论文部分内容阅读
摘要 [目的]对侵染蝴蝶兰和文心兰的辣椒褪绿病毒进行田间调查，并进行分子鉴定，为广东顺德花卉顺利出口提供技术支持和把关服务。[方法]根据辣椒褪绿病毒的一对特异性引物核壳体（nucleocapsid，N）基因，应用RT-PCR检测方法对2种兰花疑似感染病毒的植株进行分子鉴定。[结果]蝴蝶兰（样品编号2、3、5和10）和文心兰（样品编号6）感染辣椒褪绿病毒，系统进化树表明2种兰花感染的辣椒褪绿病毒与该病毒泰国分离物以较高的后验概率聚为同一类群。[结论]辣椒褪绿病毒已在广东顺德的蝴蝶兰和文心兰上发生危害，且文心兰感染辣椒褪绿病毒为国内首次报道，出口企业需加强检疫监控工作。
关键词 蝴蝶兰;文心兰;辣椒褪绿病毒;鉴定
中图分类号 S41文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）04-0117-03
Abstract [Objective]Field investigation and molecular identification of CaCV infected with Phalaenopsis and Oncidium were conducted， to provide technical supports and security services for the smooth export of flowers in Shunde， Guangdong. [Method]Based on the nucleocapsid （N） gene of a pair of specific primers of CaCV， the two species of orchids with suspected virus infection were identified by RTPCR. [Result] Phalaenopsis （sample No. 2， 3， 5 and 10） and Oncidium （sample No. 6） were infected with CaCV. Phylogenetic tree showed that the two orchids infected with CaCV and the Thai isolate of the virus were clustered into the same group with higher posterior probability. [Conclusion]Capiscum chlorosis virus has been harmful in Phalaenopsis and Oncidium in Shunde， Guangdong Province， the infection of Oncidium with CaCV is the first reported in China. Export enterprises need to strengthen quarantining and monitoring work.
Key words Phalaenopsis;Oncidium;CaCV;Identification
蝴蝶兰（Phalaenopsis sp）能开出形如蝴蝶飞舞般的花朵，深受花迷們的青睐，素有“洋兰王后”之称。文心兰（Oncidium sp）花朵奇异可爱，形似飞翔的金蝶，极富动感，是世界重要的盆花和切花种类之一，又称“吉祥兰”。然而，近年来随着兰花国内外贸易和种质交流频率的增加，兰花病毒病的发生有蔓延趋势，对兰花产量和品质产生了严重影响。目前，至少有57种病毒可感染兰科植物[1]。2008年，中国台湾地区首次报道辣椒褪绿病毒（Capiscum chlorosis virus，CaCV）侵染蝴蝶兰品种[2]，国内仅有辣椒褪绿病毒侵染蝴蝶兰的报道[3-4]，鲜见该病毒侵染文心兰的文献报道。广东顺德，素称“千年花乡”，被业内称为花卉业的“圣地”，2015年成功创建国家级出口种苗花卉质量安全示范区，区内种植及出口花卉种类繁多，品质优良，特别是蝴蝶兰、文心兰等兰花出口量排全国前列。为了有效地应对进口国对顺德出口兰花的植物检疫措施，应尽早检出感病兰花植株并实施销毁，避免兰花出口受到影响。笔者根据辣椒褪绿病毒的一对特异性引物核壳体（nucleocapsid，N）基因，应用RT-PCR检测方法鉴定侵染蝴蝶兰和文心兰的辣椒褪绿病毒，以期为出口花卉企业提供技术支持和保障。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 疑似病株样品的采集。于2018年4—8月，先后4次在顺德多家花卉种植基地开展了蝴蝶兰、文心兰的病毒病害调查，采用田间调查与访问有经验的花农等形式相结合。选取普查点，覆盖调查点面积的80%以上。采用2种调查方法：①简单随机取样法，利用随机数字表或非主观地抽取一个随机样本，适用于有害生物分布比较均匀的地块;②系统取样法（顺序取样法），在调查区内按一定的间隔抽取一个取样单位，包括等距离平行取样、对角线取样等。常采用五点取样法，每点不少于20株。采集具有疑似病毒病症状的蝴蝶兰和文心兰全株或部分组织，主要是植株叶片，详细记录病害发生部位和危害程度，系统描述病害发生的症状。拍摄照片，并将感病标本携回实验室进行进一步处理与病原鉴定。
1.1.2 材料。RNA及DNA提取试剂盒、PCR产物胶回收试剂盒、PCR试剂和DNA Marker均购于美津生物技术公司;其他生化和普通化学试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 核酸抽提。采用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒，依照产品说明书所示步骤抽提样品总RNA，-20 ℃保存备用。利用常规的CTAB法对样品进行总DNA抽提[5-6]，-20 ℃保存备用。 1.2.2 病毒引物的设计。根据GenBank数据库CaCV的核壳体蛋白基因的保守序列分别设计引物。上游引物ac-1：5′-AGAGCAATCGGGGC-3′，下游引物ac-2：5′-GTTCTAGCAAAAGCACCT-3′，预计扩增产物864 bp。
1.2.3 RT-PCR和PCR扩增及电泳观察。以感病组织总RNA为模板，采用RT-PCR试剂盒提供的一步法进行RT-PCR扩增。RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中观察扩增结果。
RT-PCR扩增程序如下：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环;72 ℃延伸10 min。
1.2.4 测序结果分析。对电泳目的条带切割回收，送北京奥科生物技术公司进行测序。登录NCBI官网，将测序结果输入BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行相似性比对。根据相似性确定病毒种类，再进一步利用Mega5.1软件对核苷酸序列进行多序列分析比较和构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 蝴蝶兰和文心兰病毒病危害症状
由图1可知，疑似感染病毒病的2种兰花病害症状主要表现在叶片，一般在叶片上出现斑驳、花叶、坏死或斑点，少量植株表现为无症状，初步统计发病率约为10%。
2.2 蝴蝶兰与文心兰病毒种类的分子检测
以反转录得到的总DNA为模板，将图1疑似感病的全部样品用CaCV的特异性引物核壳体基因进行PCR检测，从表现典型症状的蝴蝶兰（样品编号2、3、5和10）和文心兰（样品编号6）中扩增得到大小为864 bp左右的条带，与感染CaCV的阳性对照扩增结果一致（图2）。结果表明采集的蝴蝶兰和文心兰的上述5个样品可能被CaCV侵染危害，2种兰花的其他疑似感病植株未被CaCV侵染。
2.3 蝴蝶兰与文心兰CaCV顺德分离物部分序列分析
将PCR扩增获得的约864 bp的片段进行纯化，并对电泳目的条带切割回收和测序。经BLAST程序nucleotide blast进行序列相似性检索和分析，结果表明检测为阳性的顺德2种兰花5个样品得到的病毒基因组部分序列与GenBank中CaCV泰国分离物（登录号FJ947156.1）同源率最高，为98%～99%。由图3可知，顺德2种兰花的5个样品确认感染CaCV，并且与CaCV泰国分离物以较高的后验概率聚为同一类群。序列聚类结果表明，在广东顺德蝴蝶兰和文心兰上发现的CaCV可能是由泰国传过来的。
3 结论与讨论
2017年，国际病毒分类委员会（ICTV）将布尼亚病毒科（Bunyaviridae）的番茄斑萎病毒属归类到新增的番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），属名由Tospovirus改为Orthotospovirus，该属现有11个确定种[7]，CaCV是西瓜银斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）的一个株系[8]，该病毒在蝴蝶兰和文心兰的传播途径为蓟马传播或无性繁殖传播[9-10]。Orthotospovirus病毒引起植物病害症状主要有坏死、褪绿、黄化环形病斑、银色、局部枯斑、矮化和斑驳。从症状表现看，在蝴蝶兰和文心兰上主要表现为斑驳、花叶、坏死或斑点等典型症状。
蝴蝶兰和文心兰感染CaCV后，观赏价值受到影响，甚至不能顺利出口，对于以出口为导向的顺德花卉种植企业尤为重要。目前在危害兰花的各类病害中，生物防治和化学防治对病毒病仍然无大的效果，因此对兰花病毒病的预防显得极为重要。
目前主要从以下几个方面对兰花的病毒病进行综合防治：①培育无毒种苗，大量种植无毒兰花种苗并采取有效的防护措施使种苗不被病毒侵染，从而繁育、生产无毒小苗;②加强植物检疫工作，从目前国内发现的兰花病毒基因序列分析结果可知，CyMV和ORSV分离物与荷兰、韩国、日本等地的分离物同源性很高[11]，因此加强口岸检疫意义重大;③加强对兰花种植基地蚜虫、飞虱、叶蝉、螨类和线虫等有害生物综合防治工作，这几类有害生物是传播病毒病的重要媒介生物，其能够将其他植物的病毒病傳染到兰花，造成兰花病毒病的蔓延扩散;④定期清园，销毁病叶、杂草、老叶等潜在病毒载体，对外人进入种植场所进行严格限制，降低将外界病毒带入兰花种植场的风险;⑤加强农业栽培措施，适当降低兰花种植密度，例如CymMV可以通过汁液传播，尽可能避免兰花植株叶片间的相互重叠和摩擦损伤，以减少病毒通过叶片伤口交叉感染[12]。
笔者通过核酸提取、PCR扩增、基因序列分析并构建系统进化树，确定了CaCV侵染广东顺德蝴蝶兰和文心兰这2种兰花品种，为花卉种植企业有效鉴别染病兰花植株提供技术支持，并为顺德兰花的顺利出口提供把关服务。
参考文献
[1] LEE C H，ZHENG Y X，JAN E J.The orchidinfecting viruses found in the 21st century[M]//CHEN W H，CHEN H W.Orchid biotechnology III.New Jersey：World Scientific，2015：145-157.
[2] ZHENG Y X，CHEN C C，YANG C J，et al.Identification and characterization of a tospovirus causing chlorotic ringspots on Phalaenopsis orchids[J].European journal of plant pathology， 2008，120（2）：199-209. [3] 程晓非，董家红，方琦，等.从云南蝴蝶兰上检测到番茄斑萎病毒属病毒[J].植物病理学报，2008，38（1）：31-34.
[4] 吴竹妍，刘勇，黎园，等.广州蝴蝶兰上检测到辣椒褪绿病毒[C]//郭泽建，侯明生.中国植物病理学会2011年学术年会论文集.北京：中国农业科学技术出版社，2011.
[5] HARRISON B D，LIU Y L，KHALID S，et al.Detection and relationships of cotton leaf curl virus and allied whiteflytransmitted geminiviuses occurring in Pakistan [J].Annals of applied biology，1997，130（1）：61-75.
[6] 左瑞娟.CTAB法在提取植物病原物核酸中的应用[J].文山学院学报，2012，25（3）：8-11.
[7] 唐霜，沈姝，史君明，等.布尼亞病毒目新分类概述[J].生物多样性，2018，26（9）：1004-1015.
[8] ZHENG Y X，CHEN C C，JAN F J.Complete nucleotide sequence of capsicum chlorosis virus isolated from Phalaenopsis orchid and the prediction of the unexplored genetic information of tospoviruses [J].Archives of virology，2011，156（3）：421-432.
[9] GERMAN T L，ULLMAN D E，MOYER J W.Tospoviruses：Diagnosis molecular biology，phylogeny，and vector relationships [J].Annual reviews of phytopathology，1992，30：315-348.
[10] 吴竹妍. 西瓜银斑驳病毒的分子特性及抗血清的制备[D].广州：华南农业大学，2012.
[11] 扆守鑫，谭冠林，李凡，等.云南部分兰花病毒病的病害调查及病原鉴定[J].云南农业大学学报，2008，23（3）：325-328.
[12] 刘黎卿，林志楷，郭莺.蝴蝶兰病毒病研究进展及防治对策综述[J].安徽农学通报，2010，16（24）：21-23，126.
关键词 蝴蝶兰;文心兰;辣椒褪绿病毒;鉴定
中图分类号 S41文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）04-0117-03
Abstract [Objective]Field investigation and molecular identification of CaCV infected with Phalaenopsis and Oncidium were conducted， to provide technical supports and security services for the smooth export of flowers in Shunde， Guangdong. [Method]Based on the nucleocapsid （N） gene of a pair of specific primers of CaCV， the two species of orchids with suspected virus infection were identified by RTPCR. [Result] Phalaenopsis （sample No. 2， 3， 5 and 10） and Oncidium （sample No. 6） were infected with CaCV. Phylogenetic tree showed that the two orchids infected with CaCV and the Thai isolate of the virus were clustered into the same group with higher posterior probability. [Conclusion]Capiscum chlorosis virus has been harmful in Phalaenopsis and Oncidium in Shunde， Guangdong Province， the infection of Oncidium with CaCV is the first reported in China. Export enterprises need to strengthen quarantining and monitoring work.
Key words Phalaenopsis;Oncidium;CaCV;Identification
蝴蝶兰（Phalaenopsis sp）能开出形如蝴蝶飞舞般的花朵，深受花迷們的青睐，素有“洋兰王后”之称。文心兰（Oncidium sp）花朵奇异可爱，形似飞翔的金蝶，极富动感，是世界重要的盆花和切花种类之一，又称“吉祥兰”。然而，近年来随着兰花国内外贸易和种质交流频率的增加，兰花病毒病的发生有蔓延趋势，对兰花产量和品质产生了严重影响。目前，至少有57种病毒可感染兰科植物[1]。2008年，中国台湾地区首次报道辣椒褪绿病毒（Capiscum chlorosis virus，CaCV）侵染蝴蝶兰品种[2]，国内仅有辣椒褪绿病毒侵染蝴蝶兰的报道[3-4]，鲜见该病毒侵染文心兰的文献报道。广东顺德，素称“千年花乡”，被业内称为花卉业的“圣地”，2015年成功创建国家级出口种苗花卉质量安全示范区，区内种植及出口花卉种类繁多，品质优良，特别是蝴蝶兰、文心兰等兰花出口量排全国前列。为了有效地应对进口国对顺德出口兰花的植物检疫措施，应尽早检出感病兰花植株并实施销毁，避免兰花出口受到影响。笔者根据辣椒褪绿病毒的一对特异性引物核壳体（nucleocapsid，N）基因，应用RT-PCR检测方法鉴定侵染蝴蝶兰和文心兰的辣椒褪绿病毒，以期为出口花卉企业提供技术支持和保障。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 疑似病株样品的采集。于2018年4—8月，先后4次在顺德多家花卉种植基地开展了蝴蝶兰、文心兰的病毒病害调查，采用田间调查与访问有经验的花农等形式相结合。选取普查点，覆盖调查点面积的80%以上。采用2种调查方法：①简单随机取样法，利用随机数字表或非主观地抽取一个随机样本，适用于有害生物分布比较均匀的地块;②系统取样法（顺序取样法），在调查区内按一定的间隔抽取一个取样单位，包括等距离平行取样、对角线取样等。常采用五点取样法，每点不少于20株。采集具有疑似病毒病症状的蝴蝶兰和文心兰全株或部分组织，主要是植株叶片，详细记录病害发生部位和危害程度，系统描述病害发生的症状。拍摄照片，并将感病标本携回实验室进行进一步处理与病原鉴定。
1.1.2 材料。RNA及DNA提取试剂盒、PCR产物胶回收试剂盒、PCR试剂和DNA Marker均购于美津生物技术公司;其他生化和普通化学试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 核酸抽提。采用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒，依照产品说明书所示步骤抽提样品总RNA，-20 ℃保存备用。利用常规的CTAB法对样品进行总DNA抽提[5-6]，-20 ℃保存备用。 1.2.2 病毒引物的设计。根据GenBank数据库CaCV的核壳体蛋白基因的保守序列分别设计引物。上游引物ac-1：5′-AGAGCAATCGGGGC-3′，下游引物ac-2：5′-GTTCTAGCAAAAGCACCT-3′，预计扩增产物864 bp。
1.2.3 RT-PCR和PCR扩增及电泳观察。以感病组织总RNA为模板，采用RT-PCR试剂盒提供的一步法进行RT-PCR扩增。RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中观察扩增结果。
RT-PCR扩增程序如下：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环;72 ℃延伸10 min。
1.2.4 测序结果分析。对电泳目的条带切割回收，送北京奥科生物技术公司进行测序。登录NCBI官网，将测序结果输入BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行相似性比对。根据相似性确定病毒种类，再进一步利用Mega5.1软件对核苷酸序列进行多序列分析比较和构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 蝴蝶兰和文心兰病毒病危害症状
由图1可知，疑似感染病毒病的2种兰花病害症状主要表现在叶片，一般在叶片上出现斑驳、花叶、坏死或斑点，少量植株表现为无症状，初步统计发病率约为10%。
2.2 蝴蝶兰与文心兰病毒种类的分子检测
以反转录得到的总DNA为模板，将图1疑似感病的全部样品用CaCV的特异性引物核壳体基因进行PCR检测，从表现典型症状的蝴蝶兰（样品编号2、3、5和10）和文心兰（样品编号6）中扩增得到大小为864 bp左右的条带，与感染CaCV的阳性对照扩增结果一致（图2）。结果表明采集的蝴蝶兰和文心兰的上述5个样品可能被CaCV侵染危害，2种兰花的其他疑似感病植株未被CaCV侵染。
2.3 蝴蝶兰与文心兰CaCV顺德分离物部分序列分析
将PCR扩增获得的约864 bp的片段进行纯化，并对电泳目的条带切割回收和测序。经BLAST程序nucleotide blast进行序列相似性检索和分析，结果表明检测为阳性的顺德2种兰花5个样品得到的病毒基因组部分序列与GenBank中CaCV泰国分离物（登录号FJ947156.1）同源率最高，为98%～99%。由图3可知，顺德2种兰花的5个样品确认感染CaCV，并且与CaCV泰国分离物以较高的后验概率聚为同一类群。序列聚类结果表明，在广东顺德蝴蝶兰和文心兰上发现的CaCV可能是由泰国传过来的。
3 结论与讨论
2017年，国际病毒分类委员会（ICTV）将布尼亚病毒科（Bunyaviridae）的番茄斑萎病毒属归类到新增的番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），属名由Tospovirus改为Orthotospovirus，该属现有11个确定种[7]，CaCV是西瓜银斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus，WSMoV）的一个株系[8]，该病毒在蝴蝶兰和文心兰的传播途径为蓟马传播或无性繁殖传播[9-10]。Orthotospovirus病毒引起植物病害症状主要有坏死、褪绿、黄化环形病斑、银色、局部枯斑、矮化和斑驳。从症状表现看，在蝴蝶兰和文心兰上主要表现为斑驳、花叶、坏死或斑点等典型症状。
蝴蝶兰和文心兰感染CaCV后，观赏价值受到影响，甚至不能顺利出口，对于以出口为导向的顺德花卉种植企业尤为重要。目前在危害兰花的各类病害中，生物防治和化学防治对病毒病仍然无大的效果，因此对兰花病毒病的预防显得极为重要。
目前主要从以下几个方面对兰花的病毒病进行综合防治：①培育无毒种苗，大量种植无毒兰花种苗并采取有效的防护措施使种苗不被病毒侵染，从而繁育、生产无毒小苗;②加强植物检疫工作，从目前国内发现的兰花病毒基因序列分析结果可知，CyMV和ORSV分离物与荷兰、韩国、日本等地的分离物同源性很高[11]，因此加强口岸检疫意义重大;③加强对兰花种植基地蚜虫、飞虱、叶蝉、螨类和线虫等有害生物综合防治工作，这几类有害生物是传播病毒病的重要媒介生物，其能够将其他植物的病毒病傳染到兰花，造成兰花病毒病的蔓延扩散;④定期清园，销毁病叶、杂草、老叶等潜在病毒载体，对外人进入种植场所进行严格限制，降低将外界病毒带入兰花种植场的风险;⑤加强农业栽培措施，适当降低兰花种植密度，例如CymMV可以通过汁液传播，尽可能避免兰花植株叶片间的相互重叠和摩擦损伤，以减少病毒通过叶片伤口交叉感染[12]。
笔者通过核酸提取、PCR扩增、基因序列分析并构建系统进化树，确定了CaCV侵染广东顺德蝴蝶兰和文心兰这2种兰花品种，为花卉种植企业有效鉴别染病兰花植株提供技术支持，并为顺德兰花的顺利出口提供把关服务。
参考文献
[1] LEE C H，ZHENG Y X，JAN E J.The orchidinfecting viruses found in the 21st century[M]//CHEN W H，CHEN H W.Orchid biotechnology III.New Jersey：World Scientific，2015：145-157.
[2] ZHENG Y X，CHEN C C，YANG C J，et al.Identification and characterization of a tospovirus causing chlorotic ringspots on Phalaenopsis orchids[J].European journal of plant pathology， 2008，120（2）：199-209. [3] 程晓非，董家红，方琦，等.从云南蝴蝶兰上检测到番茄斑萎病毒属病毒[J].植物病理学报，2008，38（1）：31-34.
[4] 吴竹妍，刘勇，黎园，等.广州蝴蝶兰上检测到辣椒褪绿病毒[C]//郭泽建，侯明生.中国植物病理学会2011年学术年会论文集.北京：中国农业科学技术出版社，2011.
[5] HARRISON B D，LIU Y L，KHALID S，et al.Detection and relationships of cotton leaf curl virus and allied whiteflytransmitted geminiviuses occurring in Pakistan [J].Annals of applied biology，1997，130（1）：61-75.
[6] 左瑞娟.CTAB法在提取植物病原物核酸中的应用[J].文山学院学报，2012，25（3）：8-11.
[7] 唐霜，沈姝，史君明，等.布尼亞病毒目新分类概述[J].生物多样性，2018，26（9）：1004-1015.
[8] ZHENG Y X，CHEN C C，JAN F J.Complete nucleotide sequence of capsicum chlorosis virus isolated from Phalaenopsis orchid and the prediction of the unexplored genetic information of tospoviruses [J].Archives of virology，2011，156（3）：421-432.
[9] GERMAN T L，ULLMAN D E，MOYER J W.Tospoviruses：Diagnosis molecular biology，phylogeny，and vector relationships [J].Annual reviews of phytopathology，1992，30：315-348.
[10] 吴竹妍. 西瓜银斑驳病毒的分子特性及抗血清的制备[D].广州：华南农业大学，2012.
[11] 扆守鑫，谭冠林，李凡，等.云南部分兰花病毒病的病害调查及病原鉴定[J].云南农业大学学报，2008，23（3）：325-328.
[12] 刘黎卿，林志楷，郭莺.蝴蝶兰病毒病研究进展及防治对策综述[J].安徽农学通报，2010，16（24）：21-23，126.