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代海丽（1986-），女，硕士研究生，讲师，主要从事病理学和病毒学相关研究。
摘要：目的：诱导表达柯萨奇B3病毒（CVB3）的VP1蛋白。
方法：针对CVB3基因的VP1区设计特异性引物，RT-PCR扩增VP1基因并将其克隆到pGEX-6p-1中，经IPTG诱导表达VP1蛋白。采用SDS-PAGE和Western blot检测VP1特异性蛋白的表达情况。
结果：SDS-PAG在相对分子量约54kD处可见目的条带，Western blot检测亦相对分子量约54kD处见到了清晰的蛋白条带。
结论：成功诱导表达了特异性较高的VP1蛋白。
关键词：柯萨奇B3病毒原核表达融合蛋白
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2013）11-0006-02
柯萨奇病毒B3（CVB3）属小RNA病毒科，肠道病毒属。流行病学调查显示，约50%的病毒性心肌炎与肠道病毒感染有关，特别是与CVB3的关系最为密切。同时，CVB3还会引起肝炎、胰腺炎和无菌性脑膜炎等疾病。近年来其发病呈上升趋势，但目前尚缺乏有效的防治措施。CVB3呈球形，直径约22～30nm，为单正链的RNA病毒，具有mRNA活性和感染性，全长为7397个核苷酸。依据其功能分，可分为5′端非编码区（5′-untranslated region，5′-UTR）、P1区、P2区、P3区、3′端非编码区（3′-UTR）和一个Poly（A）尾。P1区编码病毒的主要结构蛋白即衣壳蛋白，该区由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1蛋白为病毒的主要中和抗原。病毒的主要中和抗原位点位于VP1上，VP4序列高度保守，但不暴露在衣壳的外面，故不具有中和性抗原位点[1]。本研究将VP1基因插入pEGX-6p-1表达载体中，构建了pEGX-VP1重组质粒，并诱导表达了GST-VP1融合蛋白，从而为建立CVB3的免疫生物分析方法奠定基础。
1材料与方法
1.1材料。
1.1.1主要材料：CVB3由哈尔滨医科大学病原微生物实验室钟照华教授馈赠。
1.1.2抗体和试剂：pMD18-T载体、限制性内切酶、ExTaq购自宝生物工程（大连）有限公司；原核表达载体pEGX-6p-1为本实验室保存；山羊抗鼠HRP-IgG均购自中杉金桥生物技术有限公司；感受态E.coli BL21（DE3）购自天根生化科技有限公司；其他常用化学试剂为国产或进口分析纯。
1.2方法。
1.2.1引物的设计与合成：采用Primer Express 2.0软件，根据CVB3的核苷酸序列，在VP1区设计特异性引物VP1-F：5’-ATGCAGACACGCCACGTTAAG-3’，酶切位点为：BamHⅠ；VP1-R：5’-CGTATTTGTCATTGTAGTGAT-3’，酶切位点为：XhoⅠ，用于扩增VP1基因（702bp）。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.2.2VP1基因的扩增：用RNeasy Plus Mini RNA提取试剂盒（Qiagen），提取300μL CVB3病毒液的总RNA，溶于30μL RNase Free H2O中，并将其反转录成cDNA。用引物VP1-F和VP1-R进行PCR，特异性扩增CVB3的VP1基因。20μL PCR反应体系为：ddH2O11.7μL、10×buffer 2μL、dNTP 2μL、VP1-F 1μL、VP1-R 1μL、Taq酶 0.3μL、cDNA 2μL。反应条件为：95℃预变性5min，95℃ 30s、54.4℃ 30s、72℃ 20s共30个循环，最后延伸72℃ 10min。
1.2.3重组质粒pMD18-T-VP1的构建。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶纯化回收目的片段VP1，用限制性内切酶BamHⅠ和XHOⅠ分别对VP1和PMD18-T载体进行酶切，酶切正确后胶回收，并将VP1目的片段和PMD18-T载体进行连接，10μL连接体系为pMD-18T载体1μL、PCR胶回收产物VP14μL、SolutionI 5μL，16℃连接过夜后，克隆至pMD-18T载体，构建PMD18-T/VP1重组质粒，将重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，选取菌液PCR、酶切及测序正确（上海英骏生物技术有限公司）的阳性克隆。
1.2.4pEGX-VP1重组质粒的构建。用限制性内切酶BamH Ⅰ和XHOⅠ分别对PMD18-T/VP1重组质粒和pEGX-6P-1表达载体进行酶切，将酶切正确的VP1目的片段并将VP1目的片段和pEGX-6P-1原核表达载体16℃连接过夜后，克隆至pEGX-6P-1载体，构建6P-1/VP1原核表达质粒。转化后摇菌，PCR、酶切及测序正确（上海英骏生物技术有限公司）的阳性克隆即为需要的pEGX-VP1重组质粒。
1.2.5VP1蛋白的表达与纯化：将pEGX-VP1阳性克隆摇菌过夜，按1：100的比例接种于含有Ampicillin（100μg/mL）抗性的无菌LB液体培养基中，37℃摇菌扩增至OD值达到0.4时，加入IPTG使其终浓度为1.5mmol/L，37℃诱导5h。
1.2.6VP1蛋白的SDS-PAGE鉴定。将诱导表达的菌液，4℃离心4500r/min×10min，菌液沉淀用1/50体积的PBS悬起。超声破碎菌体，离心后分别得到全菌、上清和沉淀的蛋白样品，分别将上述蛋白样品按比例加入5×SDS Loading Buffer煮样，分别取样品进行SDS-PAGE电泳。80V缓慢电泳，使蛋白样品达到同一水平线上。待蛋白Marker条带分离明显后，以120 V电压电泳至溴酚兰行到达电泳槽下端。后将胶慢慢地拿起放入盛有考马斯亮蓝R250染色液的平皿中，室温下，旋转摇床上摇动染色1h左右，蛋白胶染好色后，将胶取出，用蒸馏水将蛋白胶冲洗2次，后放入盛有脱色液的平皿中，室温下，旋转摇床上摇动脱色1～2h，能清楚的看见蛋白条带时，可停止脱色，蛋白胶可用蒸馏水浸泡后在凝胶成像系统进行拍照。以鉴定VP1目的蛋白有无表达及目的蛋白的存在形式。 1.2.7VP1蛋白的Western blot鉴定。将获得的全菌、上清和沉淀的蛋白样品，分别取样品进行SDS-PAGE电泳后，将凝胶蛋白带电转移至硝酸纤维素膜上，脱脂乳37℃封闭2h。洗膜后按1∶2000稀释GST单抗，37℃孵育1h。洗膜后加HRP标记的山羊抗鼠IgG（1∶5000稀释），37℃孵育1h，洗涤，经ECL显色后扫膜。
2结果
2.1VP1基因的PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳表明，用所合成的特异性引物VP1-F和VP1-R进行PCR扩增，在约702bp处有一特异性条带，与预期目的片段长度一致，测序结果表明其序列与GenBank公布的CVB3序列一致。
2.2PMD18-T/VP1重组质粒的鉴定。重组质粒PMD18-T/VP1菌液PCR和酶切后经琼脂糖电泳可见与预期大小相符的条带。菌液测序结果与目的片段序列一致性为100%。
2.3重组质粒pGEX-VP1的鉴定。重组质粒pGEX-VP1菌液PCR和酶切后经琼脂糖电泳在702bp处可见与预期大小相符的条带（图1）。菌液测序结果与目的片段序列一致率为100%。
2.4原核蛋白的诱导表达。经IPTG诱导的菌液超声破碎后分别用上清、沉淀进行SDS-PAGE，结果显示目的蛋白在沉淀中表达，说明目的蛋白是包涵体蛋白。包涵体蛋白分别用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定，结果显示在相对分子量约54kD处均可见目的条带，见图2。
3讨论
柯萨奇病毒属小RNA病毒科肠道病毒属，根据柯萨奇病毒对乳鼠的致病特点及对细胞敏感性的不同，将其分成A组和B组，其中B组病毒有6个血清型，即B1～B6。CVB3呈球形，直径约22～30nm，为单股正链RNA，全长由7400个碱基
组成，具有mRNA活性和感染性。RNA基因组由4个部分组成，依次为5′端非编码区、编码区、3′端非编码区和一个Poly（A）尾。P1区编码病毒的主要结构蛋白即衣壳蛋白，包括VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1C）和VP1（1D）4个蛋白产物。4个结构蛋白共同组成该病毒的衣壳，其中VP1、VP2以及VP3蛋白在病毒的表面形成了独特的峡谷样结构，因VPl蛋白是病毒与宿主细胞特异性受体相结合的部位，故病毒的吸附与VP1区密切相关。据流行病学调查显示，VP1在CVB3致病方面发挥重要作用，因为VP1不仅是中和病毒的决定因子，可以直接影响到病毒的抗原性，而且VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，它既作为肠道病毒属内不同血清分型的依据，又可以作为小RNA病毒科内不同属的分类参考[2]。本研究构建了pGEX-VP1重组质粒，用原核表达系统成功表达了GST-VP1融合蛋白。
CVB3 VP1蛋白的成功制备为CVB3的进一步研究，特别是为CVB3 VP1蛋白的研究奠定了良好的基础，对临床诊断和实验室诊断具有重要意义。
参考文献
[1]Maghsoudi N， et al.Cloning and expression of coxsakievirus B3 viral protein21 in Ecoli[J].Iran Biomed J， 2007， 11（3）： 147-152
[2]李哲等.科柯萨奇B3病毒VP1基因序列及系统发生树分析[J].中国老年学杂志，2007，27（02）：234-236
摘要：目的：诱导表达柯萨奇B3病毒（CVB3）的VP1蛋白。
方法：针对CVB3基因的VP1区设计特异性引物，RT-PCR扩增VP1基因并将其克隆到pGEX-6p-1中，经IPTG诱导表达VP1蛋白。采用SDS-PAGE和Western blot检测VP1特异性蛋白的表达情况。
结果：SDS-PAG在相对分子量约54kD处可见目的条带，Western blot检测亦相对分子量约54kD处见到了清晰的蛋白条带。
结论：成功诱导表达了特异性较高的VP1蛋白。
关键词：柯萨奇B3病毒原核表达融合蛋白
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2013）11-0006-02
柯萨奇病毒B3（CVB3）属小RNA病毒科，肠道病毒属。流行病学调查显示，约50%的病毒性心肌炎与肠道病毒感染有关，特别是与CVB3的关系最为密切。同时，CVB3还会引起肝炎、胰腺炎和无菌性脑膜炎等疾病。近年来其发病呈上升趋势，但目前尚缺乏有效的防治措施。CVB3呈球形，直径约22～30nm，为单正链的RNA病毒，具有mRNA活性和感染性，全长为7397个核苷酸。依据其功能分，可分为5′端非编码区（5′-untranslated region，5′-UTR）、P1区、P2区、P3区、3′端非编码区（3′-UTR）和一个Poly（A）尾。P1区编码病毒的主要结构蛋白即衣壳蛋白，该区由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1蛋白为病毒的主要中和抗原。病毒的主要中和抗原位点位于VP1上，VP4序列高度保守，但不暴露在衣壳的外面，故不具有中和性抗原位点[1]。本研究将VP1基因插入pEGX-6p-1表达载体中，构建了pEGX-VP1重组质粒，并诱导表达了GST-VP1融合蛋白，从而为建立CVB3的免疫生物分析方法奠定基础。
1材料与方法
1.1材料。
1.1.1主要材料：CVB3由哈尔滨医科大学病原微生物实验室钟照华教授馈赠。
1.1.2抗体和试剂：pMD18-T载体、限制性内切酶、ExTaq购自宝生物工程（大连）有限公司；原核表达载体pEGX-6p-1为本实验室保存；山羊抗鼠HRP-IgG均购自中杉金桥生物技术有限公司；感受态E.coli BL21（DE3）购自天根生化科技有限公司；其他常用化学试剂为国产或进口分析纯。
1.2方法。
1.2.1引物的设计与合成：采用Primer Express 2.0软件，根据CVB3的核苷酸序列，在VP1区设计特异性引物VP1-F：5’-ATGCAGACACGCCACGTTAAG-3’，酶切位点为：BamHⅠ；VP1-R：5’-CGTATTTGTCATTGTAGTGAT-3’，酶切位点为：XhoⅠ，用于扩增VP1基因（702bp）。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.2.2VP1基因的扩增：用RNeasy Plus Mini RNA提取试剂盒（Qiagen），提取300μL CVB3病毒液的总RNA，溶于30μL RNase Free H2O中，并将其反转录成cDNA。用引物VP1-F和VP1-R进行PCR，特异性扩增CVB3的VP1基因。20μL PCR反应体系为：ddH2O11.7μL、10×buffer 2μL、dNTP 2μL、VP1-F 1μL、VP1-R 1μL、Taq酶 0.3μL、cDNA 2μL。反应条件为：95℃预变性5min，95℃ 30s、54.4℃ 30s、72℃ 20s共30个循环，最后延伸72℃ 10min。
1.2.3重组质粒pMD18-T-VP1的构建。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶纯化回收目的片段VP1，用限制性内切酶BamHⅠ和XHOⅠ分别对VP1和PMD18-T载体进行酶切，酶切正确后胶回收，并将VP1目的片段和PMD18-T载体进行连接，10μL连接体系为pMD-18T载体1μL、PCR胶回收产物VP14μL、SolutionI 5μL，16℃连接过夜后，克隆至pMD-18T载体，构建PMD18-T/VP1重组质粒，将重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，选取菌液PCR、酶切及测序正确（上海英骏生物技术有限公司）的阳性克隆。
1.2.4pEGX-VP1重组质粒的构建。用限制性内切酶BamH Ⅰ和XHOⅠ分别对PMD18-T/VP1重组质粒和pEGX-6P-1表达载体进行酶切，将酶切正确的VP1目的片段并将VP1目的片段和pEGX-6P-1原核表达载体16℃连接过夜后，克隆至pEGX-6P-1载体，构建6P-1/VP1原核表达质粒。转化后摇菌，PCR、酶切及测序正确（上海英骏生物技术有限公司）的阳性克隆即为需要的pEGX-VP1重组质粒。
1.2.5VP1蛋白的表达与纯化：将pEGX-VP1阳性克隆摇菌过夜，按1：100的比例接种于含有Ampicillin（100μg/mL）抗性的无菌LB液体培养基中，37℃摇菌扩增至OD值达到0.4时，加入IPTG使其终浓度为1.5mmol/L，37℃诱导5h。
1.2.6VP1蛋白的SDS-PAGE鉴定。将诱导表达的菌液，4℃离心4500r/min×10min，菌液沉淀用1/50体积的PBS悬起。超声破碎菌体，离心后分别得到全菌、上清和沉淀的蛋白样品，分别将上述蛋白样品按比例加入5×SDS Loading Buffer煮样，分别取样品进行SDS-PAGE电泳。80V缓慢电泳，使蛋白样品达到同一水平线上。待蛋白Marker条带分离明显后，以120 V电压电泳至溴酚兰行到达电泳槽下端。后将胶慢慢地拿起放入盛有考马斯亮蓝R250染色液的平皿中，室温下，旋转摇床上摇动染色1h左右，蛋白胶染好色后，将胶取出，用蒸馏水将蛋白胶冲洗2次，后放入盛有脱色液的平皿中，室温下，旋转摇床上摇动脱色1～2h，能清楚的看见蛋白条带时，可停止脱色，蛋白胶可用蒸馏水浸泡后在凝胶成像系统进行拍照。以鉴定VP1目的蛋白有无表达及目的蛋白的存在形式。 1.2.7VP1蛋白的Western blot鉴定。将获得的全菌、上清和沉淀的蛋白样品，分别取样品进行SDS-PAGE电泳后，将凝胶蛋白带电转移至硝酸纤维素膜上，脱脂乳37℃封闭2h。洗膜后按1∶2000稀释GST单抗，37℃孵育1h。洗膜后加HRP标记的山羊抗鼠IgG（1∶5000稀释），37℃孵育1h，洗涤，经ECL显色后扫膜。
2结果
2.1VP1基因的PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳表明，用所合成的特异性引物VP1-F和VP1-R进行PCR扩增，在约702bp处有一特异性条带，与预期目的片段长度一致，测序结果表明其序列与GenBank公布的CVB3序列一致。
2.2PMD18-T/VP1重组质粒的鉴定。重组质粒PMD18-T/VP1菌液PCR和酶切后经琼脂糖电泳可见与预期大小相符的条带。菌液测序结果与目的片段序列一致性为100%。
2.3重组质粒pGEX-VP1的鉴定。重组质粒pGEX-VP1菌液PCR和酶切后经琼脂糖电泳在702bp处可见与预期大小相符的条带（图1）。菌液测序结果与目的片段序列一致率为100%。
2.4原核蛋白的诱导表达。经IPTG诱导的菌液超声破碎后分别用上清、沉淀进行SDS-PAGE，结果显示目的蛋白在沉淀中表达，说明目的蛋白是包涵体蛋白。包涵体蛋白分别用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定，结果显示在相对分子量约54kD处均可见目的条带，见图2。
3讨论
柯萨奇病毒属小RNA病毒科肠道病毒属，根据柯萨奇病毒对乳鼠的致病特点及对细胞敏感性的不同，将其分成A组和B组，其中B组病毒有6个血清型，即B1～B6。CVB3呈球形，直径约22～30nm，为单股正链RNA，全长由7400个碱基
组成，具有mRNA活性和感染性。RNA基因组由4个部分组成，依次为5′端非编码区、编码区、3′端非编码区和一个Poly（A）尾。P1区编码病毒的主要结构蛋白即衣壳蛋白，包括VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1C）和VP1（1D）4个蛋白产物。4个结构蛋白共同组成该病毒的衣壳，其中VP1、VP2以及VP3蛋白在病毒的表面形成了独特的峡谷样结构，因VPl蛋白是病毒与宿主细胞特异性受体相结合的部位，故病毒的吸附与VP1区密切相关。据流行病学调查显示，VP1在CVB3致病方面发挥重要作用，因为VP1不仅是中和病毒的决定因子，可以直接影响到病毒的抗原性，而且VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，它既作为肠道病毒属内不同血清分型的依据，又可以作为小RNA病毒科内不同属的分类参考[2]。本研究构建了pGEX-VP1重组质粒，用原核表达系统成功表达了GST-VP1融合蛋白。
CVB3 VP1蛋白的成功制备为CVB3的进一步研究，特别是为CVB3 VP1蛋白的研究奠定了良好的基础，对临床诊断和实验室诊断具有重要意义。
参考文献
[1]Maghsoudi N， et al.Cloning and expression of coxsakievirus B3 viral protein21 in Ecoli[J].Iran Biomed J， 2007， 11（3）： 147-152
[2]李哲等.科柯萨奇B3病毒VP1基因序列及系统发生树分析[J].中国老年学杂志，2007，27（02）：234-236