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【摘要】 目的 对2010——2011年蚌埠市哨点医院手足口病病原进行检测分析，以调查本地区手足口病流行情况。为手足口病的综合防治提供参考资料。方法 收集哨点医院2010——2011年送检的手足口病病例咽拭子标本，应用实时荧光定量PCR技术检测手足口病病原（肠道病毒7l型、柯萨奇病毒A组16型）。结果 2010年共检测332份咽拭子标本，阳性101份，阳性率30.42%，分别是肠道病毒71型55份，柯萨奇A组16型46份；2011年检测447份咽拭子标本，阳性215份，阳性率48.08.%，肠道病毒71型200份，柯萨奇A组16型15份。结论 肠道病毒71型是2011年蚌埠市手足口病流行的主要病原。
【关键词】 手足口病；实时荧光定量PCR；肠道病毒71型；柯萨奇病毒A组16型
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.04.603
文章编号：1004-7484（2014）-04-2289-02
【Abstract】Objective To investigate the pathogen of hand-foot-mouth disease（HFMD）in Bengbu city.Methods Specimen of throat swabs of HFMD cases were collected from the sentinel hospital from 2010 to 2011.Nucleic acids In three type，which were enterovirus71（EV71），enterovirus coxasckie virus A16（CA16）and universal enterovirus（EV）were detected by real-time-PCR.Result Among 332 cases in 2010，101 were positive including 55 strains of EV71 and 46 strains of CVAl6 respectively.positive rate is 30.42%；Among 447 cases in 2011，all 215 were positive including 200 strains of EV71 and 15 strains of CVAl6 respectively.positive rate is 48.08%.Conclusion s EV71 was the major pathogens for the epidemic of HFMD in the sentinel hospital in Bengbu city.
【Key words】 Hand-foot-mouth disease（HFMD）；Real-time-PCR；Enterovirus71（EV71）；Enterovirus coxasckie virus A16（CA16）
手足口病（HFMD）是一种常见于5岁以下的儿童急性传染病，其临床症状主要表现为发热和手、足、口等部位的皮疹、疱疹，伴或不伴口腔溃疡，病情严重者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。手足口病病原为小RNA科、肠道病毒属的一些不同血清学肠道病毒，包括柯萨基病毒A组4、5、7、9、10、16型以及B组2、5型，埃可病毒和肠道病毒71型，其中以柯萨基病毒A组16型和肠道病毒71型最为常见[1]。其传染性强，常引起爆发性流行。2008年3月安徽阜阳市发生手足口病大规模流行[2]，使本病得到空前的重视，为了解2010——2011年蚌埠市HFMD的流行病学和病原学特征，本研究对辖区内哨点医院采集的HFMD患儿的咽拭子标本应用实时荧光定量PCR进行了病原學检测，现将检测结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 2010——2011年，蚌埠市市辖三县四区各哨点医院每月送检的手足口病患儿咽拭子标本，2010年332份；2011年447份。具体哨点医院分别是：龙子湖区为蚌埠医学院第一附属医院；蚌山区为蚌埠市第三人民医院；禹会区、淮上区为蚌埠市第一人民医院；怀远县为怀远县一院和怀远县二院；五河县为五河县医院；固镇县为固镇县医院。诊断标准参照《手足口病诊疗指南（2010年版）》，样本采集运送及储存均按《手足口病诊疗指南（2010年版）》的要求操作。
1.2 仪器和试剂 ABI7300型实时荧光定量PCR基因扩增仪（ABI公司美国）。RNA提取试剂盒（Rneasy Mini Kit，Cat No.74104）购自QIAGEN公司；肠道病毒（EV）通用型、柯萨基病毒A组16型和肠道病毒71型核酸检测试剂盒购自北京金豪公司；严格按试剂说明书操作，效期内使用。
1.3 方法
1.3.1 病毒RNA的提取 采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit，按照试剂盒说明书操作。最终收集RNA提取液40微升。
1.3.2 实时荧光定量PCR反应 在ABI7300型实时荧光定量PCR基因扩增仪上进行PCR扩增，反应总体积为25微升，反应程序为；逆转录及变性50℃30分钟，95℃1分钟；预扩增95℃15秒，50℃30秒，72℃1分钟，5个循环；扩增及荧光收集95℃10秒，55℃40秒，40个循环。同时设置阳性梯度模板和阴性对照。结果判定严格按照ABI7300仪器操作说明书和PCR检测试剂盒说明书进行。
1.3.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件进行数据处理。
2 结 果
检测结果见表1、表2、表3。
3 讨 论
HFMD在全球范围内广泛流行，是婴幼儿时期的常见传染病，1958年最先发现CA16为HFMD病原体，1969年首次分离出EV71。此后CA16和EV71一直作为HFMD的主要病原出现于报道之中。在我国，1981年上海市首次报道HFMD，此后各地报道逐渐增多。2008年5月卫生部将本病列入我国法定丙类传染病，严格了HFMD的报告与管理。据2010年卫生部统计数据，在丙类传染病中，2009年HFMD报告发病数和报告死亡数均跃居首位，HFMD业已成为危害我国儿童健康的重要公共卫生问题。 实时荧光定量PCR技术是新兴的针对病原体核酸的快速检测技术，该方法具有定量检测、快速、灵敏度高、特异性强以及自动化程度高的特点，使基因扩增和产物分析全过程都在封闭条件下进行，实现了实时监测和自动分析，从根本上解决了传统PCR检测过程中产物易受污染和不能定量的问题。
本研究结果显示，蚌埠市HFMD病原2010年为EV71和CA16交替出现，而2011年则EV71为占绝对优势流行株（93.02%）。EV71感染性强，除引发和CoxAl6相似的手足口症状外，还可引起严重的神经系统并发症，如脑膜炎、脑炎、弛缓性瘫痪等。2008年全国监测数据显示，96%以上的实验室确诊死亡病例由EV71感染引起[3]。本研究EV71高检出率的结果与国内北京、上海、浙江、湖南等地的报道结果一致[4-7]，提示EV71是国内近年来HFMD流行的主要病原体。
参考文献
[1] WHO regional office for the Western Pacific.A guide to clinical management and public health response for hand，foot and mouth disease（HFMD）.2011[2011-10-18].http：//www.wpro.who.Int/publications/PUB_9789290615255.htm.
[2] 安徽省卫生厅.我省阜阳积极防治肠道病毒感染疾病[EB/OL].[2008-06-20].http：//www.ahwst.gov.cn.
[3] 許文波，檀晓娟.手足口病：中国儿童传染病防控面临的新挑战[J].疾病监测，2009，24（9）：649-650.
[4] 伏谨，张艳玲，孙春荣，等.实时RT-PCR检测159例手足口病患儿样本中肠道病毒的结果分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，2009，23（6）：488-490.
[5] 蒋露芳，居丽雯，杨吉星，等.2008年上海及周边地区婴幼儿手足口病病原学研究[J].中华传染病学杂志，2009，27（7）：387-390.
[6] 吴亦栋，尚世强，陈志敏，等.手足口病病原体流行特征分析及临床意义[J].中华儿科杂志，2010，48（7）：535-539.
[7] 黄威，周帅锋，张帆，等.2008——2010年湖南省哨点医院手足口病病原学检测结果及基因特征分析[J].实用预防医学，2011，18（5）：779-784.
【关键词】 手足口病；实时荧光定量PCR；肠道病毒71型；柯萨奇病毒A组16型
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2014.04.603
文章编号：1004-7484（2014）-04-2289-02
【Abstract】Objective To investigate the pathogen of hand-foot-mouth disease（HFMD）in Bengbu city.Methods Specimen of throat swabs of HFMD cases were collected from the sentinel hospital from 2010 to 2011.Nucleic acids In three type，which were enterovirus71（EV71），enterovirus coxasckie virus A16（CA16）and universal enterovirus（EV）were detected by real-time-PCR.Result Among 332 cases in 2010，101 were positive including 55 strains of EV71 and 46 strains of CVAl6 respectively.positive rate is 30.42%；Among 447 cases in 2011，all 215 were positive including 200 strains of EV71 and 15 strains of CVAl6 respectively.positive rate is 48.08%.Conclusion s EV71 was the major pathogens for the epidemic of HFMD in the sentinel hospital in Bengbu city.
【Key words】 Hand-foot-mouth disease（HFMD）；Real-time-PCR；Enterovirus71（EV71）；Enterovirus coxasckie virus A16（CA16）
手足口病（HFMD）是一种常见于5岁以下的儿童急性传染病，其临床症状主要表现为发热和手、足、口等部位的皮疹、疱疹，伴或不伴口腔溃疡，病情严重者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等致命性并发症。手足口病病原为小RNA科、肠道病毒属的一些不同血清学肠道病毒，包括柯萨基病毒A组4、5、7、9、10、16型以及B组2、5型，埃可病毒和肠道病毒71型，其中以柯萨基病毒A组16型和肠道病毒71型最为常见[1]。其传染性强，常引起爆发性流行。2008年3月安徽阜阳市发生手足口病大规模流行[2]，使本病得到空前的重视，为了解2010——2011年蚌埠市HFMD的流行病学和病原学特征，本研究对辖区内哨点医院采集的HFMD患儿的咽拭子标本应用实时荧光定量PCR进行了病原學检测，现将检测结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 2010——2011年，蚌埠市市辖三县四区各哨点医院每月送检的手足口病患儿咽拭子标本，2010年332份；2011年447份。具体哨点医院分别是：龙子湖区为蚌埠医学院第一附属医院；蚌山区为蚌埠市第三人民医院；禹会区、淮上区为蚌埠市第一人民医院；怀远县为怀远县一院和怀远县二院；五河县为五河县医院；固镇县为固镇县医院。诊断标准参照《手足口病诊疗指南（2010年版）》，样本采集运送及储存均按《手足口病诊疗指南（2010年版）》的要求操作。
1.2 仪器和试剂 ABI7300型实时荧光定量PCR基因扩增仪（ABI公司美国）。RNA提取试剂盒（Rneasy Mini Kit，Cat No.74104）购自QIAGEN公司；肠道病毒（EV）通用型、柯萨基病毒A组16型和肠道病毒71型核酸检测试剂盒购自北京金豪公司；严格按试剂说明书操作，效期内使用。
1.3 方法
1.3.1 病毒RNA的提取 采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit，按照试剂盒说明书操作。最终收集RNA提取液40微升。
1.3.2 实时荧光定量PCR反应 在ABI7300型实时荧光定量PCR基因扩增仪上进行PCR扩增，反应总体积为25微升，反应程序为；逆转录及变性50℃30分钟，95℃1分钟；预扩增95℃15秒，50℃30秒，72℃1分钟，5个循环；扩增及荧光收集95℃10秒，55℃40秒，40个循环。同时设置阳性梯度模板和阴性对照。结果判定严格按照ABI7300仪器操作说明书和PCR检测试剂盒说明书进行。
1.3.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计学软件进行数据处理。
2 结 果
检测结果见表1、表2、表3。
3 讨 论
HFMD在全球范围内广泛流行，是婴幼儿时期的常见传染病，1958年最先发现CA16为HFMD病原体，1969年首次分离出EV71。此后CA16和EV71一直作为HFMD的主要病原出现于报道之中。在我国，1981年上海市首次报道HFMD，此后各地报道逐渐增多。2008年5月卫生部将本病列入我国法定丙类传染病，严格了HFMD的报告与管理。据2010年卫生部统计数据，在丙类传染病中，2009年HFMD报告发病数和报告死亡数均跃居首位，HFMD业已成为危害我国儿童健康的重要公共卫生问题。 实时荧光定量PCR技术是新兴的针对病原体核酸的快速检测技术，该方法具有定量检测、快速、灵敏度高、特异性强以及自动化程度高的特点，使基因扩增和产物分析全过程都在封闭条件下进行，实现了实时监测和自动分析，从根本上解决了传统PCR检测过程中产物易受污染和不能定量的问题。
本研究结果显示，蚌埠市HFMD病原2010年为EV71和CA16交替出现，而2011年则EV71为占绝对优势流行株（93.02%）。EV71感染性强，除引发和CoxAl6相似的手足口症状外，还可引起严重的神经系统并发症，如脑膜炎、脑炎、弛缓性瘫痪等。2008年全国监测数据显示，96%以上的实验室确诊死亡病例由EV71感染引起[3]。本研究EV71高检出率的结果与国内北京、上海、浙江、湖南等地的报道结果一致[4-7]，提示EV71是国内近年来HFMD流行的主要病原体。
参考文献
[1] WHO regional office for the Western Pacific.A guide to clinical management and public health response for hand，foot and mouth disease（HFMD）.2011[2011-10-18].http：//www.wpro.who.Int/publications/PUB_9789290615255.htm.
[2] 安徽省卫生厅.我省阜阳积极防治肠道病毒感染疾病[EB/OL].[2008-06-20].http：//www.ahwst.gov.cn.
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[4] 伏谨，张艳玲，孙春荣，等.实时RT-PCR检测159例手足口病患儿样本中肠道病毒的结果分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，2009，23（6）：488-490.
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[7] 黄威，周帅锋，张帆，等.2008——2010年湖南省哨点医院手足口病病原学检测结果及基因特征分析[J].实用预防医学，2011，18（5）：779-784.