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摘要 [目的]筛选出活性较高的产漆酶细菌菌株。[方法]利用含0.2 mmol/L Cu2+的LB富集培养基，从造纸厂污泥中分离得到一株编号为WG35的细菌，并结合形态学观察、生理生化特性研究以及16S rDNA序列分析对其进行鉴定。[结果]经鉴定，WG35菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。用菌株WG35所产漆酶处理造纸黑液，处理3 d后造纸黑液BOD/COD比值可达0.85，可生化性较好。[结论]该研究为细菌漆酶生产提供了理论依据。
关键词 漆酶；16S rDNA；鉴定；应用
中图分类号 S181.3；Q939 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）12-250-03
Abstract [Objective] The study aims to obtain bacterial laccase with excellent properties. [Method] LuriaBertani medium supplemented with 0.2 mmol/L Cu2+ was used to screen bacteria with laccase activity from activated sludge collected from a wastewater treatment plant. A strain exhibiting laccase activity was isolated and named as WG35. The isolated strain was identified based on the results of morphological observation， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis. [Result] The isolated strain WG35 was identified as Bacillus subtilis， and after the laccase produced by the strain WG35 was used to dispose black pulping liquid for three days， the ratio of BOD to COD was up to 0.85. [Conclusion] The research could provide theoretical references for the production of bacterial laccase.
Key words Laccase； 16S rDNA； Identification； Application
漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜离子的多酚氧化酶，自1883年日本学者Yoshida首次发现漆酶以来[1-3]，漆酶一直是化学、生物学以及环境科学研究的热点问题[4]。目前，已发现漆酶广泛分布于自然界，己在高等植物、真菌、昆虫以及细菌体内发现，很多漆酶来自植物和真菌以及少量的细菌[5-8]。枯草芽孢杆菌是一种研究较多的细菌，其热稳定性较好，但是关于其报道较少[9-11]。笔者从大庆林甸海达纸业公司造纸厂活性污泥中分离得到了一株活性漆酶细菌菌株WG35，结合形态学观察、生理生化特性研究以及16S rDNA序列分析对其进行鉴定，并将该菌株应用于造纸废水的处理。
1 材料与方法
1.1 试验试剂
试验样品来自大庆林甸海达纸业公司造纸厂活性污泥。主要试剂包括丁香醛连氮（Sigma公司）、质粒提取试剂盒（Omega公司）、胶回收试剂盒（Omega公司）、rTaq酶（TaKaRa公司）、pMD18T载体（TaKaRa公司）、Escherichia coli JM109感受态细胞（TaKaRa公司），其余试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 产漆酶菌种筛选。
在无菌条件下，将20 g活性污泥样品加入到灭菌的液体LB培养基内。在37 ℃下振荡培养36 h后，进行梯度稀释。然后，在LB固体平板后涂布，37 ℃培养6 d后，取含有单菌落平板，菌落周围滴加丁香醛连氮，纯化菌种。
1.2.2 菌株鉴定。
1.2.2.1 菌株形态学鉴定。
菌株进行培养后，按照文献[10]中的方法进行形态学鉴定：①观察菌体、菌落特征；②依次进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色等试验。
1.2.2.2 菌株的生理生化鉴定。
对筛选到的菌株，根据16S rRNA 序列同源性分析与细菌系统分类鉴定中的方法进行生理生化鉴定，包括氧化酶试验、过氧化氢酶试验、甲基红（M.R）试验、V.P试验、糖或醇类发酵试验、硝酸盐还原试验、产生吲哚试验、硫化氢试验、柠檬酸盐或丙酸盐的利用试验、丙二酸盐利用试验、酪氨酸水解试验、马尿酸盐水解试验、对叠氮化钠抗性试验、对溶菌酶抗性试验、好氧性试验、明胶液化试验、淀粉水解试验，并根据试验结果对照《伯杰细菌鉴定手册》。
1.2.2.3 菌株的16S rDNA鉴定。
菌株的16S rDNA鉴定包括基因组DNA的提取、16S rDNA序列的扩增（采用基因组DNA为模板，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测）、PCR扩增产物的纯化与连接、连接产物的转化与验证、16S rDNA测序与序列分析。
1.2.3 漆酶对造纸黑液的处理研究。
造纸黑液取自大庆海达纸业有限公司。取造纸黑液100 ml，以丁香醛（syringaldehyde，SYR）作为降解体系介体。调节介体浓度为0.1 mmol/L，在40 ℃、pH=8.0条件下，往造纸黑液中加入筛选菌株所产漆酶的粗提液2%，并作用3 d。用COD和BOD仪分别测定经漆酶处理第2天和第3天造纸黑液中BOD/COD比值，考察生化可降解率变化情况。 2 结果与分析
2.1 产漆酶细菌的筛选与鉴定
2.1.1 菌株形态学鉴定。
将样品通过含Cu2+培养基富集后，利用在菌落中央及边缘滴加漆酶底物SGZ再从污泥中分离的细菌中筛选出一株可在氧化丁香醛连氮变红的细菌，将其编号为WG35。WG35菌株革兰氏染色呈阳性，有荚膜及鞭毛，菌落不透明。由图1和图2可知，菌体大小约为0.4～0.6 μm×1.0～2.5 μm，芽孢呈椭圆形，大小约为0.8 μm×1～2 μm。
2.1.2 菌株的生理生化鉴定。
由表1可知，菌株WG35的氧化酶反应、过氧化氢酶反应阳性；V. P反应阳性；好氧性试验结果呈阳性；硝酸盐还原反应阳性；能够分解淀粉、酪氨酸；能够液化明胶；能够利用果糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、柠檬酸盐；M. R反应阴性；不能利用丙二酸盐、丙酸盐、阿拉伯糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖；不能水解马尿酸盐；不能在0.02%叠氮化钠内生长；0.001%溶菌酶能生长。通过生理生化特征和形态学鉴定，初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。
2.1.3
菌株的16S rDNA鉴定。图3为菌株WG35基因组DNA电泳图，对菌株WG35基因组进行PCR扩增，得到大小约1 500 bp的单一条带（图4）。经T载体克隆后进行序列测定，测序结果表明，菌株WG35的16S rDNA序列扩增片段长度为1 513 bp（图5）。将测序所得序列在GenBank中进行同源性比，结果表明，该序列与枯草芽孢杆菌的16S rDNA相似性最高，达到99%。
以相似性为基础选取不同的芽孢杆菌的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0软件构建菌株WG35的系统发育树。由图5可知，WG35在系统发育树上与Bacillus subtilis进化距离较近，在系统发育树上处于同一分支上。说明该菌株在分子系统发育分类学上属于Bacillus subtilis。
2.2 漆酶对造纸废水的降解结果
BOD/COD比值反映的是污水的可生化降解性。菌株WG35所产的漆酶粗提液加入造纸黑液后第2天和第3天，造纸黑液中BOD/COD比值分别为0.39和0.85。可见，加入漆酶后第3天的黑液可降解性比第2天增加了近1倍。经漆酶处理后，造纸黑液的可生化性较好，有利于后续处理。
3 结语
漆酶从发现至今已有百余年的历史了，漆酶在各方面的优越性能使得人们对其关注度越来越高。漆酶来源广泛，多种生物都能够产生漆酶。虽然关于漆酶的研究已经取得较大的进展，但是但关于细菌漆酶报道的仍然很少。筛选得到的菌株WG35，经鉴定属枯草芽孢杆菌。细菌漆酶具有适应pH范围广，易控制生长条件等优点，且在异源表达和重组方面比真菌漆酶更具有优势。因此，基于细菌漆酶的生长特性，继续深入地研究WG35菌株，探索其酶学性质以及产酶机制具有很重要的意义。
参考文献
[1] MAYER AM，STAPLES RC.Laccase：new functions for an old enzyme[J].Phytochemistry，2002，60（6）：551-565.
[2] SUSANA RC.Industrial and biotechnological applications of laccase：A review[J].Biotechnology Advances，2006，24（5）：500-513.
[3] YOSHIDA H.Chemistry of lacquer[J].J Chem Soc，1883，43：472-486.
[4] CHRISTOPHER F.The structure and function of fungal laccase[J].Microbiology，1994，140（1）：19-26.
[5] NILADEVI K N，JACOB N，PREMA P.Evidence for a halotolerantalkaline laccase in Streptontces psammoticus：Purification and characterization[J].Proeess Biochem，2008，43（1）：654-660.
[6] MIYAZAKI K A.hyperthermophilic laccase from Thermus thermophilus HB27[J].Extremophiles，2005，9（8）：415-425.
[7] LEE Y，HENDSON M，PANOPOULOS N J，et al.Molecular cloning，chromosomal mapping，And sequence analysis of copper resistance genes from Xanthomonas campestris Pv.juglandis：homology with small copper proteins and multicopper oxidases[J].J.Bacteriol，1994，176（1）：173-188.
[8] ENGUITA F J，MARCAL D，MARTINS L O，et al.Substrate and dioxygen binding to the endospore coat laccase from Bacillus subtilis[J].J Biol Chem，2004，279（22）：23472-23476.
[9] MARTINS L O，SOARES C M，PEREIRA M M，et al.Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore coat[J].Journal of Biological Chemistry，2002，277（ 21）：18849-18859.
[10] ALEXANDRE G，BALLY R，TAYLOR B L，et al.Loss of cytochrome oxidase activity and acquisition of resistance to quinone analogs in a laccase positive variant of Azospirillum lipoferum[J].J Bacteriol，1999，181（21）：6730-6738.
[11] ENGUITA F J，MARTINS L O，HENRIQUES A O，et al.Crystalstructure of a bacterial endospore coat component.A laccase with enhanced thermostability properties[J].J Biol Chem，2003，278（21）：19416-19425.
[12] 杨革.微生物学实验教程[M].北京：科学出版社，2004：159-180.
关键词 漆酶；16S rDNA；鉴定；应用
中图分类号 S181.3；Q939 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）12-250-03
Abstract [Objective] The study aims to obtain bacterial laccase with excellent properties. [Method] LuriaBertani medium supplemented with 0.2 mmol/L Cu2+ was used to screen bacteria with laccase activity from activated sludge collected from a wastewater treatment plant. A strain exhibiting laccase activity was isolated and named as WG35. The isolated strain was identified based on the results of morphological observation， physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis. [Result] The isolated strain WG35 was identified as Bacillus subtilis， and after the laccase produced by the strain WG35 was used to dispose black pulping liquid for three days， the ratio of BOD to COD was up to 0.85. [Conclusion] The research could provide theoretical references for the production of bacterial laccase.
Key words Laccase； 16S rDNA； Identification； Application
漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜离子的多酚氧化酶，自1883年日本学者Yoshida首次发现漆酶以来[1-3]，漆酶一直是化学、生物学以及环境科学研究的热点问题[4]。目前，已发现漆酶广泛分布于自然界，己在高等植物、真菌、昆虫以及细菌体内发现，很多漆酶来自植物和真菌以及少量的细菌[5-8]。枯草芽孢杆菌是一种研究较多的细菌，其热稳定性较好，但是关于其报道较少[9-11]。笔者从大庆林甸海达纸业公司造纸厂活性污泥中分离得到了一株活性漆酶细菌菌株WG35，结合形态学观察、生理生化特性研究以及16S rDNA序列分析对其进行鉴定，并将该菌株应用于造纸废水的处理。
1 材料与方法
1.1 试验试剂
试验样品来自大庆林甸海达纸业公司造纸厂活性污泥。主要试剂包括丁香醛连氮（Sigma公司）、质粒提取试剂盒（Omega公司）、胶回收试剂盒（Omega公司）、rTaq酶（TaKaRa公司）、pMD18T载体（TaKaRa公司）、Escherichia coli JM109感受态细胞（TaKaRa公司），其余试剂均为国产分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 产漆酶菌种筛选。
在无菌条件下，将20 g活性污泥样品加入到灭菌的液体LB培养基内。在37 ℃下振荡培养36 h后，进行梯度稀释。然后，在LB固体平板后涂布，37 ℃培养6 d后，取含有单菌落平板，菌落周围滴加丁香醛连氮，纯化菌种。
1.2.2 菌株鉴定。
1.2.2.1 菌株形态学鉴定。
菌株进行培养后，按照文献[10]中的方法进行形态学鉴定：①观察菌体、菌落特征；②依次进行革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色、鞭毛染色等试验。
1.2.2.2 菌株的生理生化鉴定。
对筛选到的菌株，根据16S rRNA 序列同源性分析与细菌系统分类鉴定中的方法进行生理生化鉴定，包括氧化酶试验、过氧化氢酶试验、甲基红（M.R）试验、V.P试验、糖或醇类发酵试验、硝酸盐还原试验、产生吲哚试验、硫化氢试验、柠檬酸盐或丙酸盐的利用试验、丙二酸盐利用试验、酪氨酸水解试验、马尿酸盐水解试验、对叠氮化钠抗性试验、对溶菌酶抗性试验、好氧性试验、明胶液化试验、淀粉水解试验，并根据试验结果对照《伯杰细菌鉴定手册》。
1.2.2.3 菌株的16S rDNA鉴定。
菌株的16S rDNA鉴定包括基因组DNA的提取、16S rDNA序列的扩增（采用基因组DNA为模板，扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测）、PCR扩增产物的纯化与连接、连接产物的转化与验证、16S rDNA测序与序列分析。
1.2.3 漆酶对造纸黑液的处理研究。
造纸黑液取自大庆海达纸业有限公司。取造纸黑液100 ml，以丁香醛（syringaldehyde，SYR）作为降解体系介体。调节介体浓度为0.1 mmol/L，在40 ℃、pH=8.0条件下，往造纸黑液中加入筛选菌株所产漆酶的粗提液2%，并作用3 d。用COD和BOD仪分别测定经漆酶处理第2天和第3天造纸黑液中BOD/COD比值，考察生化可降解率变化情况。 2 结果与分析
2.1 产漆酶细菌的筛选与鉴定
2.1.1 菌株形态学鉴定。
将样品通过含Cu2+培养基富集后，利用在菌落中央及边缘滴加漆酶底物SGZ再从污泥中分离的细菌中筛选出一株可在氧化丁香醛连氮变红的细菌，将其编号为WG35。WG35菌株革兰氏染色呈阳性，有荚膜及鞭毛，菌落不透明。由图1和图2可知，菌体大小约为0.4～0.6 μm×1.0～2.5 μm，芽孢呈椭圆形，大小约为0.8 μm×1～2 μm。
2.1.2 菌株的生理生化鉴定。
由表1可知，菌株WG35的氧化酶反应、过氧化氢酶反应阳性；V. P反应阳性；好氧性试验结果呈阳性；硝酸盐还原反应阳性；能够分解淀粉、酪氨酸；能够液化明胶；能够利用果糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、柠檬酸盐；M. R反应阴性；不能利用丙二酸盐、丙酸盐、阿拉伯糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖；不能水解马尿酸盐；不能在0.02%叠氮化钠内生长；0.001%溶菌酶能生长。通过生理生化特征和形态学鉴定，初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。
2.1.3
菌株的16S rDNA鉴定。图3为菌株WG35基因组DNA电泳图，对菌株WG35基因组进行PCR扩增，得到大小约1 500 bp的单一条带（图4）。经T载体克隆后进行序列测定，测序结果表明，菌株WG35的16S rDNA序列扩增片段长度为1 513 bp（图5）。将测序所得序列在GenBank中进行同源性比，结果表明，该序列与枯草芽孢杆菌的16S rDNA相似性最高，达到99%。
以相似性为基础选取不同的芽孢杆菌的16S rDNA序列，采用MEGA 5.0软件构建菌株WG35的系统发育树。由图5可知，WG35在系统发育树上与Bacillus subtilis进化距离较近，在系统发育树上处于同一分支上。说明该菌株在分子系统发育分类学上属于Bacillus subtilis。
2.2 漆酶对造纸废水的降解结果
BOD/COD比值反映的是污水的可生化降解性。菌株WG35所产的漆酶粗提液加入造纸黑液后第2天和第3天，造纸黑液中BOD/COD比值分别为0.39和0.85。可见，加入漆酶后第3天的黑液可降解性比第2天增加了近1倍。经漆酶处理后，造纸黑液的可生化性较好，有利于后续处理。
3 结语
漆酶从发现至今已有百余年的历史了，漆酶在各方面的优越性能使得人们对其关注度越来越高。漆酶来源广泛，多种生物都能够产生漆酶。虽然关于漆酶的研究已经取得较大的进展，但是但关于细菌漆酶报道的仍然很少。筛选得到的菌株WG35，经鉴定属枯草芽孢杆菌。细菌漆酶具有适应pH范围广，易控制生长条件等优点，且在异源表达和重组方面比真菌漆酶更具有优势。因此，基于细菌漆酶的生长特性，继续深入地研究WG35菌株，探索其酶学性质以及产酶机制具有很重要的意义。
参考文献
[1] MAYER AM，STAPLES RC.Laccase：new functions for an old enzyme[J].Phytochemistry，2002，60（6）：551-565.
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[5] NILADEVI K N，JACOB N，PREMA P.Evidence for a halotolerantalkaline laccase in Streptontces psammoticus：Purification and characterization[J].Proeess Biochem，2008，43（1）：654-660.
[6] MIYAZAKI K A.hyperthermophilic laccase from Thermus thermophilus HB27[J].Extremophiles，2005，9（8）：415-425.
[7] LEE Y，HENDSON M，PANOPOULOS N J，et al.Molecular cloning，chromosomal mapping，And sequence analysis of copper resistance genes from Xanthomonas campestris Pv.juglandis：homology with small copper proteins and multicopper oxidases[J].J.Bacteriol，1994，176（1）：173-188.
[8] ENGUITA F J，MARCAL D，MARTINS L O，et al.Substrate and dioxygen binding to the endospore coat laccase from Bacillus subtilis[J].J Biol Chem，2004，279（22）：23472-23476.
[9] MARTINS L O，SOARES C M，PEREIRA M M，et al.Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore coat[J].Journal of Biological Chemistry，2002，277（ 21）：18849-18859.
[10] ALEXANDRE G，BALLY R，TAYLOR B L，et al.Loss of cytochrome oxidase activity and acquisition of resistance to quinone analogs in a laccase positive variant of Azospirillum lipoferum[J].J Bacteriol，1999，181（21）：6730-6738.
[11] ENGUITA F J，MARTINS L O，HENRIQUES A O，et al.Crystalstructure of a bacterial endospore coat component.A laccase with enhanced thermostability properties[J].J Biol Chem，2003，278（21）：19416-19425.
[12] 杨革.微生物学实验教程[M].北京：科学出版社，2004：159-180.