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[摘要]目的探讨小凹蛋白_1（Cav_1）在冠心病（CAD）合并2型糖尿病（T2DM）患者中的表达及其意义。方法选择148例经冠状动脉造影及临床证实的CAD患者，其中合并T2DM患者94例，单纯CAD54例，另选取无冠状动脉病变及糖尿病16例为对照组。用流式细胞技术检测各组外周血单核细胞Cav_1的表达水平，全自动生化分析仪测定高敏C反应蛋白（hs_CRP）及空腹血糖（FBG）。结果CAD合并T2DM患者外周血单核细胞Cav_1表达水平显著低于对照组及单纯CAD组，差异有统计学意义（P<0.01，<0.05）；CAD合并T2DM组血清hs_CRP的水平显著高于单纯CAD组及对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。单核细胞Cav_1的表达水平与hs_CRP及空腹血糖呈负相关（r=-0.47、-0.31，均P<0.01）。多元Logistic回归分析显示CAD合并T2DM与Cav_1及FBG密切相关（OR=0.97、3.44，均P<0.05）。结论Cav_1表达低下是发生CAD合并T2DM的一个危险因素，并在一定程度上可预测CAD合并T2DM的发生。
[关键词]小凹蛋白_1；高敏C反应蛋白；冠心病；2型糖尿病；血糖
中图分类号：R541.4文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）04_0290_03
[Abstract] Objective To investigate the expression of Caveolin_1（Cav_1）in coronary artery disease （CAD） complicated with type 2 diabetes mellitus （T2DM）. Methods Cav_1 level was measured in peripheral blood mononuclear cells using flow cytometry among 94 CAD complicated with T2DM patients and 54 CAD patients， which CAD was diagnosed by coronary angiography and clinical manifestation， while 16 patients without CAD and T2DM were enrolled as normal control group. High_sensitivity C reactive protein （hs_CRP） and fasting blood glucose （FBG） level were detected by automatic biochemistry analyzer. Results Compared with normal control and CAD group， the expression of Cav_1 in CAD complicated with T2DM patients was significantly lower（P<0.01，<0.05） and the level of hs_CRP in CAD complicated with T2DM group was extremely higher （P<0.01）. Furthermore， the expression of Cav_1 was negative correlated with hs_CRP and FBG （r=-0.47、-0.31，P<0.01）. The multiple logistic regression indicated that CAD complicated with T2DM and Cav_1、FBG were closely related（OR=0.97、3.44，P<0.05）. Conclusions The lower level of expression of Cav_1 on peripheral blood mononuclear cells is one risk factor for CAD complicated with T2DM， to some extent， may be a possible predicting index for CAD with T2DM.
[Key words] Caveolin_1； High_sensitivity Creactive protein； Coronary artery disease； Type 2 diabetes mellitus； Blood glucose
糖尿病（DM）是一种以血糖代谢紊乱为特点的常见慢性疾病，不仅增加冠心病（CAD）及中风（Stroke）的风险[1]，而且增加急性心肌梗死（AMI）及中风的死亡率。小凹蛋白_1（Caveolin_1，Cav_1）是表达于细胞膜小凹（Caveolae）的重要蛋白，维持着小凹的完整性。Cav_1的异常表达与许多疾病密切相关，包括动脉硬化、肿瘤、肌营养不良、早老性痴呆及糖尿病等。Toshio[2]提出高糖环境下人白血病单核细胞株（THP_1）来源的巨噬细胞Cav_1表达水平下调，小凹数量减少，促进巨噬细胞凋亡及泡沫细胞形成，与动脉粥样硬化形成有关。位于人类动脉斑块中的巨噬细胞来自血液单核细胞，本研究观察冠心病合并2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）患者外周血单核细胞Cav_1表达、血清高敏C反应蛋白及血糖的变化，并探讨其临床意义。
1资料与方法
1.1一般资料：所有受试者均为台州医院心内科2009年3月至9月的连续住院患者。分为CAD合并T2DM组、单纯CAD组和不典型胸痛组。入选标准：根据1999年WHO糖尿病诊断分型标准将CAD患者分为冠心病合并T2DM组（54例）和单纯CAD组（94例），分别经冠脉造影证实左前降支（LAD）、回旋支（LCX）、右冠状动脉（RCA）中至少有1支血管内径狭窄≥50%。对照组（16例）：为不典型胸痛患者，经血生化检查、X线胸片、心电图、超声心动图及冠状动脉造影检查排除心脏疾患。排除标准：近1月内服用β受体阻滞药、调脂药或利尿药，肝纤维化、感染或肿瘤、近期重大外伤或手术、脑血管和周围血管病、自身免疫性疾病、严重肝肾疾病、严重的全身其他系统疾病、近期服用抗炎药、心肌炎等。 1.2方法：入院第二天清晨空腹抽取患者肘静脉血约5ml入EDTA抗凝管，取抗凝全血100μl，加入鼠抗人CD14_APC抗体（美国B_D公司）10ul，加入兔抗人Cav_1多克隆抗体（美国cell signaling公司）1ul，混匀避光15min后加入FITC标记的山羊抗兔多克隆抗体1ul，再次混匀避光15min后加入红细胞裂解液2ml，混匀避光10min，经800转/min离心6min后弃去上清液，予PBS液2ml重悬沉淀并振荡混匀，800转/min离心6min后弃去上清液，将细胞重悬于PBS液500ul中，以流式细胞仪检测，用cellquest软件检测和分析数据，以CD14/SSC设单核细胞门，分析其Cav_1表达的荧光强度。
如上再取肘静脉血，以日本奥林巴斯全自动生化分析仪测定高敏C反应蛋白（hs_CRP）、空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）等水平。
1.3统计学处理：使用SPSS12.0版统计软件。计量资料用（x-±s）表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多样本均数比较采用方差分析，不连续样本比较采用Kruskal_wallis检验，连续计量资料相关性采用Pearson相关性分析，不连续计量资料采用Spearman秩相关分析，影响CAD合并T2DM发生的变量应用Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1三组患者一般资料比较：三组患者年龄、性别构成、吸烟人数、高血压分布、血清总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸水平等因素比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
本研究发现单纯CAD组单核细胞Cav_1表达水平显著低于正常对照组，而CAD合并T2DM组Cav_1表达显著低于单纯CAD组。提示CAD合并T2DM患者冠状动脉粥样斑块不稳定，容易发生心血管事件。有报道发现，与单纯CAD患者比较，在血管内超声下CAD合并T2DM患者的冠脉病变更严重，不稳定斑块更多[7]。
大量数据表明，当2型糖尿病患者具有高水平的炎症标志物高敏C反应蛋白（high_sensitivity Creactive protein，hs_CRP）时，其冠心病病死率明显提高。高血糖是各型糖尿病的共同特征，也是糖尿病血管病变的危险因子，实验发现高糖能抑制单核细胞来源巨噬细胞Cav_1的表达[2]，能促进大鼠外周血白细胞介素_1、TNF_α升高[8]，后两种炎症介质均可导致CRP合成增加，与动脉粥样硬化形成存在联系。Cav_1在多种炎症反应发生发展中起重要调控作用。本研究通过检测血糖、hs_CRP水平及单核细胞Cav_1的表达，发现血糖水平与Cav_1呈负相关，CAD合并T2DM组单核细胞hs_CRP表达显著高于单纯CAD组及对照组，外周血单核细胞Cav_1水平与hs_CRP呈负相关。提示CAD合并T2DM患者慢性炎症反应的程度比单纯CAD患者更为严重，而外周血单核细胞Cav_1也可能参与血糖代谢及炎症过程，促进糖尿病患者动脉粥样硬化的发展，其作用机制仍需进一步研究。Logistic回归分析发现Cav_1是CAD合并T2DM的保护性因素（P=0.03），Cav_1低表达与糖尿病患者冠状动脉粥样硬化的发生和发展密切相关。
综上所述，CAD合并T2DM时，Cav_1表达水平明显降低，而hs_CRP表达水平明显增高。Cav_1与血糖水平、hs_CRP可能共同参与了CAD合并T2DM患者动脉粥样硬化的发生、发展过程。由于本研究样本量较少，需要更大规模和前瞻性的研究加以验证。
参考文献
[1]P McCarron， R Greenwood， P Elwood. The incidence and etiology of stroke in the Caerphilly and Speedwell Collaborative Studies II： risk factors for ischemic stroke[J]. Public Health，2001，115（1）：12-20.
[2]Hoya Shi T， Juliet Par， Mipazaki A， et al. High glucose downregulates the number of caveolae in monocytes through oxidative stress from NADPH oxidase： Implications for atherosclerosis[J]. Biochimicaet Biophysica Acta，2007，1772（3）：364-372.
[3]Jiang W， Li S， Mao W， et al. Effect of Huxin Formula on reverse cholesterol transport in ApoE_gene knockout mice[J]. Chin J Integr Med，2012，18（6）：451-6.
[4]Schwencke C， Schmeisser A， Walter C， et al. Decreased caveolin_1 in atheroma： loss of antiproliferative control of vascular smooth muscle cells in atherosclerosis[J]. Cardiovasc Res，2005，68（1）：128-135.
[5] Rodriguez_Feo JA， Hellings WE， Moll FL， et al. Caveolin_1 influences vascular protease activity and is a potential stabilizing factor in human atherosclerotic disease[J]. PLoS One，2008，3（7）：e2612.
[6]王琳，江建军，徐莎莎，等.急性冠脉综合征患者的小凹蛋白_1及白三烯B4表达[J].心脑血管病防治，2010，10（1）：12-14.
[7]Takayama T， Hiro T， Ueda Y， et al. Plaque stabilization by intensive LDL_cholesterol lowering therapy with atorvastatin is delayed in type 2 diabetic patients with coronary artery disease_Serial angioscopic and intravascular ultrasound analysis[J]. J Cardiol，2013，61（6）：381-386.
[8]Tanaka Y， Mochizuki K， Fukaya N， et al. The alpha_glucosidase inhibitor miglitol suppresses postprandial hyperglycaemia and interleukin_1beta and tumour necrosis factor_alpha gene expression in rat peripheral leucocytes induced by intermittent sucrose loading[J]. Br J Nutr，2009，102（2）：221-225.
（收稿日期：2013_12_26）
[关键词]小凹蛋白_1；高敏C反应蛋白；冠心病；2型糖尿病；血糖
中图分类号：R541.4文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）04_0290_03
[Abstract] Objective To investigate the expression of Caveolin_1（Cav_1）in coronary artery disease （CAD） complicated with type 2 diabetes mellitus （T2DM）. Methods Cav_1 level was measured in peripheral blood mononuclear cells using flow cytometry among 94 CAD complicated with T2DM patients and 54 CAD patients， which CAD was diagnosed by coronary angiography and clinical manifestation， while 16 patients without CAD and T2DM were enrolled as normal control group. High_sensitivity C reactive protein （hs_CRP） and fasting blood glucose （FBG） level were detected by automatic biochemistry analyzer. Results Compared with normal control and CAD group， the expression of Cav_1 in CAD complicated with T2DM patients was significantly lower（P<0.01，<0.05） and the level of hs_CRP in CAD complicated with T2DM group was extremely higher （P<0.01）. Furthermore， the expression of Cav_1 was negative correlated with hs_CRP and FBG （r=-0.47、-0.31，P<0.01）. The multiple logistic regression indicated that CAD complicated with T2DM and Cav_1、FBG were closely related（OR=0.97、3.44，P<0.05）. Conclusions The lower level of expression of Cav_1 on peripheral blood mononuclear cells is one risk factor for CAD complicated with T2DM， to some extent， may be a possible predicting index for CAD with T2DM.
[Key words] Caveolin_1； High_sensitivity Creactive protein； Coronary artery disease； Type 2 diabetes mellitus； Blood glucose
糖尿病（DM）是一种以血糖代谢紊乱为特点的常见慢性疾病，不仅增加冠心病（CAD）及中风（Stroke）的风险[1]，而且增加急性心肌梗死（AMI）及中风的死亡率。小凹蛋白_1（Caveolin_1，Cav_1）是表达于细胞膜小凹（Caveolae）的重要蛋白，维持着小凹的完整性。Cav_1的异常表达与许多疾病密切相关，包括动脉硬化、肿瘤、肌营养不良、早老性痴呆及糖尿病等。Toshio[2]提出高糖环境下人白血病单核细胞株（THP_1）来源的巨噬细胞Cav_1表达水平下调，小凹数量减少，促进巨噬细胞凋亡及泡沫细胞形成，与动脉粥样硬化形成有关。位于人类动脉斑块中的巨噬细胞来自血液单核细胞，本研究观察冠心病合并2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）患者外周血单核细胞Cav_1表达、血清高敏C反应蛋白及血糖的变化，并探讨其临床意义。
1资料与方法
1.1一般资料：所有受试者均为台州医院心内科2009年3月至9月的连续住院患者。分为CAD合并T2DM组、单纯CAD组和不典型胸痛组。入选标准：根据1999年WHO糖尿病诊断分型标准将CAD患者分为冠心病合并T2DM组（54例）和单纯CAD组（94例），分别经冠脉造影证实左前降支（LAD）、回旋支（LCX）、右冠状动脉（RCA）中至少有1支血管内径狭窄≥50%。对照组（16例）：为不典型胸痛患者，经血生化检查、X线胸片、心电图、超声心动图及冠状动脉造影检查排除心脏疾患。排除标准：近1月内服用β受体阻滞药、调脂药或利尿药，肝纤维化、感染或肿瘤、近期重大外伤或手术、脑血管和周围血管病、自身免疫性疾病、严重肝肾疾病、严重的全身其他系统疾病、近期服用抗炎药、心肌炎等。 1.2方法：入院第二天清晨空腹抽取患者肘静脉血约5ml入EDTA抗凝管，取抗凝全血100μl，加入鼠抗人CD14_APC抗体（美国B_D公司）10ul，加入兔抗人Cav_1多克隆抗体（美国cell signaling公司）1ul，混匀避光15min后加入FITC标记的山羊抗兔多克隆抗体1ul，再次混匀避光15min后加入红细胞裂解液2ml，混匀避光10min，经800转/min离心6min后弃去上清液，予PBS液2ml重悬沉淀并振荡混匀，800转/min离心6min后弃去上清液，将细胞重悬于PBS液500ul中，以流式细胞仪检测，用cellquest软件检测和分析数据，以CD14/SSC设单核细胞门，分析其Cav_1表达的荧光强度。
如上再取肘静脉血，以日本奥林巴斯全自动生化分析仪测定高敏C反应蛋白（hs_CRP）、空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）等水平。
1.3统计学处理：使用SPSS12.0版统计软件。计量资料用（x-±s）表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多样本均数比较采用方差分析，不连续样本比较采用Kruskal_wallis检验，连续计量资料相关性采用Pearson相关性分析，不连续计量资料采用Spearman秩相关分析，影响CAD合并T2DM发生的变量应用Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1三组患者一般资料比较：三组患者年龄、性别构成、吸烟人数、高血压分布、血清总胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸水平等因素比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
本研究发现单纯CAD组单核细胞Cav_1表达水平显著低于正常对照组，而CAD合并T2DM组Cav_1表达显著低于单纯CAD组。提示CAD合并T2DM患者冠状动脉粥样斑块不稳定，容易发生心血管事件。有报道发现，与单纯CAD患者比较，在血管内超声下CAD合并T2DM患者的冠脉病变更严重，不稳定斑块更多[7]。
大量数据表明，当2型糖尿病患者具有高水平的炎症标志物高敏C反应蛋白（high_sensitivity Creactive protein，hs_CRP）时，其冠心病病死率明显提高。高血糖是各型糖尿病的共同特征，也是糖尿病血管病变的危险因子，实验发现高糖能抑制单核细胞来源巨噬细胞Cav_1的表达[2]，能促进大鼠外周血白细胞介素_1、TNF_α升高[8]，后两种炎症介质均可导致CRP合成增加，与动脉粥样硬化形成存在联系。Cav_1在多种炎症反应发生发展中起重要调控作用。本研究通过检测血糖、hs_CRP水平及单核细胞Cav_1的表达，发现血糖水平与Cav_1呈负相关，CAD合并T2DM组单核细胞hs_CRP表达显著高于单纯CAD组及对照组，外周血单核细胞Cav_1水平与hs_CRP呈负相关。提示CAD合并T2DM患者慢性炎症反应的程度比单纯CAD患者更为严重，而外周血单核细胞Cav_1也可能参与血糖代谢及炎症过程，促进糖尿病患者动脉粥样硬化的发展，其作用机制仍需进一步研究。Logistic回归分析发现Cav_1是CAD合并T2DM的保护性因素（P=0.03），Cav_1低表达与糖尿病患者冠状动脉粥样硬化的发生和发展密切相关。
综上所述，CAD合并T2DM时，Cav_1表达水平明显降低，而hs_CRP表达水平明显增高。Cav_1与血糖水平、hs_CRP可能共同参与了CAD合并T2DM患者动脉粥样硬化的发生、发展过程。由于本研究样本量较少，需要更大规模和前瞻性的研究加以验证。
参考文献
[1]P McCarron， R Greenwood， P Elwood. The incidence and etiology of stroke in the Caerphilly and Speedwell Collaborative Studies II： risk factors for ischemic stroke[J]. Public Health，2001，115（1）：12-20.
[2]Hoya Shi T， Juliet Par， Mipazaki A， et al. High glucose downregulates the number of caveolae in monocytes through oxidative stress from NADPH oxidase： Implications for atherosclerosis[J]. Biochimicaet Biophysica Acta，2007，1772（3）：364-372.
[3]Jiang W， Li S， Mao W， et al. Effect of Huxin Formula on reverse cholesterol transport in ApoE_gene knockout mice[J]. Chin J Integr Med，2012，18（6）：451-6.
[4]Schwencke C， Schmeisser A， Walter C， et al. Decreased caveolin_1 in atheroma： loss of antiproliferative control of vascular smooth muscle cells in atherosclerosis[J]. Cardiovasc Res，2005，68（1）：128-135.
[5] Rodriguez_Feo JA， Hellings WE， Moll FL， et al. Caveolin_1 influences vascular protease activity and is a potential stabilizing factor in human atherosclerotic disease[J]. PLoS One，2008，3（7）：e2612.
[6]王琳，江建军，徐莎莎，等.急性冠脉综合征患者的小凹蛋白_1及白三烯B4表达[J].心脑血管病防治，2010，10（1）：12-14.
[7]Takayama T， Hiro T， Ueda Y， et al. Plaque stabilization by intensive LDL_cholesterol lowering therapy with atorvastatin is delayed in type 2 diabetic patients with coronary artery disease_Serial angioscopic and intravascular ultrasound analysis[J]. J Cardiol，2013，61（6）：381-386.
[8]Tanaka Y， Mochizuki K， Fukaya N， et al. The alpha_glucosidase inhibitor miglitol suppresses postprandial hyperglycaemia and interleukin_1beta and tumour necrosis factor_alpha gene expression in rat peripheral leucocytes induced by intermittent sucrose loading[J]. Br J Nutr，2009，102（2）：221-225.
（收稿日期：2013_12_26）