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中图分类号：TS207.3文献标识码：A
摘要：目的 建立反相高效液相色谱法测定蛋糕中的5种合成着色剂的检测方法。方法 样品碾碎后用水溶解，经沉淀蛋白和去脂肪处理后过滤，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱，以甲醇和乙酸铵为流动相，采用梯度洗脱、改变波长的方法进行分析测定。结果 样品中的5种混合着色剂得到很好的分离。在样品中加入了5种着色剂标准，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝，回收率在94.93-98.79% 。结论 当使用低波长检测时，流动相使用很小的混合比例的误差都会被放大，很有可能会使基线发生波动。本试验采用最佳吸收波长HPLC法对5种合成着色剂进行分离检测，灵敏度较高，分离度良好，回收率满意，适于蛋糕中合成着色剂的测定。
关键词：反相高效液相色谱；蛋糕；着色剂
着色剂优点不少，如色泽鲜艳，着色力强，色调多样，它们分别用于果味水、果味粉、果子露、汽水、配制酒、红绿丝、罐头，以及糕点表面上彩等。然而，着色剂常以苯、甲苯、萘等化工原料经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列有机反应而制得，因中间体和有害物质的存在，合成着色剂具有一定的毒性。如偶氮类染料已被确定为不安全的，具有潜在的过敏反应、致癌性[1，2]，各国对合成食用着色剂都严格控制使用范围和使用量，我国GB2760—2011食品安全国家标准中也规定了合成着色剂的使用范围和使用量[3]。目前，国家标准检验方法采用反相高效液相色谱法梯度洗脱来分离人工着色剂[4]，但是容易引起基线漂移，引起数据误差。利用梯度洗脱方法检测食品中的着色剂已有报道[5，6，7]。本文建立了以甲醇+乙酸铵（0.02 mol/L ，pH = 4.0）为流动相， 采用梯度洗脱、改变波长的方法分析测定了蛋糕中的5种着色剂的方法。
1.材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 1260分析型高效液相色谱仪（Angilent，USA） ，包括Agilent ChemStation色谱工作站、四元梯度泵、真空脱气箱、恒温柱温箱、二极管阵列检测器（DAD ） 。色谱柱： 150 ×4.6 mm ， 5um ， ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱。
着色剂标准品：柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝标准溶液，均购于国家标准物质中心，标准值0.500（mg/ml），GBW（E）100001；甲醇：色谱纯（美国Honeywell Burdick ﹠Jackson公司）；乙酸铵为分析纯试剂；聚酰胺粉过200目筛。样品处理及溶剂配制全部使用哇哈哈纯净水。
1.2样品的前处理
将蛋糕碾碎，准确称取5g试样（精确到0.001g）， 放入100ml烧杯中， 加入30ml水，温热溶解、搅匀，加沉淀剂乙酸锌（220g/L）、亚铁氰化钾（106g/L）各2ml，室温静止30分钟，用柠檬酸溶液调PH值到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，以G3垂融漏斗抽滤，用乙醇-氨水-水解吸，收集解吸液，乙酸中和，蒸发近干，加水溶解，定容5ml， 经0.22um的微孔滤膜过滤，进样。
1.3 色谱条件的选择
1.3.1 调整流速，確定流动相的最佳洗脱梯度。
1.3.2 确定5种合成着色剂的最佳测定波长
2.结果与讨论
2.1 流动相最佳梯度选择
以国家标准检测方法——等波长梯度洗脱法为依据[4]，经多次调整，确定了流动相最佳梯度，见表1。
2.2 波长最佳梯度选择
在国家标准检测方法中[4]，对各种合成着色剂的检测是在254nm的波长下进行测定的，由于在此波长下，所有的化学成分均有吸收，但此波长并不是各成分的最有效波长，检测时检测器里面的吸收一直产生变化，会出现许多干扰峰，导致基线波动的发生，引起基线漂移或者有些成分不出峰，见图2。正确选择缓冲液对于优化尖峰、检出限和稳定的保留时间十分重要，郭平[7]、林建忠[8]等曾采用调整波长的方法成功的分离了10种合成着色剂。本试验根据不同波长对着色剂的吸收强度不同的差异，经多次调整，确定了柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝5种合成着色剂的最佳波长梯度，见表2。
在最佳流动相梯度与最佳波长梯度条件下5种合成着色剂的标准色谱图见图1，与国标法图2比较，可以看出5种着色剂得到了很好的分离，不但避免了基线的漂移，灵敏度也明显的提高，杂质峰也变小。
2.3 标准曲线及方法检出限
在设定的色谱条件下，各化合物浓度在1.0～50ug/ml时，浓度和峰面积有良好的线性关系，相关系数均大于0.997，检出限以噪音的3倍计算。各化合物标准曲线回归方程、相关系数及方法检出限见表3。
2.4样品的检测及加标回收率
在相同的色谱条件下对20份蛋糕样本进行检测，并在同一份样本中进行加标，分别加入浓度为10、20ug/ml的5种着色剂混标，计算加标回收率。在20份蛋糕样本中5种合成着色剂偶有检出。加标回收率的结果见表4，回收率满意。
3.结论
本试验对采用色谱法测定合成着色剂的条件进行优化，避免了在低波长下梯度洗脱时基线的飘移，采用改变波长的方法测定不同着色剂检出的灵敏度、精密度和准确度均获得满意的结果，且满足分析要求，为蛋糕中合成着色剂的检测提供了很好的依据。
参考文献：
[1]郑鹏然，周树南，主编.食品卫生全书[M].北京：红旗出版社，1996，424.
[2]高鹤娟，主编.食品理化检验方法“理化部分”注解[M].卫生部食品卫生监督检验所，1987，257-259.
[3]中华人民共和国卫生部.GB2760—2011食品安全国家标准-食品添加剂使用标准[S].北京：中国标准出版社，2012.
[4]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.35-2003食品中合成着色剂的测定[S].北京：中国标准出版社，2004.
[5]阮丽萍，吉文亮，刘华良，等.高效液相色谱法同时测定食品中10种合成着色剂[J].中国食品卫生杂志，2011，23（2）.
[6]李必斌.食用合成色素检测方法的研究进展[J].中国卫生检验杂志，2002，12（6）
[7]郭平，金会会，李瑾瑾等.高效液相色谱法同时测定饮料中十种合成着色剂[C].食品安全技术与标准国际研讨会暨AOAC中国区会议论文集，2011.
[8]林建忠.HPLC法测定食品中色素条件优化的研究[J].中国卫生检验杂志，1998， 8（4）：205-206.
摘要：目的 建立反相高效液相色谱法测定蛋糕中的5种合成着色剂的检测方法。方法 样品碾碎后用水溶解，经沉淀蛋白和去脂肪处理后过滤，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱，以甲醇和乙酸铵为流动相，采用梯度洗脱、改变波长的方法进行分析测定。结果 样品中的5种混合着色剂得到很好的分离。在样品中加入了5种着色剂标准，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝，回收率在94.93-98.79% 。结论 当使用低波长检测时，流动相使用很小的混合比例的误差都会被放大，很有可能会使基线发生波动。本试验采用最佳吸收波长HPLC法对5种合成着色剂进行分离检测，灵敏度较高，分离度良好，回收率满意，适于蛋糕中合成着色剂的测定。
关键词：反相高效液相色谱；蛋糕；着色剂
着色剂优点不少，如色泽鲜艳，着色力强，色调多样，它们分别用于果味水、果味粉、果子露、汽水、配制酒、红绿丝、罐头，以及糕点表面上彩等。然而，着色剂常以苯、甲苯、萘等化工原料经过磺化、硝化、卤化、偶氮化等一系列有机反应而制得，因中间体和有害物质的存在，合成着色剂具有一定的毒性。如偶氮类染料已被确定为不安全的，具有潜在的过敏反应、致癌性[1，2]，各国对合成食用着色剂都严格控制使用范围和使用量，我国GB2760—2011食品安全国家标准中也规定了合成着色剂的使用范围和使用量[3]。目前，国家标准检验方法采用反相高效液相色谱法梯度洗脱来分离人工着色剂[4]，但是容易引起基线漂移，引起数据误差。利用梯度洗脱方法检测食品中的着色剂已有报道[5，6，7]。本文建立了以甲醇+乙酸铵（0.02 mol/L ，pH = 4.0）为流动相， 采用梯度洗脱、改变波长的方法分析测定了蛋糕中的5种着色剂的方法。
1.材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 1260分析型高效液相色谱仪（Angilent，USA） ，包括Agilent ChemStation色谱工作站、四元梯度泵、真空脱气箱、恒温柱温箱、二极管阵列检测器（DAD ） 。色谱柱： 150 ×4.6 mm ， 5um ， ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱。
着色剂标准品：柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝标准溶液，均购于国家标准物质中心，标准值0.500（mg/ml），GBW（E）100001；甲醇：色谱纯（美国Honeywell Burdick ﹠Jackson公司）；乙酸铵为分析纯试剂；聚酰胺粉过200目筛。样品处理及溶剂配制全部使用哇哈哈纯净水。
1.2样品的前处理
将蛋糕碾碎，准确称取5g试样（精确到0.001g）， 放入100ml烧杯中， 加入30ml水，温热溶解、搅匀，加沉淀剂乙酸锌（220g/L）、亚铁氰化钾（106g/L）各2ml，室温静止30分钟，用柠檬酸溶液调PH值到6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入试样溶液中，以G3垂融漏斗抽滤，用乙醇-氨水-水解吸，收集解吸液，乙酸中和，蒸发近干，加水溶解，定容5ml， 经0.22um的微孔滤膜过滤，进样。
1.3 色谱条件的选择
1.3.1 调整流速，確定流动相的最佳洗脱梯度。
1.3.2 确定5种合成着色剂的最佳测定波长
2.结果与讨论
2.1 流动相最佳梯度选择
以国家标准检测方法——等波长梯度洗脱法为依据[4]，经多次调整，确定了流动相最佳梯度，见表1。
2.2 波长最佳梯度选择
在国家标准检测方法中[4]，对各种合成着色剂的检测是在254nm的波长下进行测定的，由于在此波长下，所有的化学成分均有吸收，但此波长并不是各成分的最有效波长，检测时检测器里面的吸收一直产生变化，会出现许多干扰峰，导致基线波动的发生，引起基线漂移或者有些成分不出峰，见图2。正确选择缓冲液对于优化尖峰、检出限和稳定的保留时间十分重要，郭平[7]、林建忠[8]等曾采用调整波长的方法成功的分离了10种合成着色剂。本试验根据不同波长对着色剂的吸收强度不同的差异，经多次调整，确定了柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和亮蓝5种合成着色剂的最佳波长梯度，见表2。
在最佳流动相梯度与最佳波长梯度条件下5种合成着色剂的标准色谱图见图1，与国标法图2比较，可以看出5种着色剂得到了很好的分离，不但避免了基线的漂移，灵敏度也明显的提高，杂质峰也变小。
2.3 标准曲线及方法检出限
在设定的色谱条件下，各化合物浓度在1.0～50ug/ml时，浓度和峰面积有良好的线性关系，相关系数均大于0.997，检出限以噪音的3倍计算。各化合物标准曲线回归方程、相关系数及方法检出限见表3。
2.4样品的检测及加标回收率
在相同的色谱条件下对20份蛋糕样本进行检测，并在同一份样本中进行加标，分别加入浓度为10、20ug/ml的5种着色剂混标，计算加标回收率。在20份蛋糕样本中5种合成着色剂偶有检出。加标回收率的结果见表4，回收率满意。
3.结论
本试验对采用色谱法测定合成着色剂的条件进行优化，避免了在低波长下梯度洗脱时基线的飘移，采用改变波长的方法测定不同着色剂检出的灵敏度、精密度和准确度均获得满意的结果，且满足分析要求，为蛋糕中合成着色剂的检测提供了很好的依据。
参考文献：
[1]郑鹏然，周树南，主编.食品卫生全书[M].北京：红旗出版社，1996，424.
[2]高鹤娟，主编.食品理化检验方法“理化部分”注解[M].卫生部食品卫生监督检验所，1987，257-259.
[3]中华人民共和国卫生部.GB2760—2011食品安全国家标准-食品添加剂使用标准[S].北京：中国标准出版社，2012.
[4]中华人民共和国卫生部.GB/T5009.35-2003食品中合成着色剂的测定[S].北京：中国标准出版社，2004.
[5]阮丽萍，吉文亮，刘华良，等.高效液相色谱法同时测定食品中10种合成着色剂[J].中国食品卫生杂志，2011，23（2）.
[6]李必斌.食用合成色素检测方法的研究进展[J].中国卫生检验杂志，2002，12（6）
[7]郭平，金会会，李瑾瑾等.高效液相色谱法同时测定饮料中十种合成着色剂[C].食品安全技术与标准国际研讨会暨AOAC中国区会议论文集，2011.
[8]林建忠.HPLC法测定食品中色素条件优化的研究[J].中国卫生检验杂志，1998， 8（4）：205-206.