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摘要：本文将5-48号菌株作为出发菌株、得到原生质体，展开针对性的处理，获取得到高产菌株7-23，通过对两种菌株的对比分析，对大观霉素菌种选育的原生质体—再生技术展开具体论述，旨在全面提高菌株生产能力，为今后大观霉素菌种选育打下坚实基础。
关键词：大观霉素;原生质体;再生技术
引言：大观霉素作为氨基环醇类抗生素的一种，通过壮观链霉菌制备而成，在临床上主要用于治疗急性淋病，还可以将大观霉素用于农药喷洒，治疗效果突出且明显，使用安全且稳定。
1.大观霉素菌种制备和发酵
对于原生质体-再生技术，无论是在庆大霉素、吉他霉素，还是在螺旋霉素、泰乐星的菌种培育中都能够起到良好的应用效果。对于大观霉素，壮观链霉菌作为产生菌、原菌种号额设置为47号，通过分离操作获取得到7-23号。在恒温作用下一共培养8～10天，通过三级振荡培养，将其放置到瓶中用于检测生物效价。较为典型的大观霉素菌种制备和发酵工艺主要表现为：第一，在原始细胞库冷冻孢子。第二，在工作细胞库冷冻孢子。第三，进行一定时间段的斜面孢子培养。第四，种瓶培养。第五，展开一级种子液培养工作。第六，二级种子液培养工作。第七，定期进行发酵液的组织培养。大观霉素生物效价测定方法则采用管碟法进行，而大观霉素试验指示菌则为肺炎克雷伯氏菌。
2.大观霉素的选育方法
现有的大观霉素菌种选育方法主要包括以下几种，第一种即为诱变育种，作为一种较为传统的菌种育种方式，应用时间长、应用范围广、应用价值高，将其与其他诱变方法相结合，还能够显著提高诱变效果、促使产物具有高抗性。但是需要注意的是，采用诱变育种方法本身的随机性影响很大，采用诱变育种很容易促使最终生成的菌株难以达成目标要求，自身性能出现缺陷，甚至生成变异株[1]。第二种是原生质体育种，原生质体育种方法的应用原理便在于充分利用原生质体，在没有细胞壁的影响下，整个诱变处理过程更加简单方便，诱变效益也更加突出、正突率几率也能够显著提高。与此同时，对于原生质体育种，无论是生成原生质体，还是再生原生质体，都能够直接进行分离纯化菌种，质体突变的可能性也会相应提高。
3.原生质体制备和处理
3.1原生质体制备
对于大观霉素原生质体的制备工作，需要预先准备好新鲜母瓶，具体规格为0.5%甘氨酸、3粒玻璃珠，一共需要培养42小时。需要预先提取出10ml，并按照2500r/min的转速进行离心处理10分钟，弃上清液。之后，需要清洗缓冲液2次，并按照3000r/min的转速进行离心处理10分钟，弃上清液，最终制备得到酶解用菌体。
3.2酶解
对于已经清洗完成的湿菌体，需要相应添加容量为8ml、浓度为4mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。整个酶解过程如果发现酶解中的菌丝体悬液在较短时间内就开始变清，则表示已经形成大量原生质体。并准备好显微镜进行具体观察，一旦发现较多数量、较大面积的亮点，则表示已经终止酶解环节，实现大量原生质体的释放工作。
3.3紫外线诱变处理
对于紫外线诱变处理原生质体，需要预先准备好经过上述处理的原生质体悬浮液，原生质体悬浮液容量为5ml，并将其直接移置到9cm定量培养皿，工作人员轻轻进行悬浮液的搅动，促使其能够处于紫外线照射下，照射时间控制在90s。当原生质体悬浮液适当稀释之后，则需要在温度为28℃的分离再生培养基直接培养7天左右，从而完成整个原生质体的紫外线诱变处理[2]。
4.试验结果分析
4.1菌株单菌落考察情况
对于大观霉素的菌种选育，菌落形态一共有三种，分别是梅花型、馒头型带红边以及草帽型，摇瓶效价则分别为230μg/ml、230μg/ml、220μg/ml。按照不同菌落形态展开正交试验，将影响因素分别设置为单菌落形态、单菌落生长周期、单菌落直径大小。其中，当影响因素为单菌落形态，将A1、A2、A3分别设置为梅花型、馒头型带红边、草帽型。当影响因素为单菌落生长周期，将B1、B2、B3分别设置为10天、9天、8天。当影响因素为单菌落直径大小，将C1、C2、C3分别设置为3.0mm、3.5mm、4.0mm。通过正交试验最终获取得到最佳组合结果为A2B3C2，也就是优选菌落为单菌落形态为馒头型带红边、单菌落生长周期设置为8天、单菌落直径大小设置为3.5mm。
4.2 7-23号菌株初筛、复试、放大结果
7-23号菌株和对照菌株5-48相比，复试结果超过22%。当其处于18m3的发酵罐中，7-23号菌株和对照菌株5-48相比，放大结果超过17%。
事实上，对于新菌株7-23，和对照菌株5-48相比，摇瓶效价显著增加，新菌株7-23菌种号从1到10的平均值为255μg/ml、对照菌株5-48菌种号从1到10的平均值为209μg/ml。对于新菌株7-23在18m3發酵罐放大结果，和对照菌株5-48相比，新菌株7-23菌种号从1到9的平均值为279μg/ml、对照菌株5-48菌种号从1到9的平均值为238μg/ml。与此同时，所有质检结果均合格，整个菌株的生产代谢过程较为平稳正常，对今后进行实际生产作业也具有重要意义。
需要注意的是，对于已经诱变完成后的菌株，菌落形态多样，不同的菌落形态摇瓶效价也存在明显差别，在梅花型、馒头型带红边、草帽型三种菌落形态中，摇瓶效价最高的则为馒头型带红边的菌株。现阶段，单菌落进罐则是一种应用较为广泛的菌种类别，无论是摇瓶效价，还是发酵水平都较为稳定。
结论：综上所述，对大观霉素菌种选育的原生质体—再生技术展开分析具有至关重要的意义。经5-48号菌株酶解、诱变处理后的7-23号菌株的摇瓶效价和18m3发酵罐菌株生产能力都显著提高。今后，也应当不断加强技术研究，着力形成更具有可行性和规范性的生产工艺，促使大观霉素能够充分发挥自身应用效能。
参考文献：
[1]王丽霞，孟庆娟，李生龙，等.盐酸大观霉素高效液相色谱检测方法的建立[J].安徽农业科学，2020，48（19）：198-202.
[2]丁丽军，沈建新，陈长宽，等.气相色谱-串联质谱法检测猪肉中大观霉素和林可霉素残留量[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2019，40（06）：93-99.
关键词：大观霉素;原生质体;再生技术
引言：大观霉素作为氨基环醇类抗生素的一种，通过壮观链霉菌制备而成，在临床上主要用于治疗急性淋病，还可以将大观霉素用于农药喷洒，治疗效果突出且明显，使用安全且稳定。
1.大观霉素菌种制备和发酵
对于原生质体-再生技术，无论是在庆大霉素、吉他霉素，还是在螺旋霉素、泰乐星的菌种培育中都能够起到良好的应用效果。对于大观霉素，壮观链霉菌作为产生菌、原菌种号额设置为47号，通过分离操作获取得到7-23号。在恒温作用下一共培养8～10天，通过三级振荡培养，将其放置到瓶中用于检测生物效价。较为典型的大观霉素菌种制备和发酵工艺主要表现为：第一，在原始细胞库冷冻孢子。第二，在工作细胞库冷冻孢子。第三，进行一定时间段的斜面孢子培养。第四，种瓶培养。第五，展开一级种子液培养工作。第六，二级种子液培养工作。第七，定期进行发酵液的组织培养。大观霉素生物效价测定方法则采用管碟法进行，而大观霉素试验指示菌则为肺炎克雷伯氏菌。
2.大观霉素的选育方法
现有的大观霉素菌种选育方法主要包括以下几种，第一种即为诱变育种，作为一种较为传统的菌种育种方式，应用时间长、应用范围广、应用价值高，将其与其他诱变方法相结合，还能够显著提高诱变效果、促使产物具有高抗性。但是需要注意的是，采用诱变育种方法本身的随机性影响很大，采用诱变育种很容易促使最终生成的菌株难以达成目标要求，自身性能出现缺陷，甚至生成变异株[1]。第二种是原生质体育种，原生质体育种方法的应用原理便在于充分利用原生质体，在没有细胞壁的影响下，整个诱变处理过程更加简单方便，诱变效益也更加突出、正突率几率也能够显著提高。与此同时，对于原生质体育种，无论是生成原生质体，还是再生原生质体，都能够直接进行分离纯化菌种，质体突变的可能性也会相应提高。
3.原生质体制备和处理
3.1原生质体制备
对于大观霉素原生质体的制备工作，需要预先准备好新鲜母瓶，具体规格为0.5%甘氨酸、3粒玻璃珠，一共需要培养42小时。需要预先提取出10ml，并按照2500r/min的转速进行离心处理10分钟，弃上清液。之后，需要清洗缓冲液2次，并按照3000r/min的转速进行离心处理10分钟，弃上清液，最终制备得到酶解用菌体。
3.2酶解
对于已经清洗完成的湿菌体，需要相应添加容量为8ml、浓度为4mg/ml的鸡蛋清溶菌酶。整个酶解过程如果发现酶解中的菌丝体悬液在较短时间内就开始变清，则表示已经形成大量原生质体。并准备好显微镜进行具体观察，一旦发现较多数量、较大面积的亮点，则表示已经终止酶解环节，实现大量原生质体的释放工作。
3.3紫外线诱变处理
对于紫外线诱变处理原生质体，需要预先准备好经过上述处理的原生质体悬浮液，原生质体悬浮液容量为5ml，并将其直接移置到9cm定量培养皿，工作人员轻轻进行悬浮液的搅动，促使其能够处于紫外线照射下，照射时间控制在90s。当原生质体悬浮液适当稀释之后，则需要在温度为28℃的分离再生培养基直接培养7天左右，从而完成整个原生质体的紫外线诱变处理[2]。
4.试验结果分析
4.1菌株单菌落考察情况
对于大观霉素的菌种选育，菌落形态一共有三种，分别是梅花型、馒头型带红边以及草帽型，摇瓶效价则分别为230μg/ml、230μg/ml、220μg/ml。按照不同菌落形态展开正交试验，将影响因素分别设置为单菌落形态、单菌落生长周期、单菌落直径大小。其中，当影响因素为单菌落形态，将A1、A2、A3分别设置为梅花型、馒头型带红边、草帽型。当影响因素为单菌落生长周期，将B1、B2、B3分别设置为10天、9天、8天。当影响因素为单菌落直径大小，将C1、C2、C3分别设置为3.0mm、3.5mm、4.0mm。通过正交试验最终获取得到最佳组合结果为A2B3C2，也就是优选菌落为单菌落形态为馒头型带红边、单菌落生长周期设置为8天、单菌落直径大小设置为3.5mm。
4.2 7-23号菌株初筛、复试、放大结果
7-23号菌株和对照菌株5-48相比，复试结果超过22%。当其处于18m3的发酵罐中，7-23号菌株和对照菌株5-48相比，放大结果超过17%。
事实上，对于新菌株7-23，和对照菌株5-48相比，摇瓶效价显著增加，新菌株7-23菌种号从1到10的平均值为255μg/ml、对照菌株5-48菌种号从1到10的平均值为209μg/ml。对于新菌株7-23在18m3發酵罐放大结果，和对照菌株5-48相比，新菌株7-23菌种号从1到9的平均值为279μg/ml、对照菌株5-48菌种号从1到9的平均值为238μg/ml。与此同时，所有质检结果均合格，整个菌株的生产代谢过程较为平稳正常，对今后进行实际生产作业也具有重要意义。
需要注意的是，对于已经诱变完成后的菌株，菌落形态多样，不同的菌落形态摇瓶效价也存在明显差别，在梅花型、馒头型带红边、草帽型三种菌落形态中，摇瓶效价最高的则为馒头型带红边的菌株。现阶段，单菌落进罐则是一种应用较为广泛的菌种类别，无论是摇瓶效价，还是发酵水平都较为稳定。
结论：综上所述，对大观霉素菌种选育的原生质体—再生技术展开分析具有至关重要的意义。经5-48号菌株酶解、诱变处理后的7-23号菌株的摇瓶效价和18m3发酵罐菌株生产能力都显著提高。今后，也应当不断加强技术研究，着力形成更具有可行性和规范性的生产工艺，促使大观霉素能够充分发挥自身应用效能。
参考文献：
[1]王丽霞，孟庆娟，李生龙，等.盐酸大观霉素高效液相色谱检测方法的建立[J].安徽农业科学，2020，48（19）：198-202.
[2]丁丽军，沈建新，陈长宽，等.气相色谱-串联质谱法检测猪肉中大观霉素和林可霉素残留量[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2019，40（06）：93-99.