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【摘要】目的 探讨葛根素对体外培养破骨细胞的影响，以供临床参考。方法 将培养的破骨细胞分离，分别加入10-6mol/l，10-7 mol/l，10-8mol/l的葛根素。并设立正常对照组。于实验3.5.7天动态观察吸收陷窝在骨磨片上的形态的。7天培养后进行HE染色。脱水、二甲苯透明树胶固定，于光镜下观察细胞形态。结果 吸收陷窝改变：10-6mol/l，10-7 mol/l，10-8组mol/l浓度组骨吸收陷窝数目较对照明显减少，吸收陷窝较对照组小。HE染色结果：10-6mol/l，10-7 mol/l，10-8组mol/l浓度组的破骨细胞与对照组比，形态大，细胞核数目多，细胞数目少。结论 葛根素对破骨细胞的骨吸收功能具有直接抑制作用，其效果较为显着。
【关键词】葛根素；破骨细胞；骨吸收陷窝；HE染色
黄酮类化合物葛根素(puerarin)的主要活性成分是葛根，葛根由豆科植物葛和野葛的块根组成，具有解表退热，生津止渴的作用。葛根中的另一种活性成分是大豆甙元它具有良好的防氧化和抗癌作用。但该化合物影响骨代谢的文献报道甚少。破骨细胞(Os—teoclasts，OC)的主要功能为骨吸收，本实验观察分析了葛根素对破骨细胞（体外分离培养）的作用。
1材料与方法
1.1材料：分离原代破骨细胞用新生SD乳鼠（24小时内）；实验动物由中国医科大学实验动物中心提供。
1.2主要仪器设备CO2培养箱(英国)；OLYMPUS倒置光相差显微镜(日本)；超净工作台，上海净化设备厂。
1.3试剂a-MEM培养基购自Gibco公司；Hepes购于Sigma产品；胎牛血清购自中科院血液研究所；葛根素(Pur)购自中国药品生物制剂检定所，分离及培养细胞试剂：青霉素(上海第三制药厂)、链霉素(上海第三制药厂)。D— Hank’S液(g／I )：NaC1 8.0 KC1 0.4Na，HPO ·H2O 0.06 K H 2PO 4 0.06 NaHCO 0.35酚红0.02 PH一7.4。17 雌二醇( E2)用DMSO溶解，过滤除菌后配成浓度为10一 mol／L的储存液，临用时配成终浓度为10～ mol／L加入到培养基中。
1.4破骨细胞的分离与培养 断头处死新生大鼠，用75 酒精浸泡15rain后，分离股骨、肱骨和胫骨，去净软组织及骺部，用D—Hank’S液清洗骨干部分三次，放入15%FBS的MEM 培养皿中，将骨质轻轻的刮入到溶液内，之后反复吹打（用圆头吸管）骨质碎片3分钟，静置30秒，吸入上层细胞悬液到另一培养皿内，在37。5%CO2培养箱中培养三十分钟[1]，弃去液体，重新更换，继续培养。并加待测Pur和E2.除正常对照组外．另设10-6mol/l ,10-7 mol/l， 10-8组mol/l及10-8 mol/l 组，每组设8个复孔4观察指标相差显微镜：观察盖玻片上细胞的形态，观察骨磨片3.5.7天吸收陷窝的形态。HE染色：培养7天后取出盖玻片，乙醇固定，HE染色、脱水二甲苯透明树胶固定，光镜下观察细胞形态。
1.5统计掌处理 数据 x±s表示，采用spss13.0．0统计软件进行单因素方差分析
2结果
2.1HE染色结果10-6mol/l ,10-7 mol/l， 10-8组mol/l浓度组的破骨细胞与对照组比形态大，细胞核数目多，细胞数目少。
2.2吸收陷窝改变10-6mol/l ,10-7 mol/l， 10-8组mol/l浓度组骨吸收陷窝数目较对照明显减少，吸收陷窝形状较对照组小。见表一：
表一：葛根素对破骨细胞性骨吸收陷窝面积的影响
* P＜0.05,F=6.97 P=0.019
3讨论
破骨细胞如果吸收过度可以造成骨质疏松，采用雌激素替代疗法可以进行防治 。但流行病调查的结果显示长期使用雌激素存在增加子宫内膜癌和乳腺癌的发病率危险，大豆异黄酮类植物雌激素来源于植物．其是一种弱雌激素。以往的研究表明表明该类化台物能降低乳腺癌和心血管以及子宫内膜癌的发病率[2]．葛根素是大豆甙元8位碳与葡萄糖相联生成的化台物，因为其结构与大豆甙元极其相似得特性．我们疑问其可能与否具有与大豆甙元相似的功能作用．本实验采用经典的HE染色方法，鉴定破骨细胞，观察及破骨细胞形态，反映其活性。目前研究认为核数目少的细胞较多的具有更大的趋化性，而且小的细胞较大有更高的RNA合成水平。吸收骨更容易。本实验HE染色显示加入含葛根素血清破骨细胞形态大且核数目多， (P<0．01)，说明其抑制破骨细胞活性与其浓度呈正相关。这表明葛根素对具有一定的抑制破骨细胞的吸收的作用．提示其可能对骨具有雌激素样功能活性，有可能降低乳腺癌和心血管以及子宫内膜癌的发病率，提示我们进一步进行研究。
参考文献
[1]史风芹，于世风.体外破骨细胞分离培养方法的建立[J].中华骨科杂志.1994，14(1)：43—46．
[2]徐霞，贡沁燕，鲁映青，等.大豆异黄酮对去卵巢大鼠骨密度和雌激素活性的影响[J].中国新药与临床杂志，2002，21(6)
课题来源：沈阳医学院青年基金 项目编号：20092021，项目负责人 颜南
【关键词】葛根素；破骨细胞；骨吸收陷窝；HE染色
黄酮类化合物葛根素(puerarin)的主要活性成分是葛根，葛根由豆科植物葛和野葛的块根组成，具有解表退热，生津止渴的作用。葛根中的另一种活性成分是大豆甙元它具有良好的防氧化和抗癌作用。但该化合物影响骨代谢的文献报道甚少。破骨细胞(Os—teoclasts，OC)的主要功能为骨吸收，本实验观察分析了葛根素对破骨细胞（体外分离培养）的作用。
1材料与方法
1.1材料：分离原代破骨细胞用新生SD乳鼠（24小时内）；实验动物由中国医科大学实验动物中心提供。
1.2主要仪器设备CO2培养箱(英国)；OLYMPUS倒置光相差显微镜(日本)；超净工作台，上海净化设备厂。
1.3试剂a-MEM培养基购自Gibco公司；Hepes购于Sigma产品；胎牛血清购自中科院血液研究所；葛根素(Pur)购自中国药品生物制剂检定所，分离及培养细胞试剂：青霉素(上海第三制药厂)、链霉素(上海第三制药厂)。D— Hank’S液(g／I )：NaC1 8.0 KC1 0.4Na，HPO ·H2O 0.06 K H 2PO 4 0.06 NaHCO 0.35酚红0.02 PH一7.4。17 雌二醇( E2)用DMSO溶解，过滤除菌后配成浓度为10一 mol／L的储存液，临用时配成终浓度为10～ mol／L加入到培养基中。
1.4破骨细胞的分离与培养 断头处死新生大鼠，用75 酒精浸泡15rain后，分离股骨、肱骨和胫骨，去净软组织及骺部，用D—Hank’S液清洗骨干部分三次，放入15%FBS的MEM 培养皿中，将骨质轻轻的刮入到溶液内，之后反复吹打（用圆头吸管）骨质碎片3分钟，静置30秒，吸入上层细胞悬液到另一培养皿内，在37。5%CO2培养箱中培养三十分钟[1]，弃去液体，重新更换，继续培养。并加待测Pur和E2.除正常对照组外．另设10-6mol/l ,10-7 mol/l， 10-8组mol/l及10-8 mol/l 组，每组设8个复孔4观察指标相差显微镜：观察盖玻片上细胞的形态，观察骨磨片3.5.7天吸收陷窝的形态。HE染色：培养7天后取出盖玻片，乙醇固定，HE染色、脱水二甲苯透明树胶固定，光镜下观察细胞形态。
1.5统计掌处理 数据 x±s表示，采用spss13.0．0统计软件进行单因素方差分析
2结果
2.1HE染色结果10-6mol/l ,10-7 mol/l， 10-8组mol/l浓度组的破骨细胞与对照组比形态大，细胞核数目多，细胞数目少。
2.2吸收陷窝改变10-6mol/l ,10-7 mol/l， 10-8组mol/l浓度组骨吸收陷窝数目较对照明显减少，吸收陷窝形状较对照组小。见表一：
表一：葛根素对破骨细胞性骨吸收陷窝面积的影响
* P＜0.05,F=6.97 P=0.019
3讨论
破骨细胞如果吸收过度可以造成骨质疏松，采用雌激素替代疗法可以进行防治 。但流行病调查的结果显示长期使用雌激素存在增加子宫内膜癌和乳腺癌的发病率危险，大豆异黄酮类植物雌激素来源于植物．其是一种弱雌激素。以往的研究表明表明该类化台物能降低乳腺癌和心血管以及子宫内膜癌的发病率[2]．葛根素是大豆甙元8位碳与葡萄糖相联生成的化台物，因为其结构与大豆甙元极其相似得特性．我们疑问其可能与否具有与大豆甙元相似的功能作用．本实验采用经典的HE染色方法，鉴定破骨细胞，观察及破骨细胞形态，反映其活性。目前研究认为核数目少的细胞较多的具有更大的趋化性，而且小的细胞较大有更高的RNA合成水平。吸收骨更容易。本实验HE染色显示加入含葛根素血清破骨细胞形态大且核数目多， (P<0．01)，说明其抑制破骨细胞活性与其浓度呈正相关。这表明葛根素对具有一定的抑制破骨细胞的吸收的作用．提示其可能对骨具有雌激素样功能活性，有可能降低乳腺癌和心血管以及子宫内膜癌的发病率，提示我们进一步进行研究。
参考文献
[1]史风芹，于世风.体外破骨细胞分离培养方法的建立[J].中华骨科杂志.1994，14(1)：43—46．
[2]徐霞，贡沁燕，鲁映青，等.大豆异黄酮对去卵巢大鼠骨密度和雌激素活性的影响[J].中国新药与临床杂志，2002，21(6)
课题来源：沈阳医学院青年基金 项目编号：20092021，项目负责人 颜南