摘要 采用同源克隆法获得了刀鲚PEPCK基因全长cDNA序列，其具有高度保守的结构序列及功能位点，进化分析表明其与同属鲱形目的大西洋鲱具有最近的进化距离。在饥饿作用下刀鲚肝组织表达研究表明，PEPCK在糖异生调节方面，在对于饥饿作用下协调糖类代谢平衡，进而维持能量代谢供给上发挥了积极作用。该研究为今后进一步开展刀鲚抗环境因子变化调控机制提供了理论参考。
　　关键词 刀鲚;磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶;克隆;饥饿;表达
　　中图分类号 S 917.4文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2019）23-0107-08
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.031
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Molecular Cloning of PEPCK Gene in Coilia nasusand Its Expression Analysis under Starvation
　　WANG Mei yao1，2，3， LI Quan jie2
　　（1.Wuxi Fisheries College， Nanjing Agricultural University， Wuxi， Jiangsu 214081;
　　2.Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuxi， Jiangsu 214081;3.Aquatic Animals Genome Center， Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuxi， Jiangsu 214081）
　　Abstract cDNA sequence of PEPCK gene in C. nasus was cloned by using homologous cloning method， which had highly conserved sequence and functional sites. Phylogenetic analysis showed that C. nasus had the closest phylogenetic relationship with Clupea harengus in the same family with it. The expression study of liver tissue in C. nasus under starvation showed that PEPCK performed key regulatory function in gluconeogenesis， maintaining energy homeostasis under starvation stress. This research would provide theoretical references for further research on anti stress regulation mechanism in future.
　　Key words Coilia nasus;PEPCK;Cloning;Starvation;Expression
　　磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）是糖异生作用中的关键酶，可催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，进而最终形成葡萄糖，以供机体能量代谢所需[1]。根據PEPCK在细胞内的分布可分为细胞质型和线粒体型2种亚型，二者分别由核基因Pck1和Pck2编码而成[1-2]。2种亚型PEPCK在生物体内的比例在不同物种间具有较明显的差异性。在水产动物、哺乳动物上具有细胞质型和线粒体型PEPCK，而在植物中只存在细胞质型PEPCK[3]。现已在高等动物及水生动物[包括人类（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）、翘嘴红鲌（Culter alburnus）、金头鲷（Sparus aurata）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鲑（Salmo salar）等]中克隆获得了PEPCK的 cDNA序列[4-7]。研究表明，PEPCK广泛存在于不同种生物（包括人类、微生物、水产动物等）的各个组织中，包括脑、鳃、心、脾、种子、果实等[8-10]。在水产动物上开展的相关研究表明，外界环境因子（如盐度等）以及饲料组成的变化会对其表达水平产生影响[4，11-14]。
　　刀鲚为溯河洄游性鱼类，其在洄游期间饵料的可获得性将会受到影响，因而探讨饥饿对洄游性鱼类的影响研究具有重要意义。迄今为止，在刀鲚上未见到相关报道。笔者开展了刀鲚PEPCK序列克隆及饥饿作用下的表达分析，旨在为今后进一步开展刀鲚在洄游中抗饥饿作用的机体代谢调控研究提供一定的理论参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验鱼饲养管理
　　试验鱼为平均体重（8.6±0.5）g，体长（14.36±0.80）cm的5月龄刀鲚幼鱼，采自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭养殖基地。试验前14 d，将鱼拉网分别暂养于室内 5个规格为5 m×3 m×1 m的循环水水泥池中，其中一个养殖池用于向其余4个用于试验的养殖池补充刀鱼。试验期间连续增氧，进行水质监测，水温为（18.0±0.6）℃，pH为7.2，溶解氧浓度为（8.5±0.6）mg/L，氨态氮浓度≤0.01 mg/L，亚硝酸盐浓度≤001 mg/L。每天07：00和17：00投喂2次，以饱食为宜。 　　1.2 试验设计与组织采集
　　试验设定对照组和试验组各3个平行，每组试验鱼15尾。对照組正常投喂，试验组在试验期间不投喂。于饥饿试验开始后的0、2、8、14、20、26、32 d采样。分别从对照组与试验组各采集2尾鱼，将鱼置于浓度为40 mg/L的MS-222麻醉剂中麻醉10 s，采集血液，制备血清。于饥饿0 d采样时，从对照组鱼中取100 mg的鳃、脑、肝、脾、心、肾、脂肪组织、胃、肌肉，迅速冻于液氮中，以备后续试验。于后续试验时间点采样时，只采集肝组织，存于液氮中并采集血液，制备血清。对于采集的鱼体均要进行形态参数测量，包括体长、体重、内脏重和肝重。
　　1.3 总RNA 的提取和PEPCK基因中间序列的获得
　　取提取的总RNA，根据NCBI网站上大西洋鲱（Clupea harengus，XM_012837427.1）、斑马鱼（Ddanio rerio，NM_214751.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，KC149517.1）、大西洋鲑（Salmo salar，NM_001140449.1）、大黄鱼（Larimichthys crocea，XM_019275494.1）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus，XM_003448375.3）、人类（H.sapiens，NM_002591.3）、小鼠（M.musculus，AF009605.1）等基因的cDNA的保守区序列使用Prime Premier 5软件设计正反引物P1和P2（表1）。使用PrimeScript One Step Enzyme Mix（TaKaRa，日本）进行扩增，反应条件如下：50 ℃ 30 s;94 ℃预变性2 min，94 ℃反应30 s，57 ℃延伸30 s，共30个循环;最后72 ℃延伸1 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa，日本）回收长度700 bp的目的片段，将其连接至pMD18-T载体（TaKaRa，日本）并转入E.coli DH5α 感受态细胞内（TaKaRa，日本），送至上海铂尚生物技术有限公司测序，获得850 bp片段，经NCBI网站Blastx比对证实它是PEPCK同源序列。
　　1.4 刀鲚PEPCK基因5′、3′ RACE扩增试验
　　根据测得的刀鲚PEPCK中间段序列，设计5′-RACE与3′-RACE特异性引物P3～P6（表1）。使用RACE方法扩增刀鲚PEPCK基因的5′端与3′端序列。回收目的片段，将其连接至pMD18-T 载体（TaKaRa，日本）并转入E.coli DH5α 感受态细胞（TaKaRa，日本）内测序。然后，使用ContigExpress软件将保守区序列、5′端序列以及3′端序列进行拼接，得到刀鲚PEPCK全长cDNA序列。
　　1.5 PEPCK核酸及推导的氨基酸序列分析
　　使用SMS序列在线处理工具包（http：//www.bio-soft.net/sms/index.html）将LPL与PEPCK的cDNA序列分别翻译为氨基酸序列，使用等电点与分子量在线预测软件（http：//isoelectric.ovh.org/）进行分析，用SOPMA在线工具（http：//nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.html）分析推导的氨基酸序列二级结构，使用TMPRED在线软件（http：//www.expasy.org/tools/protscale.html）分析跨膜结构，使用PROSITE在线工具（http：//au.expasy.org/prosite/）分析功能域，使用DNAstar软件中的MegAlign比对氨基酸序列同源性，使用Mega 5.0软件采用邻接法（neighbour joining）构建相关物种的系统进化树，相关物种及其PEPCK登录号如下：大西洋鲱（C.haregus，XP_012692881.1）、花鲈（lateolabrax japonicus，ACN93989.1）、大黄鱼（L.crocea，XP_019131039.1）、罗非鱼（O.niloticus，XP_003448423.1）、大西洋鲑（S.salar，NP_001133921.1）、斑马鱼（D.rerio，NP_999916.1）、暗纹东方鲀（Takifugu fasciatus，XP_003973103.1）、大菱鲆（S.maximus，AGJ83085.1）、人类（H.sapiens，NP_002582.3）、小鼠（M.musculus，NP_035174.1）。
　　1.6 刀鲚PEPCK基因的组织表达分析
　　1.6.1 刀鲚PEPCK基因在各组织中的表达分析。
　　取对照组0 h时间点的刀鲚留存的各组织（包括鳃、脑、肝、脾、心、肾、肌肉等）开展实时荧光定量分析。根据已报道的β-actin序列，比对分析，设计刀鲚内参基因β-actin的特异引物P7和P8，根据获得的刀鲚PEPCK全长序列设计特异引物P9、P10，用于扩增185 bp片段。引物序列见表1。在ABI7500（ABI，美国）上开展实时荧光定量PCR分析。PCR反应条件如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 50 s，40个循环。各平行组各取2尾刀鲚，每个样品做3次重复，采用2-ΔΔCt 法计算PEPCK的mRNA相对表达量。使用SPSS 21.1统计软件采用单因素分析法中的Ducan’s多重比较法进行分析，结果均以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。 　　1.6.2 刀鲚PEPCK基因在饥饿作用下肝组织中的表达分析。
　　取对照组和试验组各時间点（包括0、2、8、14、20、26、32 d）的刀鲚肝组织，各平行组各取2尾刀鲚，每个样品做3次重复，试验方法及数据分析方法同“1.6.1”。
　　1.7 刀鲚形态参数及血清指标的测定
　　对对照组和试验组各时间点（包括0、2、8、14、20、26、32 d）采集的刀鲚，测量其体重、肝重和内脏重，对制备的血清测定皮质醇、血糖和溶菌酶含量。皮质醇（COR）采用放免法（RIA）进行测定，试剂盒购自北京北方生物技术研究所。血糖（GLU）用葡萄糖氧化酶一过氧化物酶终点比色法，试剂盒购自卫生部上海生物制品研究所，使用美国贝克曼Cx-4型自动生化分析仪测定。溶菌酶含量测定所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。数据分析方法同“1.6.1”。
　　2 结果与分析
　　2.1 刀鲚PEPCK的序列及结构分析
　　如图1所示，通过RACE方法克隆获得的刀鲚PEPCK全长cDNA序列（GenBank登录号为KX345852）共2 394 bp，其中5′端UTR为201 bp，开放阅读框为1 872 bp，3′端UTR长度为321 bp，编码623个氨基酸（图1）。理论等电点为5.46，蛋白分子量为68.6 ku。其中包含73个碱性氨基酸（精氨酸+赖氨酸+组氨酸）和72个酸性氨基酸（天冬氨酸+谷氨酸）。刀鲚PEPCK蛋白二级结构主要包括α-螺旋（30.98%）、延伸链（21.19%）、β-转角（10.91%）以及随机卷曲（36.92%）。如图2所示，刀鲚PEPCK具有其特有的高度保守的与草酰乙酸结合结构域，还具有与三磷酸鸟苷及Mg2+结合的2个激酶基序结构。
　　2.2 刀鲚PEPCK的系统进化分析
　　使用Mega5.0软件构建的系统进化树（图3）分析结果表明，水产动物与哺乳动物PEPCK各自聚为一类。其中，刀鲚与大西洋鲱同属鲱形目，二者聚为一分支;花鲈与大黄鱼的PEPCK序列具有较近的遗传距离，二者聚为同一分支，而后依次与大菱鲆、罗非鱼、暗纹东方鲀、大西洋鲑、刀鲚与大西洋鲱、斑马鱼聚类。
　　2.3 刀鲚PEPCK基因的组织表达分析
　　2.3.1 刀鲚PEPCK基因在各组织中的差异表达分析。
　　在对刀鲚8个组织中开展的PEPCK实时荧光定量分析结果表明，PEPCK在肝、肠、脑、心、肾组织中均有表达。其中，在肝组织中的表达量最高，其次为肾和肠组织，且三者显著高于
　　其他组织，而其在脑中的表达量最低。PEPCK在各组织中的表达量从高到低依次为肝、肾、肠、心、脑（图4）。
　　2.3.2 饥饿作用下刀鲚肝组织中PEPCK基因的表达分析。
　　从图5可以看出，刀鲚肝组织中PEPCK表达水平在饥饿2 d后出现显著上升（P>0.05），而在饥饿8 d后略有下降，但仍显著高于饥饿前水平（P<0.05），至饥饿14 d后肝组织中PEPCK表达水平仍高于饥饿前水平（P>0.05），而在饥饿26～32 d肝中PEPCK表达水平出现显著下调表达（P<005）。
　　2.4 饥饿对刀鲚形态指标及血清激素、免疫指标的影响
　　由表2可知，在饥饿期，刀鲚体重逐渐下降，但差异不显著（P>0.05）。肝体比在饥饿26 d内有所下降，但差异不显著（P>0.05），直至饥饿32 d后出现显著下降（P<0.05）。血糖含量总体上也呈下降趋势，在饥饿8 d血糖含量出现大幅度下降，但差异不显著（P>0.05），此后有所回升，但在整个饥饿期间呈下降趋势。血清皮质醇含量在饥饿8 d出现显著升高（P<0.05），此后有所回落，至饥饿32 d仍高于对照组水平。血清溶菌酶含量直至饥饿应激持续26 d均无显著变化（P>0.05），但应激32 d出现显著降低。
　　3 讨论
　　3.1 刀鲚PEPCK的序列、结构及进化分析
　　磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶是糖异生过程中重要的限速酶，可催化草酰乙酸生成磷酸式丙酮酸。其具有保守的结构域，包括与草酰乙酸结合结构域以及与GTP结合的2个激酶基序[4，11-12]。该研究克隆所得刀鲚PEPCK序列具有上述保守结构，这也体现了PEPCK的结构保守性。通过与已报道的其他物种PEPCK序列构建系统进化树进行进化分析，结果表明鱼类与哺乳类分别聚为两大分支。刀鲚PEPCK序列与同属鲱形目的大西洋鲱具有最近的遗传距离。PEPCK的聚类结果并不似LPL结果，由淡水鱼和海水鱼分别聚类，而是淡水鱼与海水鱼的PEPCK序列交错聚类。但哺乳动物与水产动物的PEPCK最终分别聚群。总体来看，PEPCK的进化关系符合物种间的遗传关系，在水产动物与哺乳动物间具有一定差异，但在淡水鱼与海水鱼间PEPCK序列进化关系并非似物种间进化差异那样明显。
　　3.2 饥饿作用下刀鲚PEPCK对鱼体的调控作用
　　糖异生是指将一些非糖前体，包括乳酸、生糖氨基酸（如丙氨酸等）转变为葡萄糖，以维持机体血糖恒定同时为机体提供能量所需。糖异生作用也是生物体在饥饿期间的关键供能方式，同时肝组织也是重要的糖异生场所，对于调节糖类代谢平衡发挥重要作用[15-17]。PEPCK可催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸，而最终形成葡萄糖，是糖异生作用的关键限速酶，在调节机体能量代谢上发挥重要作用[1-2]。该研究中刀鲚肝组织中PEPCK表达水平在饥饿2～14 d均出现上调表达，饥饿20～32 d出现下降，即在饥饿期间PEPCK表达水平有升降变化，但这仍体现了肝中PEPCK在促进糖异生作用、增强机体供能上所发挥的积极调节作用。
　　3.3 饥饿作用对刀鲚形态、血清生化指标的影响 　　饥饿作用下，鱼体通常首先动用糖类及脂类两类机体主要能源物质，加速其分解代谢，为机体提供能量，抵消由饥饿对机体造成的能量不足，以维持机体各项生命活动顺利进行[18]。肝脏是鱼体代谢的主要器官，也是诸多能源物质贮存及转化场所，对机体代谢调控发挥重要作用[19]。该研究中饥饿作用下刀鲚在饥饿26 d内均无显著变化，直至32 d后才出现显著下降，体现了饥饿期间在糖脂等能源物质代谢如此旺盛的情况下，仍努力维护这一组织的重要功能。血糖是重要能量供应者，因而恒定的血糖浓度对于维持鱼体各组织各项生理活动的正常进行发挥着重要作用。该研究中血糖浓度在饥饿32 d内总体呈平稳状态，仅在饥饿8 d时出现短暂显著下降后，此后又出现回升，这也是在饥饿作用下鱼体所采用的适应性调节方式。皮质醇是一种肾上腺皮质激素，对于生物体抵抗应激因子对机体的不利作用发挥着重要的调节作用，同时也是应激期的重要指示因子[20]。该研究中在整个饥饿期间刀鲚血清皮质醇水平出现了显著升高，这与钱云霞等[18]对鲈鱼开展的饥饿研究结果相一致，体现了皮质醇在抗饥饿胁迫中所发挥的积极调节作用。溶菌酶是一种重要的非特异性防御因子，也是鱼体生理防御水平的一个重要指示物[21]。该研究中溶菌酶水平在饥饿期间总体保持稳定水平，直至饥饿32 d才出现显著下降，体现了饥饿期间刀鲚鱼体免疫能力总体上保持稳定水平。
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