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摘要：目的：实现葡萄糖激酶GK的克隆表达。方法：通过酶切、酶连、转化构建重组质粒pCDFDuet-GK，进而构建工程菌；研究诱导温度、诱导时机、诱导强度、诱导时间对酶活力的影响，优化表达条件。结果：成功构建表达载体pCDFDuet-GK和工程菌，实现了葡萄糖激酶的克隆表达，在诱导温度16 ℃，诱导时机OD6000.6，诱导强度0.6 mM IPTG，诱导时间12 h的最优条件下，最大酶活力达到6.6 U/L。
关键词：葡萄糖激酶；克隆；表达
中图分类号：Q552 文献标识码：A 文章编号：1003-2177（2018）02-0084-03
辅酶是一种可以把化学基团在酶与底物分子间相互转移的有机小分子，在一些酶的催化过程中必不可少[1]。由于辅酶价格昂贵，工业中常用辅酶再生的方法满足酶促反应对辅酶的需求[2-3]。在前期研究中，我们利用Pichia pastoris GS115的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GpdPP和己糖激酶HK偶联，构建了一个高效的辅酶NADPH再生体系（GpdPP-HK）[4]。葡萄糖激酶（GK），在哺乳动物的胰腺以及肝脏中普遍存在，可在ATP存在时将葡萄糖磷酸化，生成6-磷酸葡萄糖[5-6]。本文通过构建含有葡萄糖激酶GK基因的工程菌，实现克隆表达，优化表达条件，为与GpdPP偶联的辅酶NADPH再生体系贡献新的酶源。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与材料
超净工作台、压力蒸汽灭菌器、台式高速冷冻离心机、恒温培养振荡器、PCR自动系列化分析仪、超声波细胞破碎仪、电泳仪。
Escherichia coli BL21（DE3），pCDFDuet-1，HEPES、IPTG、4×Protein SDS PAGE Loading Buffer、Protein Marker、辅酶、PrimeSTARMAX DNA Polymerase。
1.2 实验方法
1.2.1 PCR
PCR条件：（1）预变性95 ℃ 2 min。（2）变性98 ℃ 10 S，退火55 ℃ 15 S，延伸72 ℃ 20 S，循环30次。（3）延伸72 ℃ 2 min。（4）16 ℃ 5 min。
引物序列如下：
F-GKBS：CGGAATTCGATGGACGAGATATG GTTTGCGGG
R-GKBS：CCGCTCGAGTTAACAATTTTGAT GTTTCAGCCATTCATTTTTAG
1.2.2 诱导
在含抗生素的液体LB中加入1 %的种子液，培养至OD600为0.6～0.8时停止培养，加入0.5 mM IPTG进行诱导培养。
1.2.3 菌体收集与细胞破碎
静息细胞菌悬液的制备：取适量培养好的菌液，8000 rpm 4 ℃离心5min，除去上清，ddH2O润洗2次，再用HEPES缓冲液重悬菌体。
细胞破碎液的制备：取2 mL上述菌液至5 mL离心管中，置于冰上，用超声破碎仪破碎30次，破3 S，停7S，Ampl 25 %。
粗酶液的制备：将此细胞破碎液12000 rpm 4 ℃离心1min，取上清。
1.2.4 酶活力的测定
參考文献[4]。
1.2.5 工程菌表达条件的优化
（1）诱导温度：将摇床温度分别设置为16℃、20℃、30℃、37 ℃ ，在OD600为0.6时，加入 0.6 mM IPTG，诱导12 h。（2）诱导时机：将摇床温度设为16 ℃，控制OD600为0.6、0.9、1.2、1.5时，加入0.6 mM IPTG，诱导12 h。（3）诱导强度：将摇床温度设为16 ℃，OD600为0.6，分别加入0.3 mM、0.6 mM、0.9 mM、1.2 mM IPTG，诱导12 h。（4）诱导时间：将摇床温度设为16 ℃，OD600 为0.6，加入0.6 mM IPTG ，分别诱导8 h，12 h，16 h，20 h。
2 结果与分析
2.1含重组质粒pCDFDuet-GK的工程菌的构建
通过PCR，从Bacillus subtilis 168基因组扩增目的基因GK（NCBI登录号：NC_000964.3），再经过酶切、酶连、转化构建重组质粒pCDFDuet-GK，经测序验证质粒无误。利用重组质粒pCDFDuet-GK，被转化为感受态细胞E. coli BL21（DE3）后，挑取单菌落进行菌落PCR验证，得到PCR产物大小位于750与1000之间，这与基因序列966bp一致，说明工程菌构建成功。
2.2 葡萄糖激酶GK的表达优化
经过工程菌表达条件的优化，通过分析电泳图，对比各组泳道1和泳道2、3，空白细胞均没有表达出目标蛋白。对比泳道2、3表明重组后的工程菌经过诱导，表达出的蛋白质在29 kDa - 44.3 kDa之间，与目标蛋白一致。而且各组泳道3沉淀中含有的包涵体均很少，说明大部分表达出的均是可溶蛋白。
经过对工程菌表达条件的优化，测量酶活得到最优诱导温度为16℃，最优诱导时机为OD600值为0.6，最优诱导强度为0.6 mM IPTG，最优诱导时间为12h，在此些表达条件下，酶活最高为6.6 U/L。
3 结语
本实验成功构建重组质粒E.coil BL21（pCDFDuet-GK），并优化了工程菌的各个表达条件，16 ℃是最优诱导温度，OD600值0.6是最优诱导时机，0.6 mM IPTG是最优诱导强度，12 h是最优诱导时间，优化后的酶活为6.6 U/L。
参考文献
[1] 林璐，李莎，朱宏阳，等.固定化细胞生物催化合成异麦芽酮糖[J].食品与发酵工业，2008，34（3）：29-32.
[2] 李卉.辅酶I的聚乙二醇修饰[D].杭州：浙江大学，2005.
[3] 江金鹏，吴旭日，陈依军.解决氧化还原酶反应体系中辅酶问题的策略及其应用[J].生物工程学报，2012，28（4）： 410-419.
[4] 郑雅楠，陈少云，刘文洪，等.基于己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶共表达的辅酶NADPH高效再生[J].微生物学通报，2016，43（12）：2619-2626.
[5] Iynedjian P B，Gjinovci A，Renold A E.Stimulation by insulin of glucokinase gene transcription in liver of diabetic rats[J].Journal of Biological Chemistry，1988，263（2）：740-744.
[6] Wang H，Iynedjian P B.Modulation of glucose responsiveness of insulinoma β-cells by graded overexpression of glucokinase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1997，94（9）：4372-4377.
关键词：葡萄糖激酶；克隆；表达
中图分类号：Q552 文献标识码：A 文章编号：1003-2177（2018）02-0084-03
辅酶是一种可以把化学基团在酶与底物分子间相互转移的有机小分子，在一些酶的催化过程中必不可少[1]。由于辅酶价格昂贵，工业中常用辅酶再生的方法满足酶促反应对辅酶的需求[2-3]。在前期研究中，我们利用Pichia pastoris GS115的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GpdPP和己糖激酶HK偶联，构建了一个高效的辅酶NADPH再生体系（GpdPP-HK）[4]。葡萄糖激酶（GK），在哺乳动物的胰腺以及肝脏中普遍存在，可在ATP存在时将葡萄糖磷酸化，生成6-磷酸葡萄糖[5-6]。本文通过构建含有葡萄糖激酶GK基因的工程菌，实现克隆表达，优化表达条件，为与GpdPP偶联的辅酶NADPH再生体系贡献新的酶源。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与材料
超净工作台、压力蒸汽灭菌器、台式高速冷冻离心机、恒温培养振荡器、PCR自动系列化分析仪、超声波细胞破碎仪、电泳仪。
Escherichia coli BL21（DE3），pCDFDuet-1，HEPES、IPTG、4×Protein SDS PAGE Loading Buffer、Protein Marker、辅酶、PrimeSTARMAX DNA Polymerase。
1.2 实验方法
1.2.1 PCR
PCR条件：（1）预变性95 ℃ 2 min。（2）变性98 ℃ 10 S，退火55 ℃ 15 S，延伸72 ℃ 20 S，循环30次。（3）延伸72 ℃ 2 min。（4）16 ℃ 5 min。
引物序列如下：
F-GKBS：CGGAATTCGATGGACGAGATATG GTTTGCGGG
R-GKBS：CCGCTCGAGTTAACAATTTTGAT GTTTCAGCCATTCATTTTTAG
1.2.2 诱导
在含抗生素的液体LB中加入1 %的种子液，培养至OD600为0.6～0.8时停止培养，加入0.5 mM IPTG进行诱导培养。
1.2.3 菌体收集与细胞破碎
静息细胞菌悬液的制备：取适量培养好的菌液，8000 rpm 4 ℃离心5min，除去上清，ddH2O润洗2次，再用HEPES缓冲液重悬菌体。
细胞破碎液的制备：取2 mL上述菌液至5 mL离心管中，置于冰上，用超声破碎仪破碎30次，破3 S，停7S，Ampl 25 %。
粗酶液的制备：将此细胞破碎液12000 rpm 4 ℃离心1min，取上清。
1.2.4 酶活力的测定
參考文献[4]。
1.2.5 工程菌表达条件的优化
（1）诱导温度：将摇床温度分别设置为16℃、20℃、30℃、37 ℃ ，在OD600为0.6时，加入 0.6 mM IPTG，诱导12 h。（2）诱导时机：将摇床温度设为16 ℃，控制OD600为0.6、0.9、1.2、1.5时，加入0.6 mM IPTG，诱导12 h。（3）诱导强度：将摇床温度设为16 ℃，OD600为0.6，分别加入0.3 mM、0.6 mM、0.9 mM、1.2 mM IPTG，诱导12 h。（4）诱导时间：将摇床温度设为16 ℃，OD600 为0.6，加入0.6 mM IPTG ，分别诱导8 h，12 h，16 h，20 h。
2 结果与分析
2.1含重组质粒pCDFDuet-GK的工程菌的构建
通过PCR，从Bacillus subtilis 168基因组扩增目的基因GK（NCBI登录号：NC_000964.3），再经过酶切、酶连、转化构建重组质粒pCDFDuet-GK，经测序验证质粒无误。利用重组质粒pCDFDuet-GK，被转化为感受态细胞E. coli BL21（DE3）后，挑取单菌落进行菌落PCR验证，得到PCR产物大小位于750与1000之间，这与基因序列966bp一致，说明工程菌构建成功。
2.2 葡萄糖激酶GK的表达优化
经过工程菌表达条件的优化，通过分析电泳图，对比各组泳道1和泳道2、3，空白细胞均没有表达出目标蛋白。对比泳道2、3表明重组后的工程菌经过诱导，表达出的蛋白质在29 kDa - 44.3 kDa之间，与目标蛋白一致。而且各组泳道3沉淀中含有的包涵体均很少，说明大部分表达出的均是可溶蛋白。
经过对工程菌表达条件的优化，测量酶活得到最优诱导温度为16℃，最优诱导时机为OD600值为0.6，最优诱导强度为0.6 mM IPTG，最优诱导时间为12h，在此些表达条件下，酶活最高为6.6 U/L。
3 结语
本实验成功构建重组质粒E.coil BL21（pCDFDuet-GK），并优化了工程菌的各个表达条件，16 ℃是最优诱导温度，OD600值0.6是最优诱导时机，0.6 mM IPTG是最优诱导强度，12 h是最优诱导时间，优化后的酶活为6.6 U/L。
参考文献
[1] 林璐，李莎，朱宏阳，等.固定化细胞生物催化合成异麦芽酮糖[J].食品与发酵工业，2008，34（3）：29-32.
[2] 李卉.辅酶I的聚乙二醇修饰[D].杭州：浙江大学，2005.
[3] 江金鹏，吴旭日，陈依军.解决氧化还原酶反应体系中辅酶问题的策略及其应用[J].生物工程学报，2012，28（4）： 410-419.
[4] 郑雅楠，陈少云，刘文洪，等.基于己糖激酶与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶共表达的辅酶NADPH高效再生[J].微生物学通报，2016，43（12）：2619-2626.
[5] Iynedjian P B，Gjinovci A，Renold A E.Stimulation by insulin of glucokinase gene transcription in liver of diabetic rats[J].Journal of Biological Chemistry，1988，263（2）：740-744.
[6] Wang H，Iynedjian P B.Modulation of glucose responsiveness of insulinoma β-cells by graded overexpression of glucokinase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1997，94（9）：4372-4377.