黑羽番鸭GH基因多态性与体质量、屠宰性能的相关性

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  摘要:以黑羽番鸭为素材,利用PCR-SSCP技术寻找该群体GH基因单核苷酸多态性(SNPs),并分析SNPs与体质量、屠宰性能的关联性。结果表明,在GH基因第1内含子上发现了A1251C、A1322G、T1378C、G1440A共4个SNP,形成了AA、AB、BB 3种基因型,群体纯合度为0.502 7,多态信息含量为0.373 6。在番鸭早期生长发育过程中,BB型公鸭体质量在不同周龄时处于最高值;在13周龄屠宰时,BB型公鸭的宰前活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量显著高于AA型和AB型(P<0.05);在内脏组织中,BB型腹脂质量、心质量显著高于AB型(P<0.05);AA型、AB型、BB型 3种基因型间屠宰指标百分比无显著差异(P>0.05)。母鸭所有指标在3种基因型间均无显著差异(P>005)。这些关联分析表明B基因可能是公鸭早期增重的有利基因,在母鸭上还需进一步验证。
  关键词:黑羽番鸭;生长激素基因;体质量;屠宰性能
  中图分类号: S834.2文献标志码: A文章编号:1002-1302(2014)09-0030-04
  收稿日期:2013-12-04
  基金项目:中国农业科学院家养动物种质资源平台建设项目;江苏省农业三新工程项目[编号:SXGC(2013)361]。
  作者简介:王丽华(1972—),女,辽宁营口人,硕士,副教授,主要从事家禽生产与科研工作。E-mail:[email protected]。目前,水禽生长方面的功能基因研究主要是围绕下丘脑-垂体-生长轴调节过程中的基因。生长激素(growth hormone,GH)是动物垂体前叶合成、分泌的一种单链蛋白类激素,具有种属特异性,在刺激生长、促进代谢、强化其他内分泌激素方面具有重要作用,还对动物生殖功能产生影响[1]。通过对动物(包括人和畜禽)GH基因的深入研究,目前已明晰其基本结构。通常,畜禽GH分子量为21~22 ku,由186~191个氨基酸组成。动物GH基因一级结构主要有如下特点:包括人类在内的灵长类动物中,GH基因拷贝数较多;GH基因主要由5~6个外显子和4~5个内含子所组成,且GH基因的外显子数量和大小存在种间特异性;GH基因的cDNA长度一般为650~1 200 bp。在1988年,Chen等首次克隆获得了820个碱基对的鸭GH基因cDNA序列,编码216个氨基酸,含有1个27个残基的信号肽,该序列与鸡高度同源[2]。2004年GenBank上才有了鸭GH基因全序列的报道,该序列包含了 5 219个碱基对,同样编码216个氨基酸,包含了5个外显子和4个内含子。虽然有了鸭GH基因全序列,但是在各个鸭品种GH基因多态性方面开展的研究工作较少,鉴于此,本试验拟采用PCR-SSCP方法检测黑羽番鸭GH基因序列中潜在的SNPs,并分析不同基因型间体质量、屠宰性能之间的差异,为GH基因功能研究提供参考资料。
  1材料与方法
  1.1试验对象
  试验所用黑羽番鸭由江苏农牧科技职业学院提供,选择健康黑羽番鸭135只进行饲养,其中公鸭70羽,母鸭65羽。在初生(0周龄)及2、4、6、8、10、13周龄时测定禁食6 h后的体质量;10周龄时,从翅静脉采血2 mL,采用肝素钠抗凝,用于提取DNA。13周龄时,对所有黑羽番鸭进行屠宰测定,测定指标为宰前活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量、腿肌质量、胸肌质量、肝质量、心质量、腺肌胃质量、腹脂质量等,用公式计算出相应指标占有的比例。
  1.2引物设计
  根据GenBank中公布的水禽GH基因序列,设计了多对引物用于检测黑羽番鸭群体中存在的SNPs。引物由生物公司进行合成。试验所用引物序列及信息见表1。表1试验所用引物序列及信息引物名称引物序列(5′→3′)产物长度1.3DNA提取和检测
  采用酚/氯仿法抽提黑羽番鸭基因组DNA,并溶于TE中。用核酸浓度测定仪测定其浓度和纯度,然后稀释成100 ng/μL备用。
  1.4PCR扩增
  PCR反应物组成:10×PCR buffer(不含Mg2+) 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、10 pmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL,加ddH2O至25 μL。
  PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,54~56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。
  1.5PCR产物检测及分型
  PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳,结束后用凝胶成像系统检测扩增结果。条带单一清楚、长度大小符合的产物才能用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。点样前样品需要进行处理形成单链,经过5 V/cm的电压电泳过夜后,用银染显色,然后进行基因型分析。
  1.6测序
  挑选纯合基因型的PCR产物进行切胶回收,连接到PMD18-T载体上转化到大肠杆菌DH5α上,经过大量繁殖后,通过鉴定后提取质粒送公司进行测序分析。
  1.7统计分析
  测序所得序列通过DNAMAN软件进行比对获得不同基因型之间具体的序列差异。采用SPSS 13.0软件中单因素方差法分析不同基因型之间体质量和屠宰性能的差异。
  2结果与分析
  2.1SSCP检测结果
  以黑羽番鸭基因组DNA为模板与所设计的6对引物分别进行PCR扩增,扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶检测,扩增片段与预期大小一致且特异性好,方可用于SSCP分析。
  在SSCP结果分析中发现,只有引物GH16扩增的片段可以检测到多态,聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染结果见图1。由图1可知,在黑羽番鸭群体中共检测到3种基因型,纯合子定义为AA、BB,杂合子定义为AB。   2.2不同纯合基因型的克隆和测序
  取AA、BB基因型多个PCR产物进行回收、克隆、测序。AA和BB基因型之间序列比较发现,存在4个单核苷酸变异,均位于第1内含子,分别为第1 251位点A-C突变、第 1 322 位点A-G突变、第1 378位点T-C突变、第1 440位点G-A突变(图2)。
  2.3不同基因型(基因)频率在黑羽番鸭群体中的分布
  在引物GH16检测到的不同基因型在黑羽番鸭群体中分布情况见表2。由表2可知,杂合子AB型基因型频率最高,为0.614 8;AA型次之,为0.229 6;BB型最低,为0.155 6。A等位基因频率比B等位基因频率高0.074 0。
  表2引物GH16不同基因型及等位基因在黑羽番鸭群体中的分布
  素材样本量
  (羽)基因型频率等位基因频率AAABBBAB黑羽番鸭1350.229 6 0.614 8 0.155 6 0.537 0 0.463 0
  2.4遗传特性分析
  根据GH基因突变位点等位基因频率可推算出黑羽番鸭群体平均纯合度为0.502 7,杂合度为0.497 3,多态性信息含量为0.373 6(表3)。
  2.5生产性能与多态位点的关联性分析
  2.5.1GH16多态位点对体质量性能的影响由表4可知,BB型公鸭体质量在所有时间点均处于最高值,初生时BB型公鸭体质量显著性高于AA型;在4、6、8周龄时3种基因型间体质量无显著差异;在2、10、13周龄时,BB型体质量显著性高于AA、AB型,AA与AB型之间无显著差异。除0周龄外,其他各周龄母鸭均以BB型体质量处于最高值;母鸭各周龄不同基因型之间均无显著性差异。表4引物GH16不同基因型间体质量比较
  2.5.2GH16多态位点对屠宰性能的影响由表5可知,BB型公鸭活质量、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量均显著高于AA型、AB型;胸肌质量、腿肌质量、肝质量在3种基因型间无显著差异;BB型腹脂质量、心质量显著高于AB型,AA型与BB型、AB型无显著差异;BB型腺肌胃质量显著高于AA型,AB型与AA型、BB型无显著差异。
  10个屠宰质量指标在母鸭3种基因型之间均无显著差异。表5引物GH16不同基因型间屠宰性能质量比较
  3讨论
  目前已经开展了大量畜禽关于GH基因多态方面的研究,结果表明其存在大量的多态位点,以猪GH基因多态性研究成效最为显著。在猪GH基因5′端、编码阅读框和3′端序列中总计26个SNPs,18个在内含子上,6个在外显子2中,1个在外显子3中,1个在外显子4中,某些SNPs对猪生产性能有显著性影响[3-7]。牛GH基因多态性研究主要是分析其对产奶量、乳脂率、乳蛋白的影响程度[8-10]。在禽类上,鸡GH基因在禽类上研究较早[11-15],鸭研究处于相对落后阶段,尚有许多工作需要开展。许盛海等在鸭中检测到了11个点突变,分别为5′调控区序列2个,外显子4序列中1个,内含子2序列中7个,内含子3序列中1个[16-17]。邹剑敏等在GH基因外显子上第3 01位点发现了C-T突变,分析了这个突变点对血浆中低密度脂蛋白(LDL-C)含量具有显著影响[18]。吉文林等在我国6 个地方鸭品种中检测到了GH基因1个C-T突变,位于外显子4中,分析了该突变在不同鸭群中的分布情况[19];伍革民等应用PCR-SSCP技术分析了5个品种鸭GH基因潜在的点突变,检测序列覆盖了5′和3′调控区及部分外显子和内含子,共发现了5个多态位点[20];李慧芳等发现GH基因第4外显子C3701T 的突变对高邮鸭最长连产天数和双黄率有显著相关[21]。
  本试验设计了6对引物,其中引物GH16出现了多态位点,在第1内含子上发现了4个SNP,分别为G945A、T1039G、A1251C和A1322G,形成了3个基因型,分别为AA型、AB型、BB型。2个等位基因的频率较为接近,黑羽番鸭的纯合度为0.502 7,多态信息含量为0.373 6,说明黑羽番鸭该位点上群体呈现中等多态。在杂合度越大、PIC越高的群体中遗传变异的程度就越大,在选育过程中可进行选择的潜力越大;以此类推,在杂合度越小、PIC越低的群体中遗传变异的程度就越小,对群体进行选择的潜力就越小。黑羽番鸭处于中等水平,说明对GH基因该位点还有选择空间。公鸭13周龄BB型的体质量(同宰前活质量)、屠体质量、半净膛质量、全净膛质量显著高于AA型和AB型,3种基因型的胸肌质量与腿肌质量差异不显著;在内脏器官组织中,BB型腹脂质量、心质量显著高于AB型;AA型、AB型、BB型 3种基因型间屠宰指标百分比无显著差异;母鸭所有指标在3种基因型间均无显著差异。畜禽的生产性能是由内在遗传因素和外在环境因素共同作用的结果,不同性别的鸭在其内在因素的影响下,可导致同一基因在性别之间所起作用效果存在差异,导致最终所起作用不同。
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