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摘要：本研究拟通过生物信息学的方法探究CENPW蛋白是否可以应用于泛癌的诊断、治疗及预测患者预后情况。
关键词：着丝粒蛋白W;泛癌 ;生物信息学;免疫;甲基化
【中图分类号】R-1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2020）09-179-02
作为困扰人类多个世纪的致命疾病，癌症正逐渐成为全球范围内最常见的死亡原因之一，其发病率和死亡率仍在逐年快速增长[1]。据估计，2018年全世界有超过1810万例新癌症病例，超过960万例与癌症相关的死亡。迄今为止，早期诊断和治疗仍然是提高许多癌症的预后甚至治愈的最有效方法。但是，对于晚期癌症患者，应用分子靶向治疗或免疫治疗在内的多种治疗均未取得令人鼓舞的结果。因此，发现可以早期诊断和治疗肿瘤的有效生物标志物将有效改善患者的预后。
1.1临床相关性和预后分析
根据基因表达谱数据，将所有患者分为CENPW表达高和CENPW表达低的患者。使用Kaplan-Meier生存曲线比较高和低KIF20A表达组之间的预后差异，包括：总生存期（Overall survival，OS），疾病特异性生存期（Disease-specific survival，DSS），无病间隔（Disease-free interval，DFI），无进展间隔（Progression-free interval，PFI）。此外，临床相关的的信息也被用来分析这两组之间的临床相关差异。数据阈值均被设置为P <0.05。
1.2CENPW分析肿瘤突变负荷，微卫星不稳定性和肿瘤微环境
使用perl代码计算33种肿瘤样品的肿瘤突变负荷得分。使用Spearman分析确定泛癌中CENPW与肿瘤突变负荷之间的相关性。微卫星不稳定性的数据以“bam”文件的形式从TCGA下载。同时，分析了CENPW与微卫星不稳定性之间的相关性。然后，利用ESTIMATE软件包计算33种肿瘤的基质和免疫评分。
1.3与CENPW在泛癌中共表达的基因
在共表达区间为COR：-0.5-07和P <0.05的筛选条件下，分析了33个肿瘤中47个免疫相关基因与CENPW之间的相关性。 并把共表达结果呈现在热图中。
1.4基因集富集分析
使用GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）v4.0.1进行GO（Gene Ontology）分析，以研究CENPW在33种肿瘤中的生物学功能。 临界值为FDR <0.25和NOM P值<0.05。
2 结果
2.1 CENPW mRNA水平和临床病理特征在泛癌中和相应的正常组织中有显着差异。
首先，通过R语言比较了33个肿瘤组织和相应正常组织中CENPW中的表达的差异，发现在大多数类型的肿瘤中KIF20A的表达都呈现不同程度的升高。肿瘤组织中CENPW与周围组织中mRNA水平有显著差异的肿瘤类型被总结在图1中。其次，验证了高低表达组CENPW患者的预后差异：在许多肿瘤中，CENPW高表达与不良OS，DSS，DFI和PFI相关。在OS，DSS，DFI和PFI的分析结果中。
2.2 泛癌中与CENPW相关的免疫浸润细胞的分析
肿瘤浸润性淋巴细胞是癌症前哨淋巴结状态和存活的独立预测因子。免疫细胞与CENPW相关性分析中，我们主要列举了B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞 ，树突状（dendritic）细胞，巨噬细胞（macrophages）和中性粒细胞（neutrophils）。其中，CENPW在三种肿瘤中与免疫浸润细胞的相关性最紧密，包括：肾透明细胞癌（Kidney renal clear cell carcinoma，KIRC），肝细胞肝癌（Liver hepatocellular carcinoma，LIHC）和肺鳞癌（Lung squamous cell carcinoma，LUSC）。在肾透明细胞癌中，CENPW的表达水平与B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞 ，树突状细胞，巨噬细胞和中性粒细胞均呈正相关，且结果具有显著意义。在肝细胞肝癌中，CENPW的表达水平被与上调的B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞 ，树突状细胞，巨噬细胞和中性粒細胞浸润程度联系起来。而在肺鳞癌中，CENPW则与B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞 ，树突状细胞，巨噬细胞和中性粒细胞的浸润程度呈负性相关。
2.3 泛癌中与CENPW相关的肿瘤微环境分析
我们利用基质评分，免疫评分和ESTIMATE评分综合评价CENPW在泛癌中与肿瘤微环境的相关性，并列举了每种评分中相关性最显著的三种肿瘤类型（图4）。在甲状腺癌 （Thyroid carcinoma，THCA）和肾透明细胞癌中，CENPW的表达水平与基质评分呈正相关。相反，肺鳞癌的患者中，CENPW与基质评分呈负相关。甲状腺癌、肾透明细胞癌和前列腺癌 （Prostate adenocarcinoma，PRAD）的背景下，CENPW的表达水平与免疫评分均呈正相关。而甲状腺癌和肾透明细胞癌的ESTIMATE评分与CENPW的表达水平呈正相关。而在肺鳞癌中，CENPW的表达被与下调的ESTIMATE评分联系起来。
2.4 CENPW与免疫检查点基因在泛癌中的共表达分析
在正常情况下，肿瘤微环境中的肿瘤细胞可以被免疫系统识别并清除，但肿瘤细胞应用不同的方式，通过抑制免疫系统，达到逃避免疫应答的作用。肿瘤免疫治疗就是通过激活肿瘤-免疫循环，恢复机体正常肿瘤免疫应答，进一步抑制肿瘤发生发展或清除肿瘤。其中，单克隆抗体类免疫检查点抑制剂作为肿瘤免疫治疗的重要组成成分在33个肿瘤中，我们探索了47个免疫检查点基因与CENPW之间的共表达关系。 2.5 CENPW的表达与肿瘤新抗原、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性的相关性
肿瘤新抗原即肿瘤细胞突变基因编码的新生抗原，其主要由肿瘤细胞的基因点突变、删除突变和基因融合等方式产生。肿瘤新抗原经过酶解之后生成多肽片段，经过处理的多肽片段的被呈递给T细胞，此过程促使T细胞能够特异性识别肿瘤新生抗原。其中，LUAD、BRCA、KIRC、UCEC、READ、STAD、CESC和LGG与肿瘤新抗原存在显著相关性。肿瘤突变负荷的突变类型主要包扩单核苷酸变异、小片段插入/缺失等，其量化的主要方式为肿瘤细胞基
因组编码区平均1Mb碱基出现的体细胞突变数量及非同义突变总数表示。我们对CENPW与泛癌中的肿瘤突变负荷应用雷达图进行了数据可视化，BLCA、BRCA、KICH、LGG、LUAD、PAAD、PRAD、SKCM、STAD、THYM及UCS。肿瘤中存在微卫星重复插入和缺失而造成了微卫星不稳定性，在泛癌的研究背景下，我们对CENPW相关的微卫星不稳定性进行了相关性分析，发现BRCA、CESC、HNSC、LIHC、LUSC、READ、SKCM、STAD、THCA和UCEC的结果存在显著性意义。
2.6 CENPW在泛癌中的表达水平与DNA修复基因（MMRs）及甲基转移酶的表达关系
DNA修复基因为细胞内的错配修复机制，其功能失调会致使DNA复制错误无法被修复，增加了细胞突变的几率。CENPW的表达在多种肿瘤中与5个DNA修复基因存在相关性。如乳腺癌中，CENPW的表达与MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM均存在显著的相关性。在LUA、READ中，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM与CENPW均存在正相关。而DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA结构稳定性及蛋白质相互作用的改变，进一步影响了基因表达水平。 DNA甲基化主要通过DNA甲基化转移酶起作用，因此我们分析了CENPW与DNMT1（红色）、DNMT2（蓝色）、DNMT3A（绿色）及DNMT3B（紫色）的表达相关性。
3 讨论
癌症是世界上最重要的公共卫生问题之一，人口老龄化、人口的快速增长和致癌因素的增加等因素使癌症的发病率正在以惊人的速度恶化。到目前为止，发生率最高的三大恶性肿瘤是肺癌（182万），乳腺癌（167万）和结直肠癌（136万）。值得注意的是，死亡人数最多的恶性肿瘤是肺癌（160万例死亡），肝癌（745，000例死亡）和胃癌（723，000例死亡）。转移和复发是导致肿瘤患者死亡的两个重要因素。因此，寻找有效的预防策略，诊断方法和治疗方法以改善恶性肿瘤患者的生存期至关重要。肿瘤发生分子机制的研究有助于发现新的生物标志物，以便于有效地预防肿瘤的发生、及时诊断肿瘤和提供有效的分子治疗靶点最终改善患者的生存期。
总之，CENPW在泛癌中起重要作用，并且可能影响多种肿瘤的发生或发展。 此外，CENPW与免疫及甲基化的相关研究有望成为一个研究热点。
参考文献
[1]吴淼经，汲乾坤，范阳华，吕世刚，叶敏华，吴雷，祝新根.着丝粒蛋白W在脑胶质瘤中的表达及其对侵袭的作用[J].西安交通大学学报（医学版），2016，37（03）：388-392.
作者單位：
1.肥城市第二人民医院 外科 泰安 271605 2.肥城市第二人民医院 内科 泰安 271605
3.南京医科大学 南京 211166
关键词：着丝粒蛋白W;泛癌 ;生物信息学;免疫;甲基化
【中图分类号】R-1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2020）09-179-02
作为困扰人类多个世纪的致命疾病，癌症正逐渐成为全球范围内最常见的死亡原因之一，其发病率和死亡率仍在逐年快速增长[1]。据估计，2018年全世界有超过1810万例新癌症病例，超过960万例与癌症相关的死亡。迄今为止，早期诊断和治疗仍然是提高许多癌症的预后甚至治愈的最有效方法。但是，对于晚期癌症患者，应用分子靶向治疗或免疫治疗在内的多种治疗均未取得令人鼓舞的结果。因此，发现可以早期诊断和治疗肿瘤的有效生物标志物将有效改善患者的预后。
1.1临床相关性和预后分析
根据基因表达谱数据，将所有患者分为CENPW表达高和CENPW表达低的患者。使用Kaplan-Meier生存曲线比较高和低KIF20A表达组之间的预后差异，包括：总生存期（Overall survival，OS），疾病特异性生存期（Disease-specific survival，DSS），无病间隔（Disease-free interval，DFI），无进展间隔（Progression-free interval，PFI）。此外，临床相关的的信息也被用来分析这两组之间的临床相关差异。数据阈值均被设置为P <0.05。
1.2CENPW分析肿瘤突变负荷，微卫星不稳定性和肿瘤微环境
使用perl代码计算33种肿瘤样品的肿瘤突变负荷得分。使用Spearman分析确定泛癌中CENPW与肿瘤突变负荷之间的相关性。微卫星不稳定性的数据以“bam”文件的形式从TCGA下载。同时，分析了CENPW与微卫星不稳定性之间的相关性。然后，利用ESTIMATE软件包计算33种肿瘤的基质和免疫评分。
1.3与CENPW在泛癌中共表达的基因
在共表达区间为COR：-0.5-07和P <0.05的筛选条件下，分析了33个肿瘤中47个免疫相关基因与CENPW之间的相关性。 并把共表达结果呈现在热图中。
1.4基因集富集分析
使用GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）v4.0.1进行GO（Gene Ontology）分析，以研究CENPW在33种肿瘤中的生物学功能。 临界值为FDR <0.25和NOM P值<0.05。
2 结果
2.1 CENPW mRNA水平和临床病理特征在泛癌中和相应的正常组织中有显着差异。
首先，通过R语言比较了33个肿瘤组织和相应正常组织中CENPW中的表达的差异，发现在大多数类型的肿瘤中KIF20A的表达都呈现不同程度的升高。肿瘤组织中CENPW与周围组织中mRNA水平有显著差异的肿瘤类型被总结在图1中。其次，验证了高低表达组CENPW患者的预后差异：在许多肿瘤中，CENPW高表达与不良OS，DSS，DFI和PFI相关。在OS，DSS，DFI和PFI的分析结果中。
2.2 泛癌中与CENPW相关的免疫浸润细胞的分析
肿瘤浸润性淋巴细胞是癌症前哨淋巴结状态和存活的独立预测因子。免疫细胞与CENPW相关性分析中，我们主要列举了B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞 ，树突状（dendritic）细胞，巨噬细胞（macrophages）和中性粒细胞（neutrophils）。其中，CENPW在三种肿瘤中与免疫浸润细胞的相关性最紧密，包括：肾透明细胞癌（Kidney renal clear cell carcinoma，KIRC），肝细胞肝癌（Liver hepatocellular carcinoma，LIHC）和肺鳞癌（Lung squamous cell carcinoma，LUSC）。在肾透明细胞癌中，CENPW的表达水平与B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞 ，树突状细胞，巨噬细胞和中性粒细胞均呈正相关，且结果具有显著意义。在肝细胞肝癌中，CENPW的表达水平被与上调的B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞 ，树突状细胞，巨噬细胞和中性粒細胞浸润程度联系起来。而在肺鳞癌中，CENPW则与B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞 ，树突状细胞，巨噬细胞和中性粒细胞的浸润程度呈负性相关。
2.3 泛癌中与CENPW相关的肿瘤微环境分析
我们利用基质评分，免疫评分和ESTIMATE评分综合评价CENPW在泛癌中与肿瘤微环境的相关性，并列举了每种评分中相关性最显著的三种肿瘤类型（图4）。在甲状腺癌 （Thyroid carcinoma，THCA）和肾透明细胞癌中，CENPW的表达水平与基质评分呈正相关。相反，肺鳞癌的患者中，CENPW与基质评分呈负相关。甲状腺癌、肾透明细胞癌和前列腺癌 （Prostate adenocarcinoma，PRAD）的背景下，CENPW的表达水平与免疫评分均呈正相关。而甲状腺癌和肾透明细胞癌的ESTIMATE评分与CENPW的表达水平呈正相关。而在肺鳞癌中，CENPW的表达被与下调的ESTIMATE评分联系起来。
2.4 CENPW与免疫检查点基因在泛癌中的共表达分析
在正常情况下，肿瘤微环境中的肿瘤细胞可以被免疫系统识别并清除，但肿瘤细胞应用不同的方式，通过抑制免疫系统，达到逃避免疫应答的作用。肿瘤免疫治疗就是通过激活肿瘤-免疫循环，恢复机体正常肿瘤免疫应答，进一步抑制肿瘤发生发展或清除肿瘤。其中，单克隆抗体类免疫检查点抑制剂作为肿瘤免疫治疗的重要组成成分在33个肿瘤中，我们探索了47个免疫检查点基因与CENPW之间的共表达关系。 2.5 CENPW的表达与肿瘤新抗原、肿瘤突变负荷和微卫星不稳定性的相关性
肿瘤新抗原即肿瘤细胞突变基因编码的新生抗原，其主要由肿瘤细胞的基因点突变、删除突变和基因融合等方式产生。肿瘤新抗原经过酶解之后生成多肽片段，经过处理的多肽片段的被呈递给T细胞，此过程促使T细胞能够特异性识别肿瘤新生抗原。其中，LUAD、BRCA、KIRC、UCEC、READ、STAD、CESC和LGG与肿瘤新抗原存在显著相关性。肿瘤突变负荷的突变类型主要包扩单核苷酸变异、小片段插入/缺失等，其量化的主要方式为肿瘤细胞基
因组编码区平均1Mb碱基出现的体细胞突变数量及非同义突变总数表示。我们对CENPW与泛癌中的肿瘤突变负荷应用雷达图进行了数据可视化，BLCA、BRCA、KICH、LGG、LUAD、PAAD、PRAD、SKCM、STAD、THYM及UCS。肿瘤中存在微卫星重复插入和缺失而造成了微卫星不稳定性，在泛癌的研究背景下，我们对CENPW相关的微卫星不稳定性进行了相关性分析，发现BRCA、CESC、HNSC、LIHC、LUSC、READ、SKCM、STAD、THCA和UCEC的结果存在显著性意义。
2.6 CENPW在泛癌中的表达水平与DNA修复基因（MMRs）及甲基转移酶的表达关系
DNA修复基因为细胞内的错配修复机制，其功能失调会致使DNA复制错误无法被修复，增加了细胞突变的几率。CENPW的表达在多种肿瘤中与5个DNA修复基因存在相关性。如乳腺癌中，CENPW的表达与MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM均存在显著的相关性。在LUA、READ中，MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EPCAM与CENPW均存在正相关。而DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA结构稳定性及蛋白质相互作用的改变，进一步影响了基因表达水平。 DNA甲基化主要通过DNA甲基化转移酶起作用，因此我们分析了CENPW与DNMT1（红色）、DNMT2（蓝色）、DNMT3A（绿色）及DNMT3B（紫色）的表达相关性。
3 讨论
癌症是世界上最重要的公共卫生问题之一，人口老龄化、人口的快速增长和致癌因素的增加等因素使癌症的发病率正在以惊人的速度恶化。到目前为止，发生率最高的三大恶性肿瘤是肺癌（182万），乳腺癌（167万）和结直肠癌（136万）。值得注意的是，死亡人数最多的恶性肿瘤是肺癌（160万例死亡），肝癌（745，000例死亡）和胃癌（723，000例死亡）。转移和复发是导致肿瘤患者死亡的两个重要因素。因此，寻找有效的预防策略，诊断方法和治疗方法以改善恶性肿瘤患者的生存期至关重要。肿瘤发生分子机制的研究有助于发现新的生物标志物，以便于有效地预防肿瘤的发生、及时诊断肿瘤和提供有效的分子治疗靶点最终改善患者的生存期。
总之，CENPW在泛癌中起重要作用，并且可能影响多种肿瘤的发生或发展。 此外，CENPW与免疫及甲基化的相关研究有望成为一个研究热点。
参考文献
[1]吴淼经，汲乾坤，范阳华，吕世刚，叶敏华，吴雷，祝新根.着丝粒蛋白W在脑胶质瘤中的表达及其对侵袭的作用[J].西安交通大学学报（医学版），2016，37（03）：388-392.
作者單位：
1.肥城市第二人民医院 外科 泰安 271605 2.肥城市第二人民医院 内科 泰安 271605
3.南京医科大学 南京 211166