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肖 斌
[摘要]目的：通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成脂分化能力，探索MSCs体外分离和纯化的较好方法。方法：应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs，并通过MTT法检测其增殖活性，用第三代MSCs进行成脂诱导，以观察两种方法所获MSCs的成脂分化能力。结果：密度梯度离心法所获MSCs纯度高，呈纺缍形或小三角形，增殖快，约7～10天融合：贴壁筛选法分离的原代细胞中红细胞。破骨细胞等杂质细胞较多，增殖速度相对较慢，且经数次传代仍有较多杂质细胞存在，经成脂诱导后，两种方法所获MSCs表现出相似的成脂能力，油红O染色细胞计数值与光密度值比较两组无显著差异(P值>0．05)。结论：密度梯度离心法是体外分离和纯化MSCs较好的方法，所获细胞增殖活性高，与贴壁筛选法所获MSCs具有相似的成脂分化能力。
[关键词]骨髓间充质干细胞；细胞培养；成脂分化；组织工程
[中图分类号]Q2－06 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01－0021－04
骨髓间充质干细胞(mesenchy mal stem cell，MSCs)具有来源广泛，容易获取，创伤小，无免疫排斥反应，细胞处于未分化状态，增殖能力强，易于培养和自体移植，不存在伦理、道德和法律争议问题，克服了胚胎干细胞的弊端，其所具有的独特优势在组织工程研究中具有广阔的应用前景。MSCs可以直接从自体骨髓腔抽吸或松质骨获得，可作为组织工程中构建组织的种子细胞。MSCs常用的分离方法有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。由于流式细胞仪分选法步骤比较繁琐，现在分离MSCs最常用的方法是贴壁筛选法和密度梯度离心法。本研究采用密度梯度离心法和贴壁法分离MSCs，并进行体外培养，通过比较所获得MSCs的细胞纯度、增殖活力及成脂能力，以寻求一种较为理想的体外分离、纯化与培养MSCs的方法。
1 材料和方法
1．1材料：实验动物为体重(100+20)g的2月龄雄性SD大鼠(兰州军区兰州总医院实验动物科)。MEM(Gibco BRL公司)，胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，IBMX(Sigma公司)，CO2恒温培养箱(Heracell，德国)，超净工作台(杭州净化有限公司)，倒置相差显微镜(Olympus公司)。
1．2方法
1．2．1大鼠MSCs的分离、纯化1．2．1．1贴壁法：将SD大鼠拉颈处死，75％酒精浸泡15～20min，无菌条件下取胫骨和股骨，将其两端干骺端切除，显露骨髓腔，用含10％FBS的MEM彻底冲洗骨髓腔，无菌注射器反复吹打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散制成单细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度，按2×109／cm2密度置于培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中培养。
1．2．1．2密度梯度离心法：取骨髓方法同上，将所获骨髓单细胞悬液800×g离心5min，去除上部的脂肪层，将余下部分加入含有1．073g/ml的percoll分离液中2500×g离心25mim；吸取中间层的单个核细胞，用培养基MEM洗涤2次，重新悬起细胞，细胞计数，调整细胞密度后，按2×109／cm2,置于培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中培养。
1．2．2细胞传代：细胞长至70％～80％融合时，以0．25％的胰蛋白酶消化，1×105／cm2密度进行接种。1．2。3增殖特性：取第1代细胞培养，经0．25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，按1×105细胞／孔接种于96孔板。从接种后第1天起分别于第1．3．5．7．9．11天取6个时间点用MTT法检测细胞增殖活性。用酶标仪在630nm波长下检测每孔的光吸收值(OD)，并绘制生长曲线。
1．2．4定向诱导大鼠MSCs向脂肪细胞分化：细胞接近完全融合后，加入含1μmol／L的地塞米松，0．5mmol／L的IBMX，1μmol／ml的人胰岛素，1μmol／ml吲哚美辛，10％FBS的MEM(诱导培养液)培养3～4天换液。
1．2．5特异性脂肪细胞染色鉴定：爬片细胞用PBS冲洗2遍，10％福尔马林固定30 min，60％异丙醇固定30min，油红O染液1h，60％异丙醇固定30min，蒸馏水冲洗弃液，显微镜下观察拍照，随机记数10个非重复视野内脂肪细胞占总细胞数的比例。
1．2．6油红O染色定量：将P3代长至接近完全融合后加入含脂肪诱导剂的培养液，第14天油红O染色(方法同上)后用蒸馏水冲洗后吹干，各培养皿加入同等量的异丙醇，充分震荡摇匀后，将液体离心取上清放入比色杯中进行光吸收值测定，通过光密度值推断脂肪细胞的数量。
1．2．7数据统计：所有数据均用x±s表示。使用SPSS11．0统计软件对数据进行分析。两组(密度梯度法组与贴壁法组)之间的比较用t检验，P值＜0．05为有统计学意义。
2 结果
2．1原代和传代培养的大鼠MSCs的形态学观察
2．2．1贴壁法所获得的原代MSCs：于细胞生长至第3天可见贴壁细胞形态各异，并夹杂大量的红细胞：经第一次换液后，细胞增殖加快，其增殖速度明显快于密度梯度离心法。约第6天细胞达70％～80％融合，并形成多种细胞形态的增殖集落。细胞以多角和长梭形为主，并有较多的细胞呈圆形及其它不规则形态，并带有树枝状突起，其间也可见许多红细胞以及形体较大、含有多个核的破骨样和巨嗜细胞样细胞。经2～3次传代后细胞以长梭形和三角形的为主(见图1)。
2．2．2密度梯度离心法所获原代MSCs：于细胞生长第3天时，可见许多贴壁细胞，并均匀分散生长；细胞以小三角形、梭形贴壁生长，胞核位于中央，其间夹杂少量有核的淋巴细胞，红细胞极少见。第一次换液培养后，细胞增殖迅速，圆形贴壁细胞的数量明显减少，梭形细胞的分裂速度明显较快，在数量上占据优势，培养5～7天后，培养细胞开始迅速增殖，细胞形态开始出现较大变化，可见纺缍形和星形多突起的细胞贴壁生长。10～14天时，细胞已达到70％～80％融合，进行传代。传代后的细胞增殖活力强，形成均一的长梭形、多角形细胞，一般培养5～8天，培养细胞达到70％～80％融合，再次进行传代(见图2)。
2．3 MSCs的生长曲线：两组细胞MTT检测显示：密度梯度离心法所获骨髓间充质干细胞子第1天OD值较高：从第3天起细胞迅速增殖，进入指数增长期；第7天起增殖速度明显减慢，进入平台期；而贴壁法所获骨髓间充质干细胞第1天OD值明显低于密度梯度离心法：细胞从第3天起增殖加快，进 入指数增长期，增殖速度低于前一组：至第9天，细胞增殖明显减慢进入下台期(见图3)
2．4大鼠MSCs定向诱导脂肪细胞：两种方法所分离的细胞加入诱导培养液后，第3天在相差显微镜下可观察到细胞胞质内有高折光性的小脂滴出现主要集中于细胞核周围，随着诱导时间的延长细胞内脂滴逐渐增多，胞内小脂滴逐渐聚集成大脂滴，细胞体积逐渐增大由原来的长梭形变为圆形或多角形，脂肪细胞中含大小不等的脂肪滴，脂滴被染成橙红色证实诱导成脂肪细胞，而未诱导的对照组细胞则表现为阴性(见图4、5)。每组随机选取5枚盖玻片，对两种方法所获骨髓间充质干细胞做油红O染色后的脂肪细胞计数比较，结果密度梯度离心法和贴壁法的均值分别为(62．73±2．92)和(59．63±4．53)，经t检验显示两组细胞之间无显著差异(P=1．39＞>0．05)。
2．5油红O染色定量试验：对两种方法所获骨髓间充质干细胞做油红O染色光密度值测定比较，结果密度梯度离心法和贴壁法的均值分别为(0．28±0．14)和(1．01±0．99)，经t检验显示两组之间无显著差异(P=0．191＞0．05)。
3 讨论
1986年Friedenstein等首次报道，骨髓标本中的小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化成骨细胞，成软骨细胞，脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过20～30个培养周期仍能保持其多向分化潜能，这类细胞被称之为MSCs。
MSCs内存在有几套可以向几种终未细胞分化的储备基因，当某种因素在一定条件下对它进行作用时，就会诱导相应系列基因的表达，使细胞向这一方向分化。不同的研究者根据各自的结果，提出了不同的假说，伴随着人们对MSCs更深入的研究与认识，MSCs的多向分化机制会逐渐被人们所了解。Lee等证实MSCs是脂肪移植较好的细胞来源。MSCs具有多向分化潜能，易诱导为成熟细胞，来源丰富，可塑性强等特点。最大特色是可实现个体化治疗，可以冷冻保存，方便临床使用，无免疫排斥问题，但是MSCs只占整个骨髓中有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加而减少，同时骨髓还含有其它多种细胞成分，因此至今尚无一个理想的获取较高纯度MSCs的分离、纯化及体外扩增方案。
本研究对密度梯度离心及贴壁筛选法分离大鼠骨髓间充质干细胞的纯度及增殖特性进行了比较，发现贴壁法虽然简单，但所获细胞成分复杂，细胞纯度不足，其中可见许多红细胞以及形体较大、含有多个核的破骨样和巨嗜细胞样细胞。经多次传代仍可见较多杂质细胞存在，且增殖活力相对较低，对细胞纯度要求较高的组织工程来说作为种子细胞并不是很理想。密度梯度离心法分离的骨髓间充质干细胞杂质细胞少，细胞活力强，增殖速度快，原代细胞可形成均一的增殖集落，并能稳定传代，保持其多项分化潜能的特性。该结果与多数文献相一致，说明密度梯度离心法是目前分离纯化MSCs的较好方法。
油红O染色是检测脂肪细胞的特异性方法，而MSCs要作为脂肪组织工程的种子细胞，首先要分化成脂肪细胞。在本研究中通过应用地塞米松，IBMX，人胰岛素，吲哚美辛诱导，两种方法获得的MSCs于诱导14天后，油红O染色多数细胞均呈阳性，而未诱导的对照组均表现为阴性。两种方法所获得的骨髓间充质干细胞所形成的脂滴数量经统计学分析无显著性差异，说明两种方法所分离的细胞在成脂诱导条件下向成脂肪分化的能力是相似的。
综上所述，密度梯度离心法是体外分离、纯化MSCs的良好方法，应用此方法分离纯化MSCs可用于组织工程学研究。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
[摘要]目的：通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成脂分化能力，探索MSCs体外分离和纯化的较好方法。方法：应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs，并通过MTT法检测其增殖活性，用第三代MSCs进行成脂诱导，以观察两种方法所获MSCs的成脂分化能力。结果：密度梯度离心法所获MSCs纯度高，呈纺缍形或小三角形，增殖快，约7～10天融合：贴壁筛选法分离的原代细胞中红细胞。破骨细胞等杂质细胞较多，增殖速度相对较慢，且经数次传代仍有较多杂质细胞存在，经成脂诱导后，两种方法所获MSCs表现出相似的成脂能力，油红O染色细胞计数值与光密度值比较两组无显著差异(P值>0．05)。结论：密度梯度离心法是体外分离和纯化MSCs较好的方法，所获细胞增殖活性高，与贴壁筛选法所获MSCs具有相似的成脂分化能力。
[关键词]骨髓间充质干细胞；细胞培养；成脂分化；组织工程
[中图分类号]Q2－06 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01－0021－04
骨髓间充质干细胞(mesenchy mal stem cell，MSCs)具有来源广泛，容易获取，创伤小，无免疫排斥反应，细胞处于未分化状态，增殖能力强，易于培养和自体移植，不存在伦理、道德和法律争议问题，克服了胚胎干细胞的弊端，其所具有的独特优势在组织工程研究中具有广阔的应用前景。MSCs可以直接从自体骨髓腔抽吸或松质骨获得，可作为组织工程中构建组织的种子细胞。MSCs常用的分离方法有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。由于流式细胞仪分选法步骤比较繁琐，现在分离MSCs最常用的方法是贴壁筛选法和密度梯度离心法。本研究采用密度梯度离心法和贴壁法分离MSCs，并进行体外培养，通过比较所获得MSCs的细胞纯度、增殖活力及成脂能力，以寻求一种较为理想的体外分离、纯化与培养MSCs的方法。
1 材料和方法
1．1材料：实验动物为体重(100+20)g的2月龄雄性SD大鼠(兰州军区兰州总医院实验动物科)。MEM(Gibco BRL公司)，胎牛血清(兰州民海生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，IBMX(Sigma公司)，CO2恒温培养箱(Heracell，德国)，超净工作台(杭州净化有限公司)，倒置相差显微镜(Olympus公司)。
1．2方法
1．2．1大鼠MSCs的分离、纯化1．2．1．1贴壁法：将SD大鼠拉颈处死，75％酒精浸泡15～20min，无菌条件下取胫骨和股骨，将其两端干骺端切除，显露骨髓腔，用含10％FBS的MEM彻底冲洗骨髓腔，无菌注射器反复吹打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散制成单细胞悬液，细胞计数，调整细胞密度，按2×109／cm2密度置于培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中培养。
1．2．1．2密度梯度离心法：取骨髓方法同上，将所获骨髓单细胞悬液800×g离心5min，去除上部的脂肪层，将余下部分加入含有1．073g/ml的percoll分离液中2500×g离心25mim；吸取中间层的单个核细胞，用培养基MEM洗涤2次，重新悬起细胞，细胞计数，调整细胞密度后，按2×109／cm2,置于培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中培养。
1．2．2细胞传代：细胞长至70％～80％融合时，以0．25％的胰蛋白酶消化，1×105／cm2密度进行接种。1．2。3增殖特性：取第1代细胞培养，经0．25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，按1×105细胞／孔接种于96孔板。从接种后第1天起分别于第1．3．5．7．9．11天取6个时间点用MTT法检测细胞增殖活性。用酶标仪在630nm波长下检测每孔的光吸收值(OD)，并绘制生长曲线。
1．2．4定向诱导大鼠MSCs向脂肪细胞分化：细胞接近完全融合后，加入含1μmol／L的地塞米松，0．5mmol／L的IBMX，1μmol／ml的人胰岛素，1μmol／ml吲哚美辛，10％FBS的MEM(诱导培养液)培养3～4天换液。
1．2．5特异性脂肪细胞染色鉴定：爬片细胞用PBS冲洗2遍，10％福尔马林固定30 min，60％异丙醇固定30min，油红O染液1h，60％异丙醇固定30min，蒸馏水冲洗弃液，显微镜下观察拍照，随机记数10个非重复视野内脂肪细胞占总细胞数的比例。
1．2．6油红O染色定量：将P3代长至接近完全融合后加入含脂肪诱导剂的培养液，第14天油红O染色(方法同上)后用蒸馏水冲洗后吹干，各培养皿加入同等量的异丙醇，充分震荡摇匀后，将液体离心取上清放入比色杯中进行光吸收值测定，通过光密度值推断脂肪细胞的数量。
1．2．7数据统计：所有数据均用x±s表示。使用SPSS11．0统计软件对数据进行分析。两组(密度梯度法组与贴壁法组)之间的比较用t检验，P值＜0．05为有统计学意义。
2 结果
2．1原代和传代培养的大鼠MSCs的形态学观察
2．2．1贴壁法所获得的原代MSCs：于细胞生长至第3天可见贴壁细胞形态各异，并夹杂大量的红细胞：经第一次换液后，细胞增殖加快，其增殖速度明显快于密度梯度离心法。约第6天细胞达70％～80％融合，并形成多种细胞形态的增殖集落。细胞以多角和长梭形为主，并有较多的细胞呈圆形及其它不规则形态，并带有树枝状突起，其间也可见许多红细胞以及形体较大、含有多个核的破骨样和巨嗜细胞样细胞。经2～3次传代后细胞以长梭形和三角形的为主(见图1)。
2．2．2密度梯度离心法所获原代MSCs：于细胞生长第3天时，可见许多贴壁细胞，并均匀分散生长；细胞以小三角形、梭形贴壁生长，胞核位于中央，其间夹杂少量有核的淋巴细胞，红细胞极少见。第一次换液培养后，细胞增殖迅速，圆形贴壁细胞的数量明显减少，梭形细胞的分裂速度明显较快，在数量上占据优势，培养5～7天后，培养细胞开始迅速增殖，细胞形态开始出现较大变化，可见纺缍形和星形多突起的细胞贴壁生长。10～14天时，细胞已达到70％～80％融合，进行传代。传代后的细胞增殖活力强，形成均一的长梭形、多角形细胞，一般培养5～8天，培养细胞达到70％～80％融合，再次进行传代(见图2)。
2．3 MSCs的生长曲线：两组细胞MTT检测显示：密度梯度离心法所获骨髓间充质干细胞子第1天OD值较高：从第3天起细胞迅速增殖，进入指数增长期；第7天起增殖速度明显减慢，进入平台期；而贴壁法所获骨髓间充质干细胞第1天OD值明显低于密度梯度离心法：细胞从第3天起增殖加快，进 入指数增长期，增殖速度低于前一组：至第9天，细胞增殖明显减慢进入下台期(见图3)
2．4大鼠MSCs定向诱导脂肪细胞：两种方法所分离的细胞加入诱导培养液后，第3天在相差显微镜下可观察到细胞胞质内有高折光性的小脂滴出现主要集中于细胞核周围，随着诱导时间的延长细胞内脂滴逐渐增多，胞内小脂滴逐渐聚集成大脂滴，细胞体积逐渐增大由原来的长梭形变为圆形或多角形，脂肪细胞中含大小不等的脂肪滴，脂滴被染成橙红色证实诱导成脂肪细胞，而未诱导的对照组细胞则表现为阴性(见图4、5)。每组随机选取5枚盖玻片，对两种方法所获骨髓间充质干细胞做油红O染色后的脂肪细胞计数比较，结果密度梯度离心法和贴壁法的均值分别为(62．73±2．92)和(59．63±4．53)，经t检验显示两组细胞之间无显著差异(P=1．39＞>0．05)。
2．5油红O染色定量试验：对两种方法所获骨髓间充质干细胞做油红O染色光密度值测定比较，结果密度梯度离心法和贴壁法的均值分别为(0．28±0．14)和(1．01±0．99)，经t检验显示两组之间无显著差异(P=0．191＞0．05)。
3 讨论
1986年Friedenstein等首次报道，骨髓标本中的小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化成骨细胞，成软骨细胞，脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过20～30个培养周期仍能保持其多向分化潜能，这类细胞被称之为MSCs。
MSCs内存在有几套可以向几种终未细胞分化的储备基因，当某种因素在一定条件下对它进行作用时，就会诱导相应系列基因的表达，使细胞向这一方向分化。不同的研究者根据各自的结果，提出了不同的假说，伴随着人们对MSCs更深入的研究与认识，MSCs的多向分化机制会逐渐被人们所了解。Lee等证实MSCs是脂肪移植较好的细胞来源。MSCs具有多向分化潜能，易诱导为成熟细胞，来源丰富，可塑性强等特点。最大特色是可实现个体化治疗，可以冷冻保存，方便临床使用，无免疫排斥问题，但是MSCs只占整个骨髓中有核细胞的十万分之一，并随年龄的增加而减少，同时骨髓还含有其它多种细胞成分，因此至今尚无一个理想的获取较高纯度MSCs的分离、纯化及体外扩增方案。
本研究对密度梯度离心及贴壁筛选法分离大鼠骨髓间充质干细胞的纯度及增殖特性进行了比较，发现贴壁法虽然简单，但所获细胞成分复杂，细胞纯度不足，其中可见许多红细胞以及形体较大、含有多个核的破骨样和巨嗜细胞样细胞。经多次传代仍可见较多杂质细胞存在，且增殖活力相对较低，对细胞纯度要求较高的组织工程来说作为种子细胞并不是很理想。密度梯度离心法分离的骨髓间充质干细胞杂质细胞少，细胞活力强，增殖速度快，原代细胞可形成均一的增殖集落，并能稳定传代，保持其多项分化潜能的特性。该结果与多数文献相一致，说明密度梯度离心法是目前分离纯化MSCs的较好方法。
油红O染色是检测脂肪细胞的特异性方法，而MSCs要作为脂肪组织工程的种子细胞，首先要分化成脂肪细胞。在本研究中通过应用地塞米松，IBMX，人胰岛素，吲哚美辛诱导，两种方法获得的MSCs于诱导14天后，油红O染色多数细胞均呈阳性，而未诱导的对照组均表现为阴性。两种方法所获得的骨髓间充质干细胞所形成的脂滴数量经统计学分析无显著性差异，说明两种方法所分离的细胞在成脂诱导条件下向成脂肪分化的能力是相似的。
综上所述，密度梯度离心法是体外分离、纯化MSCs的良好方法，应用此方法分离纯化MSCs可用于组织工程学研究。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。