酶联免疫吸附试验(ELISA)注意事项

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   摘 要:本文主要探讨了酶联免疫吸附试验(ELISA)中常见的影响因素,对学生实验中常出现的问题进行原因分析,并总结解决办法。ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大,有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。
   关键词:酶联免疫;吸附试验;满版
   实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立,称为酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunsorbent assay),简称ELISA。原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记,以酶催化底物显色来判断结果。
   影响酶联免疫测定的因素较多,如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等,均可能对试验结果产生很大影响。只有避免这些因素,才能保证试验结果的准确性和可靠性。
   一、移液枪的使用
   我院免疫实验室常用手动单道移液器。注意事项:(1)吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;(2)若容量瓶中的液体太少,可倒入ep管中,方便吸取;(3)严格精确调节方法;(4)安装枪头要垂直插入,左右轻微转动上紧,上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;(5)垂直吸液,枪头吸嘴尖端需浸入液面2~4mm以下,一般液体,正向吸液1~2档,粘稠液可反向吸液2~1档,缓慢吸取,控制好弹簧的伸缩速度,太快会产生反冲和气泡,吸取后将移液枪提离液面,停顿1秒钟,观察是否有液滴流出,若有流出,说明有漏气现象;(6)放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10~400倾斜,平稳把按钮压到1档,停约一秒钟到2档,排出剩余液体。
   吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指,不能突然松开,以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。
   移液枪应轻拿轻放,不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。
   不要将按钮旋转出量程,否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程,让弹簧恢复原形,可延长使用寿命;定期对移液枪校准。
   二、加样
   加样不可太快,要避免加在孔壁上部。不可溅出和产生气泡,如有气泡,抗原抗体不能有效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。
   三、温育
   ELISA属于固相免疫测定,抗原和抗体必须在一定温度条件下反应一定的时间,微孔板从室温至恒温箱升至37℃,也需要一定时间。而在临床实验中很少人注意这个问题,通常以放入温箱即开始计时,这样弱阳性样本测不出来,为避免蒸发,板上应封盖。
   四、洗版
   在实验室中,ELISA测定的洗版一般有两种方式,即手工和洗板机洗版,用洗板机洗版结果准确可靠。
   五、显色
   一般显色反应条件为37或室温反应15~30分钟。在一定时间内,阴性孔可保持无色,而阳性孔随时间的延长而呈色加强,加TMB作用后,2小时可完全消退至无色。
   六、比色
   ELISA比色用酶标仪进行,应注意:
   酶标仪不应放置在强光照射下,使用前先预热15~30分钟。波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确,通常我们在软件选项中选择双波长比色,它是在敏感波长450nm和非敏感波长630nm下两次吸光度的差值。
   七、ELISA实际操作中常见问题和解决办法
   1.显色淡,灵敏度低
   实验前试剂盒至于室温30分钟以上,保温期内不宜多开门。换用合格的蒸馏水,不要使用过期试剂。
   2.满版白,阳性对照不显色
   严格按照试剂说明书操作,加液时看准标签。选用洁净量筒,正确稀释洗涤液,不要漏加试剂。
   3.满板显色
   显色时应避免保温,调准培养箱温度。样品应新鲜,长期保存在-20℃冷冻保存。防止污染,孵育时贴封片或加盖,洗涤要充分。
   八、结论
   酶联免疫吸附试验以灵敏度高、特异性好等特点,在临床上得到了广泛应用,严谨的设计、优质的试剂、良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件,严格遵照规定操作,必能得出准确的结果。
  参考文献:
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