丹七片组大鼠的LVIDs和LVIDd分别减少了26.35%和20.73%，而EF和FS分别增加了31.61%和42.82%，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，曲美他嗪组的LVIDs和LVIDd明显降低，且EF和FS也明显升高（P<0.05）。见表1。
2.2 丹七片保护缺血性心脏病模型大鼠的心肌细胞结构 HE染色结果显示，假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，未出现病理改变，而模型组大鼠心肌细胞出现水肿，且间隙明显增大，炎性细胞浸润明显。丹七片组和曲美他嗪组大鼠心肌细胞排列较为整齐，细胞水肿减轻，细胞间隙减小，炎性细胞减少。见图1。
2.3 丹七片改善缺血性心脏病模型大鼠的心肌ATP的产生 与假手术组比较，模型组大鼠心肌ATP水平明显降低了57.89%（P<0.05）;与模型组比较，丹七片组大鼠心肌ATP水平显著增加了108.57%（P<0.05），曲美他嗪组大鼠心肌ATP水平显著提高了59.29%（P<0.05）。见图2。
2.4 丹七片调节缺血性心脏病模型大鼠心肌AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路 与假手术组比较，模型组大鼠PGC-1α的阳性染色评分显著降低了58.24%（P<0.05）;与模型组比较，丹七片组大鼠PGC-1α的阳性染色评分显著上升了76.32%（P<0.05）。Western Blotting显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中的AMPK、SIRT1和PGC-1α蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;与模型组比较，丹七片组大鼠的AMPK、SIRT1和PGC-1α蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）;曲美他嗪组大鼠上述蛋白的表达水平也显著上调（P<0.05）。见图3、图4。
2.5 丹七片调节PGC-1α的下游靶标 与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织中的PGC-1α的下游靶标MFN1、MFN2和SOD2的蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;与模型组比较，丹七片组大鼠的MFN1、MFN2和SOD2蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）;曲美他嗪组大鼠上述蛋白的表达水平也显著上调（P<0.05）。见图5。 3 讨论
ATP生成速率对于心肌细胞的收缩功能至关重要。PGC-1α是转录共激活因子，在调节参与心肌能量代谢的基因表达中起关键作用。在缺血性心脏病中，心肌细胞的能量代谢能力受到不同程度的损害。目前，多种传统中药制剂已经被广泛应用于心血管疾病的治疗中，并且取得了较好的效果。丹七片是一种由中药丹参和三七组成的著名中成药，研究表明，丹七片可以调节缺血性心脏病动物模型中脂肪酸和葡萄糖的代谢，从而发挥心脏保护作用[16-18]。本研究探讨了丹七片在缺血性心脏病大鼠模型能量代谢中的作用，并考察了丹七片对AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路相关组分的影响。
本研究通过结扎大鼠LAD冠状动脉建立了缺血性心脏病模型，超声心动图检查发现大鼠在经过1个月的丹七片和阳性对照曲美他嗪治疗后，LVIDs、LVIDd、EF和FS均明显改善。HE染色结果也显示，丹七片明显抑制了大鼠结扎LAD冠状动脉引起的心肌组织和细胞病理改变。上述结果说明丹七片对缺血性心脏病具有保护作用，可改善心脏功能并防止心肌损伤。丹七片具有活血化瘀、理气止痛等功效，并且可以改善血脂代谢，纠正脂质代谢紊乱，在佐治冠心病方面疗效显著[20]。郭淑贞等[21]研究发现，丹七片可有效减小小型猪心肌缺血模型的缺血范围并改善心室重构。目前，丹参和三七在治疗缺血性心脏病方面的效果已经得到临床证实，而本研究结果也发现该2种中药制成的丹七片在改善缺血性心脏病模型方面疗效显著，与曲美他嗪的效果相当。曲美他嗪是一种用于治疗心绞痛的成熟的代谢药物，曲美他嗪通过阻断长链3-酮酰基-CoA硫解酶来提高葡萄糖利用率并抑制脂肪酸代谢[22]。
研究表明丹七片可以调节冠心病的能量代谢，而能量代谢缺陷则会促进心力衰竭等心血管疾病的发展[18]。本研究发现丹七片处理可提高大鼠心肌ATP水平。PGC-1α在能量代谢的转录调控中起着非常重要的作用。PGC-1α可诱导4条呼吸链、ATPase复合物以及三羧酸循环中所有8种酶的70%以上的亚基[23]。在本研究中，丹七片处理显著上调了PGC-1α。这表明丹七片可能通过PGC-1α在主要代谢过程中诱导编码关键酶的基因表达。
PGC-1α的活性和表达可以通过能量传感器（包括AMPK和SIRT1）进行调节。本研究发现丹七片可以上调AMPK的表达，从而上调PGC-1α。Sirtuins是在衰老和长寿中起关键作用的蛋白质家族[24]。SIRT1是NAD+依赖性脱乙酰基酶，可调节包括代谢在内的多种细胞过程[25]。在本研究中，丹七片可上调SIRT1的表达水平。本研究推测丹七片可通过作用于AMPK、SIRT1和PGC-1α这3种调节剂来增加心肌细胞中ATP的产生。
PGC-1α不仅调节基因表达，而且还调节线粒体的生物合成[6]。维持心肌细胞的稳定性需要线粒体裂变与融合之间的动态平衡。线粒体平衡是维持心脏代谢需求并保护心肌细胞免受凋亡刺激所必需的。线粒体稳态的破坏可直接導致疾病的发生[26]。线粒体融合素（包括MFN1和MFN2）在线粒体的生物合成中起重要作用，并且MGC1和MFN2的表达受到PGC-1α的调节[27]。本研究发现模型组心肌组织中MFN1和MFN2的表达下调，而丹七片的处理可上调其表达，表明丹七片可以通过PGC-1α调节线粒体的生物合成。PGC-1α的另一个下游靶标是SOD2，SOD2是清除线粒体中活性氧（ROS）的关键抗氧化酶之一[28]。线粒体是ROS形成的主要位点，ROS的积累可破坏细胞大分子结构和细胞膜，对细胞功能危害非常大。本研究发现丹七片可以上调SOD2的表达，从而减轻缺血引起的氧化应激损伤。
总之，本研究表明丹七片可以在缺血性心脏病模型中发挥心脏保护功能，并上调ATP的产生。丹七片可激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路及其下游分子，改善能量代谢并还调节线粒体的生物合成，从而改善心脏功能并防止心肌损伤。
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（2020-11-05收稿 責任编辑：杨觉雄）
基金项目：陕西省重点研发计划项目（2018YBXM-SF-12-1）;唐都医院创新发展基金资助项目（2018QYTS011）
作者简介：刘慧（1978.09—），女，硕士，副主任医师，研究方向：冠心病和高血压，E-mail：[email protected]
通信作者：王海燕（1975.05—），女，博士，副主任医师，研究方向：冠心病和心律失常，E-mail：[email protected]