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摘要 采用热水浸提和乙醇沉淀法提取金针菇子实体多糖，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法来优化多糖的工艺条件。结果表明，多糖提取的最优条件为水料比40，浸提时间2.26 h，浸提温度95 ℃，粗多糖得率为3.82%。
关键词 金针菇子实体多糖；Box-Behnken试验设计；热水浸提
中图分类号 TQ914.1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）08-0159-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.042
Abstract The polysaccharides were prepared by hot water extraction and ethanol precipitation.The method of response surface analysis was used to optimize the technological conditions of polysaccharide on the basis of single factor test.The results showed that the optimal conditions were as follows：watermaterial ratio 40，extraction time 2.26 h，extraction temperature 95 ℃，crude polysaccharide yield 3.82%.
Key words Polysaccharide form Flammulina velutipes；BoxBehnken design；Hot water extraction
金針菇（Flammulina velutipes）又名朴菇、冬菇、构菌、毛柄金钱菌，其子实体是一种营养丰富、药理作用广泛的药食两用真菌[1-3]。金针菇富含蛋白质、碳水化合物、维生素和粗纤维，不仅含有锌、锰、铁、硒、铜等多种微量元素，还富含多种人体必需氨基酸，是一种不可多得的高营养食品[4-5]。由于金针菇含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、倍半萜、火菇素等多种生物活性物质，因此被认为具有很高的药用价值[1，6]。
金针菇多糖是金针菇中含量最为丰富的生物活性成分[7]。目前已经分离到数百种具有生理活性的多糖[8]，金针菇多糖具有护肝[9]、抗氧化、延缓衰老[10]、降低胆固醇、预防心血管疾病[11]、抗肿瘤[12] 、消炎、抗病毒、提高记忆力[13]等多种生理活性，已成为食品科学、天然产物、生物化学与生命科学领域的研究热点。近年来，由于天然提取物的安全优势，开发和利用天然防腐剂已成为发展趋势，黄琼等[14]测试了金针菇多糖对细菌、真菌的抑制作用，阐述了金针菇多糖对食品防腐具有一定的作用，有望开发为广谱、高效、低毒的新型防腐剂。目前，金针菇工厂化生产发展十分迅猛，其产量仅次于双孢蘑菇和香菇，被列为第三大食用菌[7]。在食用鲜菇产量急剧增加的同时，提高金针菇的产后附加值，开展金针菇多糖的研究显得尤为重要。金针菇多糖提取工艺参数不同，多糖得率差异很大，为提高多糖得率，进行提取工艺参数的筛选显得尤为重要。笔者采用对多糖结构影响小的热水浸提法提取金针菇多糖，进行不同提取工艺参数的筛选，并用响应面分析法对工艺进行优化，以期筛选出多糖提取的最佳工艺条件。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 试验所用金针菇子实体购于武汉市江夏区阳光好又多量贩超市，葡萄糖、无水乙醇、正丁醇、氯仿等试剂皆为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 主要仪器 电子粉碎机、DHG-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵、RE-52A旋转蒸发器、HH-6恒温水浴锅、AL104电子天平、TG16-WS高速台式离心机。
1.3 金针菇子实体多糖的浸提 将金针菇子实体于烘箱中60 ℃过夜烘干至恒重，烘干后放入粉碎机粉碎，过60目筛，制得金针菇干粉。称取金针菇干粉5 g，加适量85%乙醇室温下浸泡2 h去脂，5 000 r/min离心12 min，小心倾倒去上清液，挥发干净乙醇，按水料比20∶1加入蒸馏水，90 ℃条件下浸提2 h。水浴结束后，5 000 r/min离心15 min取上清，将沉淀反复用蒸馏水洗涤2次，合并上清提取液，向提取液中加入Sevag试剂，样品与试剂比为1∶0.2，振荡萃取，取上层液，重复3次。萃取液经旋转蒸发器浓缩至原体积的1/5～1/4。向浓缩液中加入3倍体积的70%乙醇，沉淀多糖，静置过夜，5 000 r/min离心15 min，取沉淀于60 ℃烘箱烘干至恒重。
多糖提取率=多糖质量（g）/干粉质量（g）×100%
1.4 单因素试验
1.4.1 水料比对金针菇子实体多糖得率的影响。取金针菇干粉5 g，分别加50、100、150、200、250 mL蒸馏水，其他同“1.3”，以蒸馏水作为空白对照，每个处理3个平行试验，取各提取率的平均值。
1.4.2 浸提时间对金针菇子实体多糖得率的影响。取金针菇干粉5 g，分别浸提1、2、3、4、5 h，其他同“1.3”，以蒸馏水作为空白对照，每个处理3个平行试验，取各提取率的平均值。
1.4.3 浸提温度对金针菇子实体多糖得率的影响。取金针菇干粉5 g，分别在55、65、75、85、95、100 ℃下浸提，其他同“1.3”，以蒸馏水作为空白对照，每个处理3个平行试验，取各提取率的平均值。
1.5 最佳工艺的响应面法优化 在单因素试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取水料比（X1）、浸提时间（X2）、浸提温度（X3）为考察对象，以金针菇子实体多糖得率（Y）为响应值，采用3因素3水平响应面分析法确定最佳提取工艺条件，试验因素水平见表1。 2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 水料比对金针菇子实体多糖提取率的影响。在水料比小于30时，金针菇子实体多糖得率逐渐升高，在水料比为30时，金针菇子实体多糖得率为3.59%（图1），之后水料比继续增大，但金针菇子实体粗多糖得率呈下降趋势。因此，最佳水料比为30。
2.1.3 浸提温度对金针菇子实体多糖提取率的影响。浸提温度低于75 ℃，多糖得率普遍偏低且变化不大，75～95 ℃多糖得率上升趋势很明显（图3），在95 ℃粗多糖得率达到最大值3.56%，温度再上升，粗多糖得率开始下降。
2.2 Box-Behnken试验设计优化金针菇子实体多糖提取条件
2.2.1 模型方程的建立和显著性检验。金针菇子实体多糖提取工艺的响应面试验方案及结果见表2。
利用 Design-Expert.V8.0.6软件对17个试验点的金针菇子实体多糖产量进行回归统计分析。方差分析和显著性检验结果表明，模型P值小于 0.000 1，说明得出的回归方程的关系是显著的。回归模型的失拟项P=0.278 4>0.05，失拟项差异不显著，所以在被检测变量值即浸提时间、浸提温度、水料比3个因素随意组合的情况下，用该模型方程预测金针菇子实体粗多糖的得率都是合适的。3因素对金针菇子实体多糖得率影响作用由大到小顺序为浸提温度、浸提时间、水料比，且浸提温度和水料比对金针菇子实体多糖得率的线性影响显著，而浸提时间对金针菇子实体多糖得率的影响不显著。
2.2.2 各因素间的相互影响。通过三维响应曲面图和等高线图可以直观观察各个因素（水料比、浸提温度、浸提时间）对响应值（金针菇子实体粗多糖得率）的影響以及各因素之间的交互作用。等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，如果2个因素的交互作用显著，等高线表现为椭圆形，若2个因素的交互作用不显著，等高线则反映为圆形。
图4表明水料比和浸提时间的交互作用不显著。金针菇子实体多糖得率随浸提时间增加其上升趋势并不显著，随水料比增大而有所提高。
图5结果显示，浸提温度和水料比的交互作用不显著。金针菇子实体多糖得率在水料比增大的情况下有小幅度增加的趋势，在浸提温度低于90 ℃时金针菇子实体多糖得率逐渐提高，当温度超出这个范围后金针菇子实体多糖得率开始缓慢下降。
图6表明浸提时间与浸提温度的交互作用不显著。金针菇子实体多糖得率在浸提时间升高的同时稍许上升但并不显著，在浸提温度低于90 ℃时金针菇子实体多糖得率逐渐提高，当温度超出这个范围后金针菇子实体多糖得率开始缓慢下降。
2.2.3 响应面方程优化配置。运用Design-Expert.V8.0.6软件通过多元回归拟合，获得金针菇子实体多糖得率与自变量水料比、浸提时间、浸提温度之间的二次多项回归方程：
Y=3.74+0.12X1+0.14X2+0.47X3+0.057X1X2-0.002 5X1X3+0.02X2X3-0.19X12-0.41X22-0.45X32
通过Design-Expert.V8.0.6软件求偏微分方程得到最佳条件为水料比40，浸提时间2.26 h，浸提温度95.21 ℃（为方便实际操作取95 ℃），粗多糖得率为3.82%。为检验该优化工艺的可靠性，采用上述最优提取条件进行验证性试验，得到金针菇多糖产量的验证值为4.02%，与理论值相近，说明该优化条件可信。因此，利用Box-Behnken试验设计优化金针菇子实体多糖提取工艺是有效可行的。
3 结论
通过单因素和Box-Behnken响应面试验得到金针菇子实体多糖的最佳提取工艺条件为水料比40，浸提时间2.26 h，浸提温度95 ℃，在此工艺条件下，粗多糖得率为3.82%。通过与其他提取方法比较，该工艺具有较高的提取率，冯昆等[15]在最优条件下提取金针菇子实体多糖得率为1.54%。采用热水浸提和乙醇沉淀法提取金针菇子实体多糖工艺简单、费时少且成本低，利用Box-Behnken试验设计得到金针菇子实体多糖提取条件多糖得率高，具有推广应用的价值，可为工业化生产提供必要的技术支持，后期将进一步对金针菇多糖组成结构和抑菌活性展开研究。
参考文献
[1]韩乐，韩伟，张美彦，等.金针菇子实体有机溶剂提取物的生物活性[J].菌物学报，2016，35（2）：178-187.
[2] 许昭仪，李浩，张平.金针菇生活史各阶段核相研究[J].菌物学报，2015，34（3）：386-393.
[3] 高琼，邓志峰，迟全勃，等.食用菌居家栽培产品的研究[J].北方园艺，2015（5）：148-150.
[4] 安琪，吴雪君，吴冰，等.不同碳源和氮源对金针菇降解木质纤维素酶活性的影响[J].菌物学报，2015，34（4）：761-771.
[5] 米青荣，刘贵巧，王秋敏，等.邯郸市金针菇品种资源调查及优良品种筛选试验[J].北方园艺，2015（20）：130-133.
[6] 周素娟，张晓娜.食用菌保健功能及保健食品应用与开发[J].中国食用菌，2015，34（1）：4-6.
[7] 李文香，樊铭聪，张圣杰，等.金针菇多糖组成的探讨与分析[J].中国食用菌，2015，34（2）：60-65.
[8] 张占军，张艳艳.多糖分子修饰研究进展[J].食品工业，2017，38（5）：253-257.
[9] PANG X B，YAO W B，YANG X B，et al.Purification，characterization and biological activity on hepatocytes of a polysaccharide from Flammulina velutipes mycelium[J].Carbohydrate polymers，2007，70：291-297.
[10] 叶敏.金针菇多糖的提取及清除羟自由基活性研究[J].毕节学院学报，2011，29（4）：90-94.
[11] 王玉峰，王旻，尹鸿萍.金针菇菌丝体中多糖的分离、结构鉴定及免疫学活性[J].中国天然药物，2008，6（4）：312-315.
[12] LEUNG M Y K，FUNG K P，CHOY Y M.The isolation and characterization of an immunomodulatory and anti-tumor polysaccharide preparation from Flammulina velutipes[J].Immunopharmacology，1997，70：255-263.
[13] 王卫国，张仟伟，李瑞静，等.金针菇多糖的生理功能及其应用研究进展[J].河南工业大学学报（自然科学版），2016，37（1）：120-128.
[14] 黄琼，马仲文，赖腾强.金针菇多糖抑菌作用的研究[J].食品研究与开发，2015，36（1）：10-12.
[15] 冯昆，张东杰，张涧铮，等.金针菇多糖提取条件的优化[J].黑龙江八一农垦大学学报，2005，17（5）：73-76.
关键词 金针菇子实体多糖；Box-Behnken试验设计；热水浸提
中图分类号 TQ914.1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）08-0159-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.08.042
Abstract The polysaccharides were prepared by hot water extraction and ethanol precipitation.The method of response surface analysis was used to optimize the technological conditions of polysaccharide on the basis of single factor test.The results showed that the optimal conditions were as follows：watermaterial ratio 40，extraction time 2.26 h，extraction temperature 95 ℃，crude polysaccharide yield 3.82%.
Key words Polysaccharide form Flammulina velutipes；BoxBehnken design；Hot water extraction
金針菇（Flammulina velutipes）又名朴菇、冬菇、构菌、毛柄金钱菌，其子实体是一种营养丰富、药理作用广泛的药食两用真菌[1-3]。金针菇富含蛋白质、碳水化合物、维生素和粗纤维，不仅含有锌、锰、铁、硒、铜等多种微量元素，还富含多种人体必需氨基酸，是一种不可多得的高营养食品[4-5]。由于金针菇含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、倍半萜、火菇素等多种生物活性物质，因此被认为具有很高的药用价值[1，6]。
金针菇多糖是金针菇中含量最为丰富的生物活性成分[7]。目前已经分离到数百种具有生理活性的多糖[8]，金针菇多糖具有护肝[9]、抗氧化、延缓衰老[10]、降低胆固醇、预防心血管疾病[11]、抗肿瘤[12] 、消炎、抗病毒、提高记忆力[13]等多种生理活性，已成为食品科学、天然产物、生物化学与生命科学领域的研究热点。近年来，由于天然提取物的安全优势，开发和利用天然防腐剂已成为发展趋势，黄琼等[14]测试了金针菇多糖对细菌、真菌的抑制作用，阐述了金针菇多糖对食品防腐具有一定的作用，有望开发为广谱、高效、低毒的新型防腐剂。目前，金针菇工厂化生产发展十分迅猛，其产量仅次于双孢蘑菇和香菇，被列为第三大食用菌[7]。在食用鲜菇产量急剧增加的同时，提高金针菇的产后附加值，开展金针菇多糖的研究显得尤为重要。金针菇多糖提取工艺参数不同，多糖得率差异很大，为提高多糖得率，进行提取工艺参数的筛选显得尤为重要。笔者采用对多糖结构影响小的热水浸提法提取金针菇多糖，进行不同提取工艺参数的筛选，并用响应面分析法对工艺进行优化，以期筛选出多糖提取的最佳工艺条件。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 试验所用金针菇子实体购于武汉市江夏区阳光好又多量贩超市，葡萄糖、无水乙醇、正丁醇、氯仿等试剂皆为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 主要仪器 电子粉碎机、DHG-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵、RE-52A旋转蒸发器、HH-6恒温水浴锅、AL104电子天平、TG16-WS高速台式离心机。
1.3 金针菇子实体多糖的浸提 将金针菇子实体于烘箱中60 ℃过夜烘干至恒重，烘干后放入粉碎机粉碎，过60目筛，制得金针菇干粉。称取金针菇干粉5 g，加适量85%乙醇室温下浸泡2 h去脂，5 000 r/min离心12 min，小心倾倒去上清液，挥发干净乙醇，按水料比20∶1加入蒸馏水，90 ℃条件下浸提2 h。水浴结束后，5 000 r/min离心15 min取上清，将沉淀反复用蒸馏水洗涤2次，合并上清提取液，向提取液中加入Sevag试剂，样品与试剂比为1∶0.2，振荡萃取，取上层液，重复3次。萃取液经旋转蒸发器浓缩至原体积的1/5～1/4。向浓缩液中加入3倍体积的70%乙醇，沉淀多糖，静置过夜，5 000 r/min离心15 min，取沉淀于60 ℃烘箱烘干至恒重。
多糖提取率=多糖质量（g）/干粉质量（g）×100%
1.4 单因素试验
1.4.1 水料比对金针菇子实体多糖得率的影响。取金针菇干粉5 g，分别加50、100、150、200、250 mL蒸馏水，其他同“1.3”，以蒸馏水作为空白对照，每个处理3个平行试验，取各提取率的平均值。
1.4.2 浸提时间对金针菇子实体多糖得率的影响。取金针菇干粉5 g，分别浸提1、2、3、4、5 h，其他同“1.3”，以蒸馏水作为空白对照，每个处理3个平行试验，取各提取率的平均值。
1.4.3 浸提温度对金针菇子实体多糖得率的影响。取金针菇干粉5 g，分别在55、65、75、85、95、100 ℃下浸提，其他同“1.3”，以蒸馏水作为空白对照，每个处理3个平行试验，取各提取率的平均值。
1.5 最佳工艺的响应面法优化 在单因素试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取水料比（X1）、浸提时间（X2）、浸提温度（X3）为考察对象，以金针菇子实体多糖得率（Y）为响应值，采用3因素3水平响应面分析法确定最佳提取工艺条件，试验因素水平见表1。 2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 水料比对金针菇子实体多糖提取率的影响。在水料比小于30时，金针菇子实体多糖得率逐渐升高，在水料比为30时，金针菇子实体多糖得率为3.59%（图1），之后水料比继续增大，但金针菇子实体粗多糖得率呈下降趋势。因此，最佳水料比为30。
2.1.3 浸提温度对金针菇子实体多糖提取率的影响。浸提温度低于75 ℃，多糖得率普遍偏低且变化不大，75～95 ℃多糖得率上升趋势很明显（图3），在95 ℃粗多糖得率达到最大值3.56%，温度再上升，粗多糖得率开始下降。
2.2 Box-Behnken试验设计优化金针菇子实体多糖提取条件
2.2.1 模型方程的建立和显著性检验。金针菇子实体多糖提取工艺的响应面试验方案及结果见表2。
利用 Design-Expert.V8.0.6软件对17个试验点的金针菇子实体多糖产量进行回归统计分析。方差分析和显著性检验结果表明，模型P值小于 0.000 1，说明得出的回归方程的关系是显著的。回归模型的失拟项P=0.278 4>0.05，失拟项差异不显著，所以在被检测变量值即浸提时间、浸提温度、水料比3个因素随意组合的情况下，用该模型方程预测金针菇子实体粗多糖的得率都是合适的。3因素对金针菇子实体多糖得率影响作用由大到小顺序为浸提温度、浸提时间、水料比，且浸提温度和水料比对金针菇子实体多糖得率的线性影响显著，而浸提时间对金针菇子实体多糖得率的影响不显著。
2.2.2 各因素间的相互影响。通过三维响应曲面图和等高线图可以直观观察各个因素（水料比、浸提温度、浸提时间）对响应值（金针菇子实体粗多糖得率）的影響以及各因素之间的交互作用。等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，如果2个因素的交互作用显著，等高线表现为椭圆形，若2个因素的交互作用不显著，等高线则反映为圆形。
图4表明水料比和浸提时间的交互作用不显著。金针菇子实体多糖得率随浸提时间增加其上升趋势并不显著，随水料比增大而有所提高。
图5结果显示，浸提温度和水料比的交互作用不显著。金针菇子实体多糖得率在水料比增大的情况下有小幅度增加的趋势，在浸提温度低于90 ℃时金针菇子实体多糖得率逐渐提高，当温度超出这个范围后金针菇子实体多糖得率开始缓慢下降。
图6表明浸提时间与浸提温度的交互作用不显著。金针菇子实体多糖得率在浸提时间升高的同时稍许上升但并不显著，在浸提温度低于90 ℃时金针菇子实体多糖得率逐渐提高，当温度超出这个范围后金针菇子实体多糖得率开始缓慢下降。
2.2.3 响应面方程优化配置。运用Design-Expert.V8.0.6软件通过多元回归拟合，获得金针菇子实体多糖得率与自变量水料比、浸提时间、浸提温度之间的二次多项回归方程：
Y=3.74+0.12X1+0.14X2+0.47X3+0.057X1X2-0.002 5X1X3+0.02X2X3-0.19X12-0.41X22-0.45X32
通过Design-Expert.V8.0.6软件求偏微分方程得到最佳条件为水料比40，浸提时间2.26 h，浸提温度95.21 ℃（为方便实际操作取95 ℃），粗多糖得率为3.82%。为检验该优化工艺的可靠性，采用上述最优提取条件进行验证性试验，得到金针菇多糖产量的验证值为4.02%，与理论值相近，说明该优化条件可信。因此，利用Box-Behnken试验设计优化金针菇子实体多糖提取工艺是有效可行的。
3 结论
通过单因素和Box-Behnken响应面试验得到金针菇子实体多糖的最佳提取工艺条件为水料比40，浸提时间2.26 h，浸提温度95 ℃，在此工艺条件下，粗多糖得率为3.82%。通过与其他提取方法比较，该工艺具有较高的提取率，冯昆等[15]在最优条件下提取金针菇子实体多糖得率为1.54%。采用热水浸提和乙醇沉淀法提取金针菇子实体多糖工艺简单、费时少且成本低，利用Box-Behnken试验设计得到金针菇子实体多糖提取条件多糖得率高，具有推广应用的价值，可为工业化生产提供必要的技术支持，后期将进一步对金针菇多糖组成结构和抑菌活性展开研究。
参考文献
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[12] LEUNG M Y K，FUNG K P，CHOY Y M.The isolation and characterization of an immunomodulatory and anti-tumor polysaccharide preparation from Flammulina velutipes[J].Immunopharmacology，1997，70：255-263.
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[15] 冯昆，张东杰，张涧铮，等.金针菇多糖提取条件的优化[J].黑龙江八一农垦大学学报，2005，17（5）：73-76.