【摘 要】
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目的:构建高效表达幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)的原核表达系统,为Hp候选疫苗研制打下基础.方法:从Hp标准株NCTC11639 染色体DNA中扩增napA基因片段,T-A克隆后测序
【机 构】
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南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系,南方医科大学生物技术学院热带病学研究室,广州大学化学化工学院食品科学系
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目的:构建高效表达幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)的原核表达系统,为Hp候选疫苗研制打下基础.方法:从Hp标准株NCTC11639 染色体DNA中扩增napA基因片段,T-A克隆后测序,与GenBank公布的其他Hp菌株的napA基因序列进行比较.目的基因片段酶切后,与表达载体连接,转化至宿主菌,构建napA基因原核表达系统pGEX-4T-1-napA-E.coli Top10.优化诱导表达条件,采用SDS-PAGE鉴定表达产物,GST亲和层析纯化收集重组NAP蛋白,Western blot法鉴定重组NAP的免疫性;采用ELASA法检测胃癌患者Hp阳性血清中抗NAP抗体效价,通过间接ELASA法从29株小鼠抗Hp全菌单克隆抗体(mAb)中筛选抗Hp-NAP mAb.结果:所克隆的napA基因全长为435 bp,在GenBank上登录(No.DQ341279),与GenBank公布的其他Hp菌株的核苷酸同源性为94%～98%,与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97%,表达的NAP融合蛋白的相对分子质量(Mr)为44 000,1 mmol/L浓度IPTG诱导4 h表达产物量较高,表达产物可被Hp感染患者的血清及兔抗Hp全菌抗体特异性结合,胃癌患者血清中抗NAP抗体效价高于正常人群血清,29株小鼠抗Hp全菌mAb中有3株mAb能与NAP发生强免疫反应.结论:成功构建napA基因高效可溶性原核表达系统,重组NAP具有良好的免疫反应性,NAP在胃癌患者血清中高表达可能与胃癌的发病有关,NAP 是具有良好前景的抗原.
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