【摘 要】
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目的 比较分析T P53突变、敲除及野生的结直肠癌细胞分泌外泌体的蛋白质组差异.方法 从TP53野生型[HCT116-p53(WT)]、敲除型[HCT116-p53(-/-)]和构建的273位点突变型的结直肠癌HCT116细胞[HCT116-p53(R273H)]培养上清中分别提取外泌体,通过透射电镜观察其形态和免疫印迹法检测外泌体标志性蛋白,经同位素标记相对和绝对定量联合液相色谱串联质谱(iTRAQ-LC-MS/MS)策略分析3种细胞外泌体蛋白组成的差异,并通过酶联免疫吸附法(ELISA)进行差异蛋白验
【机 构】
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解放军总医院第一医学中心检验科,北京100853;解放军总医院第六医学中心检验科,北京100037;首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心,北京100050
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目的 比较分析T P53突变、敲除及野生的结直肠癌细胞分泌外泌体的蛋白质组差异.方法 从TP53野生型[HCT116-p53(WT)]、敲除型[HCT116-p53(-/-)]和构建的273位点突变型的结直肠癌HCT116细胞[HCT116-p53(R273H)]培养上清中分别提取外泌体,通过透射电镜观察其形态和免疫印迹法检测外泌体标志性蛋白,经同位素标记相对和绝对定量联合液相色谱串联质谱(iTRAQ-LC-MS/MS)策略分析3种细胞外泌体蛋白组成的差异,并通过酶联免疫吸附法(ELISA)进行差异蛋白验证.结果 HCT116-p53(W T)分泌的外泌体和H C T 116-p53(R273 H)分泌的外泌体相比有144个差异蛋白,H C T 116-p53(W T)分泌的外泌体和H C T 116-p53(-/-)分泌的外泌体相比有480个差异蛋白,大部分差异蛋白主要参与组织代谢和细胞的生物学过程以及细胞的凋亡、应激、增殖、黏附等.通路分析(IPA)显示HCT116-p53(WT)分泌的外泌体相比于HCT116-p53(R273H)分泌的外泌体的差异蛋白主要富集在泛素化、mTOR、DNA损伤修复通路中;H C T 116-p53(W T)分泌的外泌体相比于H C T 116-p53(-/-)分泌的外泌体的差异蛋白主要集中在泛素化、EIF2、糖酵解通路中.结直肠癌患者的血清视网膜母细胞瘤蛋白(RB1)水平明显高于健康对照,差异有统计学意义(P=0.0012).结论 T P53突变和缺失会改变外泌体的蛋白组成,富集许多泛素化蛋白,结直肠癌患者的血清RB1水平明显高于健康对照组,这为深入探讨T P53状态对外泌体蛋白组成和肿瘤微环境的影响提供依据.
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