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【摘 要】 目的：采用高效液相色谱法测定片剂中枸橼酸托法替布的含量。方法：以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钠（80∶20）为流动相A，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠（20∶80）为流动相B，梯度洗脱；柱温为35 ℃；检测波长为286 nm。结果：线性范围为20.02～100.23mg/ml（R=0.9998）；样品溶液在8 h内稳定；平均回收率为99.91%，RSD<1.0%（n=9）。结论：采用高效液相色谱法测定枸橼酸托法替布的含量，方法灵敏度高，专属性强，结果准确可靠。
【关键词】 HPLC；枸橼酸托法替布片；含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）17-0023-02
Abstract：Objective To establish the HPLC method for the determination of content of tofacitinib citrate tablets. Methods Octadecyl silane and silica were used as the stationary phase. The mobile phase was consisted of A（acetonitrile： 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate=80∶20） and B（acetonitrile∶0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate=20∶80）. The column temperature was 35℃.The detection wavelength was 286 nm.Results The method was proved to be linear in the range of 20.02～100.23 mg/ml（R=0.9998）； Sample solution was stable in 8h，which the average recovery was 99.91%，RSD<1.0% and the repetity was 1.47%. Conclusion The method was sensitive， specific， reliable.
Keywords：HPLC； Tofacitinib citrate tablets； Content determination
枸橼酸托法替布（tofacitinib citrate）为美国辉瑞公司（Pfizer）研发的的一种JAK3激酶抑制剂[1]，临床主要用于对甲氨蝶呤治疗反应不足或不耐受的中度至重度活动性类风湿性关节炎（RA）的治疗。目前，多数RA药物通过对细胞外靶点进行调控来治疗RA，而托法替布以细胞内信号转导通路为靶点，直接作用于细胞因子网络的核心部分[2]。托法替布（tofacitinib）对JAK3的抑制强度是JAK1、JAK2的5～100倍[3]，是类风湿性关节炎治疗的首创药物（first-in-class drug）。2012年美国食品药品监督管理局（FDA）批准该物质为药品上市。笔者对片剂中枸橼酸托法替布的含量检测方法进行探索，为枸橼酸托法替布片剂的质量控制提供实验依据。
1 仪器和材料
1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪（包括四元泵、自动进样器、VWD检测器，美国Agilent 公司）；AB265-S电子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。
1.2 材料 枸橼酸托法替布片（杭州民生药业有限公司）；枸橼酸托法替布对照品（批号：120109-178146，中国生物制品检定所）；甲醇为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水；其它试剂为分析纯。
2 方法和结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 供试品溶液 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量细粉（相当于15mg枸橼酸托法替布），置25ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度；精密量取1.0ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液 精密称取枸橼酸托法替布对照品10mg，置50ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度；精密量取3.0ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为对照品溶液。
2.1.3 空白辅料溶液 取本品的空白辅料混合物0.2g，置50ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。
2.2 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠（80∶20）为流动相A，以乙腈-0.05mol/磷酸二氢钠（20∶80）为流动相B，按表1进行梯度洗脱。流速：1.0ml/min；检测波长：286nm。理论板数按托法替布峰计算不低于3500。
2.3 空白辅料干扰试验 精密吸取供试品溶液，对照品溶液和空白辅料溶液各10μl，注入色谱仪中，记录色谱图。在托法替布相应的保留时间处，空白辅料溶液无相关吸收峰，对测定无干扰。
2.4 线性关系考察 取枸橼酸托法替布对照品约5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度；精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成梯度浓度溶液；精密量取10μl，记录峰面积，以峰面积A为纵坐标，样品浓度C（以枸橼酸托法替布计）为横坐标，进行线性回归，得回归方程y=536x+3.28，r=0.9998。试验结果表明，枸橼酸托法替布在20.02～100.23mg/ml之间，浓度与峰面积呈良好的线性关系。 2.5 精密度试验 取线性及范围项下的0.06mg/ml溶液，连续进样6次，考察仪器精密度。结果RSD为0.87%（n=6），表明仪器的精密度较好。
2.6 稳定性试验 取线性及范围项下的 0.06mg/ml溶液，分别在0、2、4、6、8h进样10μl，计算其含量。RSD为1.32%（n=5），表明样品溶液在8小时内稳定，可以满足样品测试要求。
2.7 重复性试验 取同一批号样品6份，按照供试品溶液配制方法配制溶液，进样10μl，样品含量平均值为99.53%，RSD为1.47%（n=6）。表明该方法的重复性较好。
2.8 中间精密度试验 由不同试验人员于不同时间使用不同仪器，照上述方法测定同一批号样品的含量，平行测定6次。结果样品的平均含量98.49%，RSD为1.52%，表明该方法的中间精密度较好。
2.9 回收率试验 采用模拟回收率试验方法，取本品12、15、18mg各三份，分别于25ml容量瓶中，加入空白辅料0.2g，加流动相超声溶解并稀释至刻度，精密量取1ml至10ml容量瓶，按照上述条件进行测定，计算含量和回收率。结果平均回收率为99.91%，RSD<1.0%（n=9），见表2。
2.10 样品含量测定 取样品三批，按照“2.1.1”项下制备方法制备供试品溶液，进样10μl，采用外标法，以峰面积计算含量，结果见表3。
3 讨论
3.1 检测方法的筛选 枸橼酸托法替布含量测定方法学考察过程中，曾试过不同的流动相进行试验，试图通过等梯度的流动相，将枸橼酸托法替布分离出来，达到系统适用性的要求，试验结果发现其效果并不明显。因此采用不同梯度的流动相进行洗脱。
3.2 溶液配制方法 枸橼酸托法替布片规格为5mg，单片片重比较小，供试品溶液和对照品的溶液，最终选择2次配置的方式来实现，这有助于检测人员操作，减少实验相对误差。
参考文献
[1] 范鸣.抗类风湿性关节炎药Tofacitini [J].药学进展，2011，35（10）：480.
[2] Kunihiro Y， Satoshi K， Koshiro S， et al. JAK inhibitor： tofacitinib， a new disease modifying anti-rheumatic drug [J]. Inflamm Regener， 2011， 31（4）： 349-353.
[3]Vijayakrishnan L， Venkataramanan R， Gulati P. Treating inflammation with the janus kinase inhibitor CP-690550 [J]. Trends Pharm Sci， 2011， 32（1）： 25-34.
（收稿日期：2015.05.18）
【关键词】 HPLC；枸橼酸托法替布片；含量测定
【中图分类号】R927.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）17-0023-02
Abstract：Objective To establish the HPLC method for the determination of content of tofacitinib citrate tablets. Methods Octadecyl silane and silica were used as the stationary phase. The mobile phase was consisted of A（acetonitrile： 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate=80∶20） and B（acetonitrile∶0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate=20∶80）. The column temperature was 35℃.The detection wavelength was 286 nm.Results The method was proved to be linear in the range of 20.02～100.23 mg/ml（R=0.9998）； Sample solution was stable in 8h，which the average recovery was 99.91%，RSD<1.0% and the repetity was 1.47%. Conclusion The method was sensitive， specific， reliable.
Keywords：HPLC； Tofacitinib citrate tablets； Content determination
枸橼酸托法替布（tofacitinib citrate）为美国辉瑞公司（Pfizer）研发的的一种JAK3激酶抑制剂[1]，临床主要用于对甲氨蝶呤治疗反应不足或不耐受的中度至重度活动性类风湿性关节炎（RA）的治疗。目前，多数RA药物通过对细胞外靶点进行调控来治疗RA，而托法替布以细胞内信号转导通路为靶点，直接作用于细胞因子网络的核心部分[2]。托法替布（tofacitinib）对JAK3的抑制强度是JAK1、JAK2的5～100倍[3]，是类风湿性关节炎治疗的首创药物（first-in-class drug）。2012年美国食品药品监督管理局（FDA）批准该物质为药品上市。笔者对片剂中枸橼酸托法替布的含量检测方法进行探索，为枸橼酸托法替布片剂的质量控制提供实验依据。
1 仪器和材料
1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪（包括四元泵、自动进样器、VWD检测器，美国Agilent 公司）；AB265-S电子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。
1.2 材料 枸橼酸托法替布片（杭州民生药业有限公司）；枸橼酸托法替布对照品（批号：120109-178146，中国生物制品检定所）；甲醇为色谱纯；磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水；其它试剂为分析纯。
2 方法和结果
2.1 溶液的配制
2.1.1 供试品溶液 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量细粉（相当于15mg枸橼酸托法替布），置25ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度；精密量取1.0ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液 精密称取枸橼酸托法替布对照品10mg，置50ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度；精密量取3.0ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为对照品溶液。
2.1.3 空白辅料溶液 取本品的空白辅料混合物0.2g，置50ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。
2.2 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠（80∶20）为流动相A，以乙腈-0.05mol/磷酸二氢钠（20∶80）为流动相B，按表1进行梯度洗脱。流速：1.0ml/min；检测波长：286nm。理论板数按托法替布峰计算不低于3500。
2.3 空白辅料干扰试验 精密吸取供试品溶液，对照品溶液和空白辅料溶液各10μl，注入色谱仪中，记录色谱图。在托法替布相应的保留时间处，空白辅料溶液无相关吸收峰，对测定无干扰。
2.4 线性关系考察 取枸橼酸托法替布对照品约5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加流动相超声溶解并稀释至刻度；精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，制成梯度浓度溶液；精密量取10μl，记录峰面积，以峰面积A为纵坐标，样品浓度C（以枸橼酸托法替布计）为横坐标，进行线性回归，得回归方程y=536x+3.28，r=0.9998。试验结果表明，枸橼酸托法替布在20.02～100.23mg/ml之间，浓度与峰面积呈良好的线性关系。 2.5 精密度试验 取线性及范围项下的0.06mg/ml溶液，连续进样6次，考察仪器精密度。结果RSD为0.87%（n=6），表明仪器的精密度较好。
2.6 稳定性试验 取线性及范围项下的 0.06mg/ml溶液，分别在0、2、4、6、8h进样10μl，计算其含量。RSD为1.32%（n=5），表明样品溶液在8小时内稳定，可以满足样品测试要求。
2.7 重复性试验 取同一批号样品6份，按照供试品溶液配制方法配制溶液，进样10μl，样品含量平均值为99.53%，RSD为1.47%（n=6）。表明该方法的重复性较好。
2.8 中间精密度试验 由不同试验人员于不同时间使用不同仪器，照上述方法测定同一批号样品的含量，平行测定6次。结果样品的平均含量98.49%，RSD为1.52%，表明该方法的中间精密度较好。
2.9 回收率试验 采用模拟回收率试验方法，取本品12、15、18mg各三份，分别于25ml容量瓶中，加入空白辅料0.2g，加流动相超声溶解并稀释至刻度，精密量取1ml至10ml容量瓶，按照上述条件进行测定，计算含量和回收率。结果平均回收率为99.91%，RSD<1.0%（n=9），见表2。
2.10 样品含量测定 取样品三批，按照“2.1.1”项下制备方法制备供试品溶液，进样10μl，采用外标法，以峰面积计算含量，结果见表3。
3 讨论
3.1 检测方法的筛选 枸橼酸托法替布含量测定方法学考察过程中，曾试过不同的流动相进行试验，试图通过等梯度的流动相，将枸橼酸托法替布分离出来，达到系统适用性的要求，试验结果发现其效果并不明显。因此采用不同梯度的流动相进行洗脱。
3.2 溶液配制方法 枸橼酸托法替布片规格为5mg，单片片重比较小，供试品溶液和对照品的溶液，最终选择2次配置的方式来实现，这有助于检测人员操作，减少实验相对误差。
参考文献
[1] 范鸣.抗类风湿性关节炎药Tofacitini [J].药学进展，2011，35（10）：480.
[2] Kunihiro Y， Satoshi K， Koshiro S， et al. JAK inhibitor： tofacitinib， a new disease modifying anti-rheumatic drug [J]. Inflamm Regener， 2011， 31（4）： 349-353.
[3]Vijayakrishnan L， Venkataramanan R， Gulati P. Treating inflammation with the janus kinase inhibitor CP-690550 [J]. Trends Pharm Sci， 2011， 32（1）： 25-34.
（收稿日期：2015.05.18）