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摘?要 高等植物中的激素研究取得了大量成就，而藻类中植物激素的研究远远落后于高等植物，制约了人们对海洋植物资源的开发和利用。本文针对藻类中五种主要的植物激素（生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯）的分离、纯化及测定方法的研究状况经行概述。
关键词 藻类；植物激素；分离；纯化；测定
中图分类号 Q946 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)082-0222-02
藻类中激素的深入研究是从上世纪七十年代才开始的，起步和研究水平都远远落后于高等植物，制约了人们对海洋植物资源的开发和利用，因此研究藻类中个的植物激素显得尤为重要。迄今为止，已有的研究表明，藻类中植物激素的情况十分复杂，高等植物中已经确定的激素有些可能在藻类中仍起激素作用，有些则不起作用。某些藻类还可能会以自己特有的激素来调节其生长和发育。目前可靠的激素分析技术，如：GC-MS、NMR等已经建立。在生物试法的基础上，经气相色谱或高压液相色谱的分离、纯化，再通过GC-MS等后续检测技术的分析检测，可以确定活性物质的化学结构，从而可以确定被检测物与已知激素的关系，或进一步分析其激素性质。本文综合当前国内外对藻类植物激素分离、纯化及鉴定的研究进展情况，对其研究状况做一较全面的概述。
1 藻类中的植物激素
广义的植物激素的定义是指任何浓度上低于营养物质而能影响生长发育的化学物质。目前已经广泛公认的植物激素有五大类，分别是生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、脱落酸类和乙烯。这些激素协同作用，调节植物体各部分的生长速率和不同组织器官的分化，控制生殖过程，还能使成熟的植物对环境变化做出反应。但因为藻类中的植物激素含量普遍较陆地高等植物低，所以对前者的研究远不如后者系统和充分。
1.1 生长素类
最早在海藻中发现生长素的是Van Der Weiij，他用标准燕麦弯曲法在大泡法囊藻（Valonia macrophysa）的细胞壁和原生质中发现有极低浓度的生长素，但不能排除检测到的生长素是由附着于海藻上的微生物产生的。1940年，Thirmann和Scoog发现生长素在植物组织中以多种化学形式存在，但最可能的活性形式是IAA。IAA能在植物中起到快速的反应（如使细胞增长），也能起到长期的反应（如细胞分裂和分化）。后来，随着分离技术的发展和研究的深入，陆续又有一些生长素被鉴定出来。
生长素在藻体中的含量与海藻所处的发育阶段和藻体的部位有密切的关系。通常处在发育阶段和生长季节的海藻中生长素的含量较高，其合成部位主要在植物体的尖端。生长素在藻体内具有结合态和游离态两种形式，能够影响细胞形成层的活性；增强细胞膜的渗透性；诱导乙烯的生成。
1.2 细胞分裂素
细胞分类素又称细胞分裂素，它是具有生理活性的一类嘌呤衍生物。早在1969年Jennings就对昆布等褐藻和沙菜等红藻中的内源细胞分裂素的含量和其作为植物生长调节物质的作用进行了研究。自此之后，这方面的研究报道不断增多。Mooney和Van Steden在1987年使用HPLC方法分析了海藻中主要有t-玉米素、二氢玉米素、异戊烯腺苷嘌呤和t-玉米素核苷等细胞激动素。1991年日本科学家Farooqi使用NMR技术再一次证实了海藻中除了含有上述细胞激动素外还含有玉米素，玉米素核苷，6-氨甲基嘌呤等，并且证实了这些细胞激动素的活性。
细胞分裂素可以促进藻类生长、加速细胞分裂、增加蛋白质和叶绿素的含量，并可调节藻类的形态建成和再生。CTK在植物多种胁迫中起到从根到冠的信息介质的作用，温度逆境、水分亏缺、盐胁迫均使CTK含量发生变化。
1.3 赤霉素
赤霉素是一类属于双萜类化合物的植物激素。因为赤霉素都含有羧基，故呈酸性。内源赤霉素以游离和结合型两种形态存在，可以互相转化。
赤霉素能增加大型海藻的生长速率。早在60年代，科学家就已经发现了海藻中含有赤霉素类似物。生物检测发现昆布属和浒苔属的海藻有赤霉素活性，并发现了存在至少两种赤霉素GA3和GA7。
1.4 脱落酸
脱落酸又称离层酸是一种具有倍半萜结构的植物激素。它是一种较强的生长抑制剂，可抑制整株植物或离体器官的生长，对生长的作用与IAA、GA和CTK相反，并对细胞的分裂与伸长起抑制作用。
Kingman在1982年发现掌状海带中含有水溶性的植物生长抑制剂，并且性质类似于脱落酸，使用GC和GC-MS技术证实了这类物质是脱落酸。
逆境下植物启动脱落酸合成系统，合成大量的脱落酸，促进气孔关闭，抑制气孔开放；促进水分吸收，诱导抗旱特异性蛋白质合成，调整保卫细胞离子通道，诱导ABA基因改变相关基因的表达，增强植株抵抗逆境的能力。
1.5 乙烯
乙烯对藻类细胞分裂有促进作用，影响藻类的生长速率。乙烯不像其它植物激素化合物，它是一种气体。在所有的已知植物生长物质中，乙烯是结构最为简单的一种，它仅由两个碳原子和四个氢原子组成。至今国际上对海藻中乙烯的研究很少，Van den Driessche在1988年研究伞藻的发育和生理节律过程中发现了伞藻中含有乙烯。
乙烯在生物学系统中充当一个信号分子的角色，具有“遇激而增，信息应变”的性质和作用。近几年的研究发现，各种环境胁迫都能引起乙烯产生量的增加，如：机械胁迫、低温、水、盐、干旱等都能使一些植物的乙烯增加。乙烯提高抗旱性的生理基础可能是通过脯氨酸、SOD和POD的抗氧化作用保护细胞膜免受破坏或破坏程度受到削弱而提高抗旱性。
2 藻类激素的提取和鉴定
2.1 提取和纯化
2.1.1 提取前的处理
已有研究表明海洋细菌能够分泌植物生长促进剂，为了排除这类物质对实验的干扰，Tietz等人采用无菌培养的藻类进行研究，测定了ABA的含量。但韩丽君等测定16种海藻中的生长素时，对样品的前处理则相对简单。仅用干净海水冲洗藻体，除去其表面附着的微小生物和杂质，再用吸水纸将藻体表面的水分吸干即可。推测是由于某些藻体能分泌大量的粘液，阻碍了细菌的附着，因此只需简单清洗。Ashen认为经冲洗过的材料表面附着的极少数的微生物不会对IAA的测定产生影响。 韩丽君等的研究所用的材料均为新鲜采集的样品，但马志珍则提出对于培养后再用于研究的材料，除应采用无菌处理外，还应使用化学成分限定的培养液，以排除海水中的一些物质对实验带来的影响。
马志珍还提出全部实验应在植物组织培养实验室的可控条件下进行，包括使用已灭菌的培养基和玻璃器皿，并且所有的接种操作都应在无菌罩中进行。Han等则将玻璃用5%三氯甲酰硅烷的苯溶液处理1h，再用丙酮和水漂洗，于100℃下烘干后再用于ABA的提取。
2.1.2 提取
根据已有的文献，目前国外从植物组织中提取生长素的方法主要有渗滤法和溶剂提取法。渗滤法的提取工艺比较简单，使植物组织中的生长素通过浓度扩散进入琼脂即可。但是这种方法只能直接用于生物检测，不能进一步进行仪器分析。溶剂提取法是指通过适当的有机溶剂浸泡植物组织，使生长素溶入提取液的一种化学方法。这种方法提取的样品经不同的纯化步骤后可以满足多种检测方法的要求。
甲醇是最常用的提取剂，但是提取法方法不同结果差异很大。牟晓真比较了磨碎和未经磨碎的样品在相同的条件下使用甲醇提取IAA的效率，结果发现海藻样品在浸提前磨碎是必要的。乙醇丙酮等也常作为提取溶剂被采用，但未见用于藻类提取的报道。陈雪梅等用100%冰冻乙腈提取IAA、ABA，经高效液相色谱分析，平均回收率为88.5%、90.8%。Thirmann认为用乙腈提取可大大减少酚类物质及其他杂质的溶出。
2.1.3 纯化
提取后的溶液可能含有较多的色素和杂质，这些物质的存在会对分析结果带来极大的影响，利用合适的方法去除这些色素和杂质对于后续的实验具有重要的意义。纯化的方法主要有萃取法，即利用植物激素和杂质在不同溶剂中溶解度的差异进行分离；层析分离：主要包括纸层析、薄层层析、柱层析和制备型高效液相色谱等。这些方法具有不同的纯化效率和适用条件，常常结合使用，以达到最佳的纯化效果。
韩丽君等利用石油醚做为海藻IAA粗提液的脱色剂，发现在中性或弱碱性范围内石油醚脱色带来的IAA损失率为0.09%，是一种效果极好的脱色剂。萃取的原理是通过调节酸碱环境，使提取液中的植物激素与杂质分别进入有机相和水相，因此寻找适宜的萃取条件是非常重要的。牟晓真研究发现，PH=3.0时，用乙醚作为萃取剂萃取水相中的IAA能取得很好的效果，IAA的回收率可达90.9%。DEAE是弱碱性阴离子交换柱，常用于提纯IAA、ABA、Gas，而Dowex50强阳离子交换柱或国产强阳离子树脂732则可用于CTK的提纯。沈镇德等结合使用交联葡聚糖I.H-20和C18柱替代DEAE、Dowex50及氧化铝薄层层析纯化了IAA、ABA、GA和CTK，认为此方法不仅缩短时效、提高纯度，还提高了回收率。
2.2 鉴定
藻类植物激素的鉴定方法依据其原理的不同大体上可分为三类，即生物检测法、免疫学方法以及物理化学方法。
2.2.1 生物检测法
生物检测法是最早使用的植物激素测定方法，它是依据植物激素的生理活性，通过某些植物的组织或器官产生的特异反应来进行测定。
目前使用的生物检测法主要有：1）萝卜叶扩张分析法；2）大麦叶感觉分析法；3）莴苣下胚轴生长分析法；4）Amarantbus Caudatus分析法；5）烟草愈伤组织和茎组织分析法；6）大豆组织分析法；7）黄瓜种子子叶分析法。通过对海藻液进行生物检测可以获得很有用的数据，但是它有很大的局限性，因为它不能对其活性准确的定性和定量。当生物检测受到非特异性干扰而导致生长抑制现象，就不像出现生长促进现象那么容易解决。生物检测法可以作为寻找藻类中激素的第一步，经测试有活性存在后，才有作下一步纯化的必要。
2.2.2 物理化学方法
物理化学方法可分为光谱和色谱法两类。光谱法专一性较差，已较少使用。但吲哚乙酸能与醋酸酐反应生成具荧光性的吲哚吡喃酮，可利用荧光法测定，灵敏度较高。赤霉素GA3与浓硫酸作用形成三环芳烃衍生物。在紫外光激发下，呈现出绿色荧光，也可利用荧光法测定。
色谱法是利用物质在不同介质中的分配原理，包括纸层析、薄层层析（TLC）、气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、以及气-质联用（GC-MS）和HPLC-MS联用等，其特点是将分离和测定结合起来。但由于纸层析和TLC的分离效率和灵敏度有一定限制，常常作为分离的一种方式与其它方法结合使用。
GC和HPLC自六十年代起开始在植物激素的测定中应用，因其具有专一、灵敏、准确的特点，已成为当前激素测定中最常用的技术。GC具有很高的灵敏度和选择性，可用于所有植物激素的分析，但都必须先形成易挥发的甲基化和三甲基硅烷化等衍生物后才可用于分析。Elmar等用重氮甲烷作为衍生试剂使提取的植物激素甲酯化，但因为重氮甲烷性质活泼，有毒、易发生爆炸，对操作要求较高，Eric等用三甲基硅烷基重氮甲烷代替重氮甲烷反应，在降低危险性的同时还保证了衍生化的效率。
GC不能对激素作最后的定论，因为无法排除杂志和污染物与标准品的共色层分离，所以预先的纯化步骤显得尤为重要。HPLC在除乙烯外的四大类植物激素的研究中得到广泛的应用，可直接分析不易挥发的物质，起检测极限已达ng至pg级水平。藻类激素研究中，气-质联用法的检测是结论性的，可以得到被检测物的准确化学结构，从而确认激素的性质，并精确的定量。
高等植物中的激素研究取得了大量成就，而藻类中植物激素的研究远远落后于高等植物，若要作进一步深入探讨，就有必要借鉴其它植物上应用的检测分离技术，在引用其它技术的同时也要不断摸索适合藻类自身特点的实验方法，只有这样，才能为研究藻类激素的代谢规律、调节机制提供实践的可能。
参考文献
[1]Tarakhovskaya E R,Maslov I, Shishova M F. Phytohormones in algae. Russian Jorunal of Plant Physiology,2007,54(2):163-170. [2]Zhang W,Yamane H,Chapmam D J.The phytohormone profile of the red alga porphyra perforata. Botanica Marina,1993,67-68.
[3]郭丽红,王定康,杨晓虹等.外源乙烯利对干旱胁迫过程中玉米幼苗某些抗逆生理指标的影响[J].云南大学学报,2004,26(4):352-356.
[4]Crouch I J, Staden J V, Evidence for the presence of plant growth regulators in commercial seaweed products.Plant growth regulation,1993,13:21-29.
[5]Han Lijun. The auxin concentration in sixteen Chinese marine algae.Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2006,24(3):329-332.
[6]Ashen J B.GC-SIM-MS determination and quantification of free indole-3-acetic acid in bacterial galls on the marine alga Priontis lanceolata. Phycol,1999,35:493-500.
[7]马志珍.植物激素在控制藻类生长发育中的作用[J].1999,Phycology,27(1):317-321.
[8]Han L J.Method for extracting, separating and purifying seaweed auxin. Journal of Oceanography of Huanhai&Bohai Seas 20(2):70-76.
[9]牟晓真.海藻中植物生长素的提取、纯化及测定[J].中科院海洋所硕士论文,2000.
[10]陈雪梅.HPLC法测定分析植物组织中ABA,IAA和NAA[J].植物生理学通讯,2003,28(5):47-49.
[11]Thirmann K V. The extraction of auxin from plant tissues. American Journal Botany.2002,27:951-960.
[12]沈镇德,丁静.植物内源激素的提取疏散和生物判定[J].植物生理学通讯,1999,4:16-18.
[13]Elmar W,Weiler. A multiplex GC-MS/MS technique for the sensitive and quantitative single-run analysis of acidic phytohormones and related compounds and its application to Arabidopsis thaliana. Plant,2002,216:44-56.
[14] Eric A,Schmelz. Simultaneous analysis of phytohormones,phytotoxins, and volatile organic compounds in plants. Plant,2003,100:32-39.
作者简介
邵玮（1985—），女，贵州贵阳人，硕士研究生，现为贵阳护理职业学院卫管系教师，研究方向：藻类生化代谢及其环境效应。
关键词 藻类；植物激素；分离；纯化；测定
中图分类号 Q946 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)082-0222-02
藻类中激素的深入研究是从上世纪七十年代才开始的，起步和研究水平都远远落后于高等植物，制约了人们对海洋植物资源的开发和利用，因此研究藻类中个的植物激素显得尤为重要。迄今为止，已有的研究表明，藻类中植物激素的情况十分复杂，高等植物中已经确定的激素有些可能在藻类中仍起激素作用，有些则不起作用。某些藻类还可能会以自己特有的激素来调节其生长和发育。目前可靠的激素分析技术，如：GC-MS、NMR等已经建立。在生物试法的基础上，经气相色谱或高压液相色谱的分离、纯化，再通过GC-MS等后续检测技术的分析检测，可以确定活性物质的化学结构，从而可以确定被检测物与已知激素的关系，或进一步分析其激素性质。本文综合当前国内外对藻类植物激素分离、纯化及鉴定的研究进展情况，对其研究状况做一较全面的概述。
1 藻类中的植物激素
广义的植物激素的定义是指任何浓度上低于营养物质而能影响生长发育的化学物质。目前已经广泛公认的植物激素有五大类，分别是生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类、脱落酸类和乙烯。这些激素协同作用，调节植物体各部分的生长速率和不同组织器官的分化，控制生殖过程，还能使成熟的植物对环境变化做出反应。但因为藻类中的植物激素含量普遍较陆地高等植物低，所以对前者的研究远不如后者系统和充分。
1.1 生长素类
最早在海藻中发现生长素的是Van Der Weiij，他用标准燕麦弯曲法在大泡法囊藻（Valonia macrophysa）的细胞壁和原生质中发现有极低浓度的生长素，但不能排除检测到的生长素是由附着于海藻上的微生物产生的。1940年，Thirmann和Scoog发现生长素在植物组织中以多种化学形式存在，但最可能的活性形式是IAA。IAA能在植物中起到快速的反应（如使细胞增长），也能起到长期的反应（如细胞分裂和分化）。后来，随着分离技术的发展和研究的深入，陆续又有一些生长素被鉴定出来。
生长素在藻体中的含量与海藻所处的发育阶段和藻体的部位有密切的关系。通常处在发育阶段和生长季节的海藻中生长素的含量较高，其合成部位主要在植物体的尖端。生长素在藻体内具有结合态和游离态两种形式，能够影响细胞形成层的活性；增强细胞膜的渗透性；诱导乙烯的生成。
1.2 细胞分裂素
细胞分类素又称细胞分裂素，它是具有生理活性的一类嘌呤衍生物。早在1969年Jennings就对昆布等褐藻和沙菜等红藻中的内源细胞分裂素的含量和其作为植物生长调节物质的作用进行了研究。自此之后，这方面的研究报道不断增多。Mooney和Van Steden在1987年使用HPLC方法分析了海藻中主要有t-玉米素、二氢玉米素、异戊烯腺苷嘌呤和t-玉米素核苷等细胞激动素。1991年日本科学家Farooqi使用NMR技术再一次证实了海藻中除了含有上述细胞激动素外还含有玉米素，玉米素核苷，6-氨甲基嘌呤等，并且证实了这些细胞激动素的活性。
细胞分裂素可以促进藻类生长、加速细胞分裂、增加蛋白质和叶绿素的含量，并可调节藻类的形态建成和再生。CTK在植物多种胁迫中起到从根到冠的信息介质的作用，温度逆境、水分亏缺、盐胁迫均使CTK含量发生变化。
1.3 赤霉素
赤霉素是一类属于双萜类化合物的植物激素。因为赤霉素都含有羧基，故呈酸性。内源赤霉素以游离和结合型两种形态存在，可以互相转化。
赤霉素能增加大型海藻的生长速率。早在60年代，科学家就已经发现了海藻中含有赤霉素类似物。生物检测发现昆布属和浒苔属的海藻有赤霉素活性，并发现了存在至少两种赤霉素GA3和GA7。
1.4 脱落酸
脱落酸又称离层酸是一种具有倍半萜结构的植物激素。它是一种较强的生长抑制剂，可抑制整株植物或离体器官的生长，对生长的作用与IAA、GA和CTK相反，并对细胞的分裂与伸长起抑制作用。
Kingman在1982年发现掌状海带中含有水溶性的植物生长抑制剂，并且性质类似于脱落酸，使用GC和GC-MS技术证实了这类物质是脱落酸。
逆境下植物启动脱落酸合成系统，合成大量的脱落酸，促进气孔关闭，抑制气孔开放；促进水分吸收，诱导抗旱特异性蛋白质合成，调整保卫细胞离子通道，诱导ABA基因改变相关基因的表达，增强植株抵抗逆境的能力。
1.5 乙烯
乙烯对藻类细胞分裂有促进作用，影响藻类的生长速率。乙烯不像其它植物激素化合物，它是一种气体。在所有的已知植物生长物质中，乙烯是结构最为简单的一种，它仅由两个碳原子和四个氢原子组成。至今国际上对海藻中乙烯的研究很少，Van den Driessche在1988年研究伞藻的发育和生理节律过程中发现了伞藻中含有乙烯。
乙烯在生物学系统中充当一个信号分子的角色，具有“遇激而增，信息应变”的性质和作用。近几年的研究发现，各种环境胁迫都能引起乙烯产生量的增加，如：机械胁迫、低温、水、盐、干旱等都能使一些植物的乙烯增加。乙烯提高抗旱性的生理基础可能是通过脯氨酸、SOD和POD的抗氧化作用保护细胞膜免受破坏或破坏程度受到削弱而提高抗旱性。
2 藻类激素的提取和鉴定
2.1 提取和纯化
2.1.1 提取前的处理
已有研究表明海洋细菌能够分泌植物生长促进剂，为了排除这类物质对实验的干扰，Tietz等人采用无菌培养的藻类进行研究，测定了ABA的含量。但韩丽君等测定16种海藻中的生长素时，对样品的前处理则相对简单。仅用干净海水冲洗藻体，除去其表面附着的微小生物和杂质，再用吸水纸将藻体表面的水分吸干即可。推测是由于某些藻体能分泌大量的粘液，阻碍了细菌的附着，因此只需简单清洗。Ashen认为经冲洗过的材料表面附着的极少数的微生物不会对IAA的测定产生影响。 韩丽君等的研究所用的材料均为新鲜采集的样品，但马志珍则提出对于培养后再用于研究的材料，除应采用无菌处理外，还应使用化学成分限定的培养液，以排除海水中的一些物质对实验带来的影响。
马志珍还提出全部实验应在植物组织培养实验室的可控条件下进行，包括使用已灭菌的培养基和玻璃器皿，并且所有的接种操作都应在无菌罩中进行。Han等则将玻璃用5%三氯甲酰硅烷的苯溶液处理1h，再用丙酮和水漂洗，于100℃下烘干后再用于ABA的提取。
2.1.2 提取
根据已有的文献，目前国外从植物组织中提取生长素的方法主要有渗滤法和溶剂提取法。渗滤法的提取工艺比较简单，使植物组织中的生长素通过浓度扩散进入琼脂即可。但是这种方法只能直接用于生物检测，不能进一步进行仪器分析。溶剂提取法是指通过适当的有机溶剂浸泡植物组织，使生长素溶入提取液的一种化学方法。这种方法提取的样品经不同的纯化步骤后可以满足多种检测方法的要求。
甲醇是最常用的提取剂，但是提取法方法不同结果差异很大。牟晓真比较了磨碎和未经磨碎的样品在相同的条件下使用甲醇提取IAA的效率，结果发现海藻样品在浸提前磨碎是必要的。乙醇丙酮等也常作为提取溶剂被采用，但未见用于藻类提取的报道。陈雪梅等用100%冰冻乙腈提取IAA、ABA，经高效液相色谱分析，平均回收率为88.5%、90.8%。Thirmann认为用乙腈提取可大大减少酚类物质及其他杂质的溶出。
2.1.3 纯化
提取后的溶液可能含有较多的色素和杂质，这些物质的存在会对分析结果带来极大的影响，利用合适的方法去除这些色素和杂质对于后续的实验具有重要的意义。纯化的方法主要有萃取法，即利用植物激素和杂质在不同溶剂中溶解度的差异进行分离；层析分离：主要包括纸层析、薄层层析、柱层析和制备型高效液相色谱等。这些方法具有不同的纯化效率和适用条件，常常结合使用，以达到最佳的纯化效果。
韩丽君等利用石油醚做为海藻IAA粗提液的脱色剂，发现在中性或弱碱性范围内石油醚脱色带来的IAA损失率为0.09%，是一种效果极好的脱色剂。萃取的原理是通过调节酸碱环境，使提取液中的植物激素与杂质分别进入有机相和水相，因此寻找适宜的萃取条件是非常重要的。牟晓真研究发现，PH=3.0时，用乙醚作为萃取剂萃取水相中的IAA能取得很好的效果，IAA的回收率可达90.9%。DEAE是弱碱性阴离子交换柱，常用于提纯IAA、ABA、Gas，而Dowex50强阳离子交换柱或国产强阳离子树脂732则可用于CTK的提纯。沈镇德等结合使用交联葡聚糖I.H-20和C18柱替代DEAE、Dowex50及氧化铝薄层层析纯化了IAA、ABA、GA和CTK，认为此方法不仅缩短时效、提高纯度，还提高了回收率。
2.2 鉴定
藻类植物激素的鉴定方法依据其原理的不同大体上可分为三类，即生物检测法、免疫学方法以及物理化学方法。
2.2.1 生物检测法
生物检测法是最早使用的植物激素测定方法，它是依据植物激素的生理活性，通过某些植物的组织或器官产生的特异反应来进行测定。
目前使用的生物检测法主要有：1）萝卜叶扩张分析法；2）大麦叶感觉分析法；3）莴苣下胚轴生长分析法；4）Amarantbus Caudatus分析法；5）烟草愈伤组织和茎组织分析法；6）大豆组织分析法；7）黄瓜种子子叶分析法。通过对海藻液进行生物检测可以获得很有用的数据，但是它有很大的局限性，因为它不能对其活性准确的定性和定量。当生物检测受到非特异性干扰而导致生长抑制现象，就不像出现生长促进现象那么容易解决。生物检测法可以作为寻找藻类中激素的第一步，经测试有活性存在后，才有作下一步纯化的必要。
2.2.2 物理化学方法
物理化学方法可分为光谱和色谱法两类。光谱法专一性较差，已较少使用。但吲哚乙酸能与醋酸酐反应生成具荧光性的吲哚吡喃酮，可利用荧光法测定，灵敏度较高。赤霉素GA3与浓硫酸作用形成三环芳烃衍生物。在紫外光激发下，呈现出绿色荧光，也可利用荧光法测定。
色谱法是利用物质在不同介质中的分配原理，包括纸层析、薄层层析（TLC）、气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、以及气-质联用（GC-MS）和HPLC-MS联用等，其特点是将分离和测定结合起来。但由于纸层析和TLC的分离效率和灵敏度有一定限制，常常作为分离的一种方式与其它方法结合使用。
GC和HPLC自六十年代起开始在植物激素的测定中应用，因其具有专一、灵敏、准确的特点，已成为当前激素测定中最常用的技术。GC具有很高的灵敏度和选择性，可用于所有植物激素的分析，但都必须先形成易挥发的甲基化和三甲基硅烷化等衍生物后才可用于分析。Elmar等用重氮甲烷作为衍生试剂使提取的植物激素甲酯化，但因为重氮甲烷性质活泼，有毒、易发生爆炸，对操作要求较高，Eric等用三甲基硅烷基重氮甲烷代替重氮甲烷反应，在降低危险性的同时还保证了衍生化的效率。
GC不能对激素作最后的定论，因为无法排除杂志和污染物与标准品的共色层分离，所以预先的纯化步骤显得尤为重要。HPLC在除乙烯外的四大类植物激素的研究中得到广泛的应用，可直接分析不易挥发的物质，起检测极限已达ng至pg级水平。藻类激素研究中，气-质联用法的检测是结论性的，可以得到被检测物的准确化学结构，从而确认激素的性质，并精确的定量。
高等植物中的激素研究取得了大量成就，而藻类中植物激素的研究远远落后于高等植物，若要作进一步深入探讨，就有必要借鉴其它植物上应用的检测分离技术，在引用其它技术的同时也要不断摸索适合藻类自身特点的实验方法，只有这样，才能为研究藻类激素的代谢规律、调节机制提供实践的可能。
参考文献
[1]Tarakhovskaya E R,Maslov I, Shishova M F. Phytohormones in algae. Russian Jorunal of Plant Physiology,2007,54(2):163-170. [2]Zhang W,Yamane H,Chapmam D J.The phytohormone profile of the red alga porphyra perforata. Botanica Marina,1993,67-68.
[3]郭丽红,王定康,杨晓虹等.外源乙烯利对干旱胁迫过程中玉米幼苗某些抗逆生理指标的影响[J].云南大学学报,2004,26(4):352-356.
[4]Crouch I J, Staden J V, Evidence for the presence of plant growth regulators in commercial seaweed products.Plant growth regulation,1993,13:21-29.
[5]Han Lijun. The auxin concentration in sixteen Chinese marine algae.Chinese Journal of Oceanology and Limnology,2006,24(3):329-332.
[6]Ashen J B.GC-SIM-MS determination and quantification of free indole-3-acetic acid in bacterial galls on the marine alga Priontis lanceolata. Phycol,1999,35:493-500.
[7]马志珍.植物激素在控制藻类生长发育中的作用[J].1999,Phycology,27(1):317-321.
[8]Han L J.Method for extracting, separating and purifying seaweed auxin. Journal of Oceanography of Huanhai&Bohai Seas 20(2):70-76.
[9]牟晓真.海藻中植物生长素的提取、纯化及测定[J].中科院海洋所硕士论文,2000.
[10]陈雪梅.HPLC法测定分析植物组织中ABA,IAA和NAA[J].植物生理学通讯,2003,28(5):47-49.
[11]Thirmann K V. The extraction of auxin from plant tissues. American Journal Botany.2002,27:951-960.
[12]沈镇德,丁静.植物内源激素的提取疏散和生物判定[J].植物生理学通讯,1999,4:16-18.
[13]Elmar W,Weiler. A multiplex GC-MS/MS technique for the sensitive and quantitative single-run analysis of acidic phytohormones and related compounds and its application to Arabidopsis thaliana. Plant,2002,216:44-56.
[14] Eric A,Schmelz. Simultaneous analysis of phytohormones,phytotoxins, and volatile organic compounds in plants. Plant,2003,100:32-39.
作者简介
邵玮（1985—），女，贵州贵阳人，硕士研究生，现为贵阳护理职业学院卫管系教师，研究方向：藻类生化代谢及其环境效应。