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摘要：在神经内分泌下丘脑-垂体-肾间组织轴调控中，黑素皮质素受体2（MC2R）与垂体释放的促肾上腺皮质激素结合而激活相应的cAMP信号转导途径，对鱼类的应激反应调控具有重要的作用。本研究通过PCR、RACE技术克隆获得团头鲂MC2R mRNA序列，并通过实时定量PCR分析了团头鲂MC2R组织分布情况及捕捞胁迫后的表达变化。结果显示，获得的MC2R mRNA序列开放阅读框为915 bp，编码304个氨基酸。序列同源性及系统育分析显示，团头鲂MC2R氨基酸序列与鲤科鱼类的MC2R聚为一支，与金鱼（Carassius auratus）MC2R的氨基酸序列同源性最高（87%）。组织分布结果表明，头肾中MC2R的表达量最高，脾脏、精巢和脑中有相对较高的表达量，中肾、肝、肠和肌肉等MC2R的表达量相对较低。经捕捞出水体60 s的急性应激处理后，皮质醇在4 h时显著升高，24 h时表现出下降的趋势；MC2R基因表达量在头肾中变化不显著，然而脾、脑和精巢中MC2R 在4 h时表达量相对于1 h则呈现出显著的下降。通过对团头鲂应激后主要调控因子变化规律的研究，可为鱼类应激后调控措施的实施提供参考依据。
关键词：团头鲂；MC2R基因；皮质醇；克隆；组织表达；应激
中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0020-07
收稿日期：2014-03-11
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS-46-10）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（编号：2013JBFM10）。
作者简介：董晶晶（1989—），女，河南周口人，硕士研究生，主要从事水产动物营养与疾病防控的研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：谢骏，研究员，主要从事池塘微生态学、水产动物的应激机制、细菌性病害生态防控技术的研究。E-mail：[email protected]。团头鲂（Megalobrama amblycephala），又称武昌鱼，隶属于鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鳊亚科（Abramidinae）鲂属（Megalobrama），是中国主要的淡水养殖品种之一。但团头鲂鱼体应激反应强，抗应激能力低下，在拉网卖鱼以及运输过程中鱼体由于应激经常出现“发毛发红”，体表黏液减少或无黏液等现象，有时甚至导致鱼体死亡，严重影响养殖经济效益。鱼类应激反应与其他脊椎动物类似，受下丘脑-垂体-肾间组织轴（HPI）的调控，在应激源刺激后，下丘脑中枢神经系统释放促肾上腺皮质激素释放激素（corticotrophin-releasing hormone，CRH）作用于有促皮质激素细胞分布的垂体前外侧部，由促皮质激素细胞中的阿片-促黑素细胞皮质素原（proopiomelanocortin，POMC）前体肽经加工处理生成促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH），进而调控鱼类重要皮质激素——皮质醇的合成，皮质醇释放到血液中，调节呼吸系统、心血管系统、能量代谢系统等相应组织器官中的反应变化[1-3]。
黑素皮质素受体2（melanocortin 2 receptor，MC2R）是一种具有7个跨膜α螺旋结构的G蛋白偶联受体，在ACTH刺激皮质醇合成分泌的过程中，MC2R与ACTH特异性结合，使得相应的cAMP信号转导途径激活，对脊椎动物皮质醇合成和释放的调控具有重要意义。MC2R在鼠的肾上腺发育以及类固醇合成中发挥着不可替代的作用，鼠MC2R的失活突变，使得高浓度ACTH也不能刺激皮质醇的合成，甚至对ACTH刺激不能产生应答反应[4]。
目前MC2R的激活及其配体结合能力在包括鱼类等多种脊椎动物中得到了广泛的研究[5-8]。研究发现，MC2R是5种黑素皮质素受体（MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R）中最特殊的，主要表现为：（1）其细胞膜表达以及功能的激活均需要黑素皮质素受体2辅助蛋白1型（MRAP1）的协助；（2）MC2R只特异性地与ACTH结合而被激活，不能结合黑素细胞刺激素（MSH）等多肽（α-，β-，γ-and δ-MSH）。
MC2R在鱼类应激中的作用研究相对较少，对于应激源刺激下MC2R的表达变化，以及ACTH或MSH相关肽类的刺激对皮质醇合成释放的影响虽已有部分研究[9-11]，但有机体在应激源刺激后的恢复阶段，机体调控使得MC2R表达以及皮质醇水平产生的变化还未见报道。由于鱼类在生长过程中不可避免会受到一定程度的刺激，了解应激后恢复阶段鱼体主要应激调控因子的变化状况，对于帮助鱼体快速恢复正常状态、避免不必要的二次损伤具有重要意义。因此，本研究通过反转录PCR、RACE扩增技术等获得团头鲂MC2R mRNA序列，分析了团头鲂MC2R的组织分布特点，并通过捕捞出水体60 s对团头鲂进行急性应激处理，探究团头鲂MC2R的组织表达以及血清皮质醇水平的变化，以期为团头鲂等鱼类应激后调控措施的实施提供一定的参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
以团头鲂为试验对象，所用团头鲂均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉基地提供，鱼体健康，体表无伤痕，形态正常、无畸形，游动能力强。
1.2试验设计
组织分布试验所用组织分别取自12条团头鲂，雌、雄各6条，体重（55.9±2.4） g，体长（15.4±0.1） cm，取表皮、肌肉、肠、脾、肝、中肾、头肾、鳃、心脏、脑、眼、精巢和卵巢等13种组织。采样前均采用终浓度为150 mg/L的MS-222在缸中对鱼体直接进行深度麻醉，快速解剖采取相应组织。
捕捞胁迫试验共取64条鱼，体质量（57.4±1.6） g，体长（15.3±0.2） cm，共分为4个组，每组2个缸，每缸8条鱼，于玻璃缸中适应2周后进行试验，处理条件为将鱼迅速捕捞至网内，并捞出水面60 s后放回水中，分别在胁迫前（设为 0 h）及捕捞胁迫后静置（恢复阶段）1、4、24 h采样，采样前采用终浓度为150 mg/L的MS-222在缸中对鱼体直接进行深度麻醉，快速尾静脉采血，并依据组织分布试验结果，采取MC2R主要表达组织头肾、脾、脑和精巢。 1.3血清制备及血清皮质醇的测定
采集到的血液立即10 000 r/min 4 ℃ 离心5 min，收集血清于-20 ℃保存备用。血清皮质醇的测定采用化学发光免疫竞争法，在MAGLUMI 1000全自动化学发光免疫分析仪上进行检测，试剂盒购自深圳新产业生物医学工程有限公司。
1.4组织样品的准备与总RNA提取
组织各0.05 ～ 0.1 g，用生理盐水冲洗后加入1 mL RNAiso Plus（TaKaRa，Japan），立即用高通量组织破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）充分匀浆后使用，或冻存于 -80 ℃ 冰箱中备用。RNA的提取按照试剂的操作说明进行，采用分光光度法和1%琼脂糖凝胶检测RNA条带质量，取D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之间的样品。cDNA第一链反转录合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，Japan），并按照使用说明处理RNA去除基因组DNA，以40 mg/L RNA的终浓度逆转录合成cDNA，获得的cDNA于-20 ℃保存备用。
1.5团头鲂MC2R mRNA的克隆
1.5.1引物设计与合成团头鲂MC2R mRNA全长克隆及实时荧光定量PCR所用引物均列于表1。内参基因β-actin引物序列参照Ming等[12]，RPⅡ引物序列参照Zhao等[13]，其他引物设计采用Primer 5.0，所有引物的合成及序列测定均由上海生工生物工程技术服务公司完成。表1团头鲂MC2R mRNA克隆以及实时定量PCR所用引物
引物序列（5′-3′）用途P1F：GTACTGSTTYATCTGYARCCTGG；R：AASAGHGANCGGTARCAYTCRCA扩增MC2R保守中间片段P21：GGCTATGGCGAGAATG；2：AAAAGGGCCACGGGAGTTCAG；3：GACGTCTTCTAATGCCTTGGARACE扩增MC2R 5′端P31：TCACAGCTCTGCTCCTGATCCTCTTGC；2-1：ACGATGGACTCCAGTCCGGCC；Tail-PCR扩增MC2R 3′端2-2：TTGATTGGAGTGTTTGTGGCCTGCTGG；2-3：CCTGCTGGGCTCCTTTCTTATTTCATCTMC2RF：ATGACAATGCGTCGTGTAGTGG；R：ATCCTGTTGGCGTGGTGGCReal-Time PCR扩增MC2Rβ-actinF：TCGTCCACCGCAAATGCTTCTA；R：CCGTCACCTTCACCGTTCCAGTReal-Time PCR扩增β-actinRPⅡF：CGCGAGTCATTCCTGTAACATC；R：TGACCCTTCCTCAGCTTTACCAReal-Time PCR扩增RPⅡ注：简并引物代码S=G/C；Y=C/T；R=A/G；H=A/T/C；N=A/T/G/C。
1.5.2保守中间片段的扩增通过同源序列比对设计兼并引物P1-R和P1-F（表1），以总RNA反转录得到的cDNA为模板，分别PCR扩增获得MC2R的保守中间片段，产物经纯化、连接载体、转化后测序。
1.5.3MC2R 3′和5′端的扩增根据所获得的部分中间片段，分别设计引物（表1）扩增3′和5′端序列。MC2R的5′端序列采用Invitrogen公司的5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0试剂盒获得；3′端序列采用Tail PCR 的方法从基因组中获得。产物均经过纯化并测序，序列拼接后，扩增ORF全长并连接到pMD-18T载体测序进行验证。
1.6生物信息学分析
团头鲂MC2R氨基酸序列与其他物种MC2R氨基酸序列的相似性分析以及序列比对均使用ClaustalW 2.0（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）进行在线分析。通过Netphos K 1.0预测团头鲂MC2R的蛋白激酶磷酸化位点（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/），通过Netphos K 2.0预测团头鲂MC2R的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化位点（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。在MEGA 4.1中采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树，1 000次自举（Bootstrap）分析计算各节点支持率。根据牛视紫红质（BtaRHO）晶体结构模型[14-15]进行MC2R跨膜结构域（transmembrane domain，TM）的预测。
1.7质粒DNA及标准曲线的构建
含目的基因片段的质粒载体制备如下：以cDNA为模板，用荧光定量PCR引物扩增获得目的片段；PCR程序条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经纯化之后连接到pMD-18T载体并转化到DH5α中构建标曲质粒DNA。标曲采用10倍连续梯度稀释的5个点进行构建，选取的初始稀释组的浓度设为100 000，模板浓度以lg值为横坐标，循环数CT值为纵坐标，每个梯度点设置3个重复，在Microsoft Excel 2007中绘制并计算每个基因扩增的标准曲线方程。
1.8双内参实时定量PCR
根据获得的团头鲂MC2R mRNA序列设计荧光定量特异性引物，双内参基因（RPⅡ和β-actin）及MC2R引物序列在表1中列出。MC2R在团头鲂组织中的表达分布情况，采用SYBG Primix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）Kit（TaKaRa，Japan）按操作说明在ABI 7500 Real Time PCR System上进行。定量PCR体系为20 μL：2 μL cDNA模板、10 μL SYBR green mix、0.4 μL ROX、6.8 μL H2O、引物各0.4 μL。反应程序设置为：第一阶段（50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min），第二阶段（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40次循环），第三阶段溶解曲线分析（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s）。每个待测样本同时进行目的基因MC2R以及内参基因RPⅡ和β-actin的扩增，每次运行定量PCR都分析溶解曲线以确定无非特异性扩增，阴性对照为2 μL灭菌双蒸水，为保证混合均匀、减少加样误差，每个样品均设置3次重复。 1.9数据处理
双内参荧光定量结果处理方法参照Vandesompele等[16]，采用2个内参基因几何平均值进行标准化，并采用双标准曲线法分析MC2R的表达量。得到的数据在SPSS 18.0软件中采用One-way ANOVA分析团头鲂MC2R在不同组织中的表达分布、捕捞胁迫后组织的表达变化以及血清皮质醇水平的变化，显著性检验水平设置为P<0.05。
2结果与分析
2.1团头鲂MC2R mRNA序列
通过简并引物扩增获得618 bp的MC2R基因中间片段，与其他物种MC2R具有很高的同源性；通过5′ RACE-PCR和3′ Tail-PCR扩增，分别获得长度为491 bp和1617 bp的扩增片段，序列拼接获得全长2 495 bp的片段，含有1个 915 bp 的开放阅读框，编码304个氨基酸（图1，MC2R基因登录号为KF962964），预测分子量大小为33.90 ku，pH值为7.0时的理论等电点为8.35；氨基酸组成中，强碱性氨基酸（K、R）21个，强酸性氨基酸（D、E）16个，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）152个，极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）70个。
2.2团头鲂MC2R的分子特征
ClaustalW分析发现，获得的团头鲂MC2R基因编码的氨基酸序列与已报道的其他脊椎动物MC2R序列具有较高的同源性。其中团头鲂MC2R与斑马鱼（Danio rerio）MC2R、鲤（Cyprinus carpio）MC2R、金鱼MC2R氨基酸序列的同源性分别高达85%、83%和87%，与人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、鼠（Mus musculus）、鸡（Gallus gallus）等MC2R氨基酸序列的同源性仅50%左右（表2）。与其他鱼类、四肢类的全长氨基酸序列进一步的系统进化分析结果（图2）表明，硬骨鱼类MC2R聚为一大支，团头鲂MC2R与鲤科鱼类聚为一支，并与鲤MC2R的进化距离最近。
与其他MCRs相类似，都具有短的EL和IL，使得MCRs成为最小的G蛋白偶联受体，对团头鲂MC2R与其他鱼类、四肢类MC2R不同结构区域的同源性分析发现，它们的不同结构区域同源性具有不均衡分布的特征。由图3序列比对统计的同源性比例表明，团头鲂MC2R与其他鱼类及四肢类MC2R在TM2、TM3、TM6和TM7区的平均同源性分别为
表2团头鲂MC2R与其他来源物种氨基酸序列同源性比较
简称种名基因
登录号与团头鲂
同源性
（%）MamMC2R团头鲂KF962964100.00HamMC2R人（Homo sapiens）NP_00052050.34BtaMC2R牛（Bos taurus）XP_00589241748.28MmuMC2R鼠（Mus musculus）NP_00125864550.17GgaMC2R鸡（Gallus gallus）NP_00102668648.68DlaMC2R狼鲈（Dicentrarchus labrax）CCA9511060.27VmoMC2R条斑星鲽（Verasper moseri）BAI6659557.91TruMC2R红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）NP_00102793656.61OmyMC2R虹鳟（Oncorhynchus mykiss）NP_00111815262.46DreMC2R斑马鱼（Danio rerio）NP_85130284.87CauMC2R金鱼（Carassius auratus）BAJ8347283.44CcaMC2R鲤（Cyprinus carpio）CAE5384586.51CmiMC2R米氏叶吻银鲛（Callorhinchus milii）FAA0070443.43
61%、66%、68%和76%，同时MC2R在EL3、IL1和IL2区的同源性更高，分别为84%、83%和80%。
团头鲂MC2R具有G蛋白偶联受体视紫红质家族A所共有的保守基序DRY（Asp、Arg、Tyr），以及在多数MCRs中都具有保守性的3个半胱氨酸（Cys232、Cys246、Cys252）（http：//www.gpcr.org/）和大多数MCRs都具有的保守基序PMY（Pro、Met、Try）。团头鲂MC2R的Thr137处为该受体的可能的PKC磷酸化位点，推测分析显示Tyr123，251、Ser32，70，203，214、Thr287为潜在的磷酸化位点。
2.3团头鲂MC2R在不同组织中的表达分析
MC2R的表达量通过实时荧光定量PCR双标曲线法进行测定和分析，目的基因和内参基因的标准曲线数据见表3。
MC2R组织分布的结果显示，MC2R除了在头肾中存在大量的表达外，在其他12种组织中也均有不同程度的表达，脾中MC2R也具有很高的表达量，其次在精巢和脑中的表达量也相对较高，其他组织中的表达量则较微量。
2.4捕捞胁迫后团头鲂皮质醇和MC2R的调控变化
捕捞胁迫后，团头鲂血清皮质醇水平在1 h内迅速升高，在恢复4 h后皮质醇水平仍表现出显著升高的趋势（P<005），在24 h时逐渐恢复至应激前的水平
捕捞胁迫后，1 h时团头鲂头肾、脾、精巢和脑中的MC2R表达量均有微弱的升高但差异不显著，头肾MC2R表达量4 h时虽仍有升高趋势，但差异也不显著；脾、精巢和脑中MC2R的表达变化与头肾MC2R不同，脾、精巢和脑中MC2R表达量在捕捞胁迫后4 h时呈现显著的下降；捕捞胁迫后24 h时4种组织中MC2R的表达量均逐渐恢复（图6）。
3讨论
3.1团头鲂MC2R序列分析
本研究克隆得到的团头鲂MC2R氨基酸序列与其他脊椎动物MC2R氨基酸序列具有较高的同源性，系统进化分析显示，团头鲂MC2R与其他鲤形目鱼类，如斑马鱼、鲤和金鱼等聚为一支，与传统的物种进化地位基本一致。 Hoffmann 等认为，GPCRs位于细胞膜表面的N端区域、胞外环，跨膜结构在膜表面形成亲水性腔的部分氨基酸残基，以及GPCR与膜结合区域暴露于胞外的部分氨基酸残基都可能参与GPCR与其配体的结合[17]。然而由于目前缺乏MCRs的晶体结构的构造模型，阻碍了MCRs具体配体结合位点的研究。基于视紫红质类GPCRs具有相同的激活机制，本研究采用已知的牛视紫红质晶体结构模型预测了团头鲂MC2R的跨膜结构域[14-15]，结果显示，团头鲂MC2R与狼鲈（Dicentrarchus labrax）[10]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[11]等MC2R的氨基酸结构类似，跨膜区TM2、TM3、TM6、TM7以及EL3、IL1、IL2等区域均表现出很高的同源性。而TM2、TM3、TM6和TM7区域被认为是MCRs与其配体MSH肽类结合的主要区域[18-19]。但是哺乳类[5]以及虹鳟[11]等鱼类的MC2R被证实
表3荧光定量PCR各基因标准曲线信息
基因标准曲线方程回归系数
（r2）扩增效率
（%）MC2Ry=-3.391x+34.0690.999 697.22RPⅡy=-3.259x+33.6470.998 6102.49β-actiny=-3.521x+31.4350.999 992.30注：x为相对浓度的lg值，y为荧光定量PCR获得的CT值。
不能与MSH肽类结合来调节皮质醇的合成，这些区域在结合ACTH上的特点还有待考证。鉴于EL3较各TM区域同源性较高，我们推测EL3可能在MC2R与ACTH的结合上发挥着更重要的作用。然而随着低等脊椎动物MC2R被克隆，研究者发现软骨鱼类米氏叶吻银鲛（Callorhinchus milii）[20]MC2R虽然也与团头鲂等鱼类跨膜区具有高度的同源性，但是米氏叶吻银鲛MC2R不需要MRAP1协助便能在细胞膜表面表
达，同时与ACTH或MSH等肽类结合均能使MC2R激活。综上，MC2R复杂的配体结合能力，其配体结合位点的研究有待补充。
3.2MC2R在团头鲂不同组织中的表达
本研究表明MC2R在头肾中表达量最高，这与头肾是ACTH作用的主要区域，并且含有大量的皮质素细胞相关。除在头肾中大量表达外，团头鲂脾中MC2R的表达量仅略低于头肾。与本研究结果类似，在对狼鲈[10]的研究中发现，除头肾外，其脾中也检测到了表达量可观的MC2R。由于头肾和脾中存在大量的巨噬细胞，而且多项研究证实应激对多种鱼类免疫相关基因均能产生影响[21-22]，因此MC2R在团头鲂头肾和脾脏中大量共表达，表明团头鲂体内的应激调节进一步印证了Agulleiro等[10]的推测，MC2R的激活在调节肾间组织合成释放皮质醇的同时，可通过内分泌途径使得应激对免疫应答产生影响。
有研究表明，ACTH在斑马鱼促性腺激素刺激卵泡细胞释放雌二醇的过程中具有一定的调控作用[23]。而且在虹鳟MC2R分布的研究中，精巢与卵巢中均检测到大量表达的MC2R，而本研究中发现精巢中MC2R具有很高的表达量，约为卵巢的3倍，卵巢中MC2R的表达量较少，条斑星鲽（Verasper moseri）[9]腺MC2R具有与本研究结果类似的表达比例。这些研究的发现使得我们推测，鱼类ACTH可能通过MC2R的激活通路调控性腺功能，MC2R在鱼类性腺中的作用及其具体机制还有待探讨。
虽然MC2R在四肢类的脑中未见明显表达[24-26]，但是与本研究结果类似，一些鱼类包括虹鳟[11]和条斑星鲽，它们的脑组织中存在大量表达的MC2R，这可能是MC2R参与神经中枢对应激源刺激的应答，调控皮质醇的释放。
3.3捕捞胁迫对团头鲂MC2R表达的影响
如图6所示，本试验捕捞胁迫60 s对团头鲂恢复期内头肾MC2R的表达无显著影响。而有研究表明[11]，急性捕捞应激5 min后恢复1 h时，虹鳟血清ACTH显著升高，肾间组织MC2R则表现出一定的延迟性，在恢复4 h时MC2R才表现出显著的升高。本研究未能测得ACTH的表达变化，然而本研究对团头鲂仅应激了60 s，可能由于时间过短，对团头鲂机体MC2R转录水平未能造成显著影响，但使得MC2R表达有持续升高的趋势，MC2R表达的上调调控了下游皮质醇水平的显著变化。
在捕捞应激恢复4 h后皮质醇水平经较缓慢的增长达到最高，这与红鲷[27]捕捞应激2 h时皮质醇仍有升高类似。此时团头鲂血清皮质醇水平处于最大值，但除头肾外，脑、脾和性腺的MC2R表达量均出现显著的下降。其可能原因是在应激后1 h内，团头鲂由于应激源刺激，各组织MC2R表达量有一定的上调（图6），但应激强度不足以造成MC2R表达量产生显著的变化；同时MC2R的上调促进皮质醇的合成，并能造成血清皮质醇水平显著升高。鱼类与哺乳动物类似，皮质醇可以通过负反馈作用刺激下丘脑，降低HPI轴的活性[28]。该捕捞胁迫虽不能显著提高MC2R表达量，但1～4 h时头肾MC2R表达量的上调，造成团头鲂皮质醇水平的持续升高，在4 h时达到最高，但由于存在负反馈调控系统，在皮质醇升高到一定程度便能通过负反馈作用于下丘脑，首先使得脾、脑和性腺MC2R的表达水平显著降低，调节免疫系统、中枢系统以及生殖系统恢复应激前的状态。由于机体应激后的调控十分复杂，涉及到神经、内分泌以及免疫等一系列活动，同时不同鱼类对应激的反应强度也各有不同，因此，还需更多的研究以揭示应激中各调控因子的作用机制。
值得注意的是，在4 h时团头鲂皮质醇水平以及MC2R表达水平分别表现为显著上升和显著下降，我们推测此时鱼体各组织可能受皮质醇作用急剧变化的影响，鱼体在此阶段机体代谢可能处于最脆弱的阶段，受外界因素干扰后极易对机体造成损伤，建议在养殖实践中，拉网后应尽量保证鱼体在此阶段内不受干扰，以免对鱼体造成危害。
关键词：团头鲂；MC2R基因；皮质醇；克隆；组织表达；应激
中图分类号： S917文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0020-07
收稿日期：2014-03-11
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金（编号：CARS-46-10）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（编号：2013JBFM10）。
作者简介：董晶晶（1989—），女，河南周口人，硕士研究生，主要从事水产动物营养与疾病防控的研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：谢骏，研究员，主要从事池塘微生态学、水产动物的应激机制、细菌性病害生态防控技术的研究。E-mail：[email protected]。团头鲂（Megalobrama amblycephala），又称武昌鱼，隶属于鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鳊亚科（Abramidinae）鲂属（Megalobrama），是中国主要的淡水养殖品种之一。但团头鲂鱼体应激反应强，抗应激能力低下，在拉网卖鱼以及运输过程中鱼体由于应激经常出现“发毛发红”，体表黏液减少或无黏液等现象，有时甚至导致鱼体死亡，严重影响养殖经济效益。鱼类应激反应与其他脊椎动物类似，受下丘脑-垂体-肾间组织轴（HPI）的调控，在应激源刺激后，下丘脑中枢神经系统释放促肾上腺皮质激素释放激素（corticotrophin-releasing hormone，CRH）作用于有促皮质激素细胞分布的垂体前外侧部，由促皮质激素细胞中的阿片-促黑素细胞皮质素原（proopiomelanocortin，POMC）前体肽经加工处理生成促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH），进而调控鱼类重要皮质激素——皮质醇的合成，皮质醇释放到血液中，调节呼吸系统、心血管系统、能量代谢系统等相应组织器官中的反应变化[1-3]。
黑素皮质素受体2（melanocortin 2 receptor，MC2R）是一种具有7个跨膜α螺旋结构的G蛋白偶联受体，在ACTH刺激皮质醇合成分泌的过程中，MC2R与ACTH特异性结合，使得相应的cAMP信号转导途径激活，对脊椎动物皮质醇合成和释放的调控具有重要意义。MC2R在鼠的肾上腺发育以及类固醇合成中发挥着不可替代的作用，鼠MC2R的失活突变，使得高浓度ACTH也不能刺激皮质醇的合成，甚至对ACTH刺激不能产生应答反应[4]。
目前MC2R的激活及其配体结合能力在包括鱼类等多种脊椎动物中得到了广泛的研究[5-8]。研究发现，MC2R是5种黑素皮质素受体（MC1R、MC2R、MC3R、MC4R和MC5R）中最特殊的，主要表现为：（1）其细胞膜表达以及功能的激活均需要黑素皮质素受体2辅助蛋白1型（MRAP1）的协助；（2）MC2R只特异性地与ACTH结合而被激活，不能结合黑素细胞刺激素（MSH）等多肽（α-，β-，γ-and δ-MSH）。
MC2R在鱼类应激中的作用研究相对较少，对于应激源刺激下MC2R的表达变化，以及ACTH或MSH相关肽类的刺激对皮质醇合成释放的影响虽已有部分研究[9-11]，但有机体在应激源刺激后的恢复阶段，机体调控使得MC2R表达以及皮质醇水平产生的变化还未见报道。由于鱼类在生长过程中不可避免会受到一定程度的刺激，了解应激后恢复阶段鱼体主要应激调控因子的变化状况，对于帮助鱼体快速恢复正常状态、避免不必要的二次损伤具有重要意义。因此，本研究通过反转录PCR、RACE扩增技术等获得团头鲂MC2R mRNA序列，分析了团头鲂MC2R的组织分布特点，并通过捕捞出水体60 s对团头鲂进行急性应激处理，探究团头鲂MC2R的组织表达以及血清皮质醇水平的变化，以期为团头鲂等鱼类应激后调控措施的实施提供一定的参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
以团头鲂为试验对象，所用团头鲂均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉基地提供，鱼体健康，体表无伤痕，形态正常、无畸形，游动能力强。
1.2试验设计
组织分布试验所用组织分别取自12条团头鲂，雌、雄各6条，体重（55.9±2.4） g，体长（15.4±0.1） cm，取表皮、肌肉、肠、脾、肝、中肾、头肾、鳃、心脏、脑、眼、精巢和卵巢等13种组织。采样前均采用终浓度为150 mg/L的MS-222在缸中对鱼体直接进行深度麻醉，快速解剖采取相应组织。
捕捞胁迫试验共取64条鱼，体质量（57.4±1.6） g，体长（15.3±0.2） cm，共分为4个组，每组2个缸，每缸8条鱼，于玻璃缸中适应2周后进行试验，处理条件为将鱼迅速捕捞至网内，并捞出水面60 s后放回水中，分别在胁迫前（设为 0 h）及捕捞胁迫后静置（恢复阶段）1、4、24 h采样，采样前采用终浓度为150 mg/L的MS-222在缸中对鱼体直接进行深度麻醉，快速尾静脉采血，并依据组织分布试验结果，采取MC2R主要表达组织头肾、脾、脑和精巢。 1.3血清制备及血清皮质醇的测定
采集到的血液立即10 000 r/min 4 ℃ 离心5 min，收集血清于-20 ℃保存备用。血清皮质醇的测定采用化学发光免疫竞争法，在MAGLUMI 1000全自动化学发光免疫分析仪上进行检测，试剂盒购自深圳新产业生物医学工程有限公司。
1.4组织样品的准备与总RNA提取
组织各0.05 ～ 0.1 g，用生理盐水冲洗后加入1 mL RNAiso Plus（TaKaRa，Japan），立即用高通量组织破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）充分匀浆后使用，或冻存于 -80 ℃ 冰箱中备用。RNA的提取按照试剂的操作说明进行，采用分光光度法和1%琼脂糖凝胶检测RNA条带质量，取D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之间的样品。cDNA第一链反转录合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，Japan），并按照使用说明处理RNA去除基因组DNA，以40 mg/L RNA的终浓度逆转录合成cDNA，获得的cDNA于-20 ℃保存备用。
1.5团头鲂MC2R mRNA的克隆
1.5.1引物设计与合成团头鲂MC2R mRNA全长克隆及实时荧光定量PCR所用引物均列于表1。内参基因β-actin引物序列参照Ming等[12]，RPⅡ引物序列参照Zhao等[13]，其他引物设计采用Primer 5.0，所有引物的合成及序列测定均由上海生工生物工程技术服务公司完成。表1团头鲂MC2R mRNA克隆以及实时定量PCR所用引物
引物序列（5′-3′）用途P1F：GTACTGSTTYATCTGYARCCTGG；R：AASAGHGANCGGTARCAYTCRCA扩增MC2R保守中间片段P21：GGCTATGGCGAGAATG；2：AAAAGGGCCACGGGAGTTCAG；3：GACGTCTTCTAATGCCTTGGARACE扩增MC2R 5′端P31：TCACAGCTCTGCTCCTGATCCTCTTGC；2-1：ACGATGGACTCCAGTCCGGCC；Tail-PCR扩增MC2R 3′端2-2：TTGATTGGAGTGTTTGTGGCCTGCTGG；2-3：CCTGCTGGGCTCCTTTCTTATTTCATCTMC2RF：ATGACAATGCGTCGTGTAGTGG；R：ATCCTGTTGGCGTGGTGGCReal-Time PCR扩增MC2Rβ-actinF：TCGTCCACCGCAAATGCTTCTA；R：CCGTCACCTTCACCGTTCCAGTReal-Time PCR扩增β-actinRPⅡF：CGCGAGTCATTCCTGTAACATC；R：TGACCCTTCCTCAGCTTTACCAReal-Time PCR扩增RPⅡ注：简并引物代码S=G/C；Y=C/T；R=A/G；H=A/T/C；N=A/T/G/C。
1.5.2保守中间片段的扩增通过同源序列比对设计兼并引物P1-R和P1-F（表1），以总RNA反转录得到的cDNA为模板，分别PCR扩增获得MC2R的保守中间片段，产物经纯化、连接载体、转化后测序。
1.5.3MC2R 3′和5′端的扩增根据所获得的部分中间片段，分别设计引物（表1）扩增3′和5′端序列。MC2R的5′端序列采用Invitrogen公司的5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0试剂盒获得；3′端序列采用Tail PCR 的方法从基因组中获得。产物均经过纯化并测序，序列拼接后，扩增ORF全长并连接到pMD-18T载体测序进行验证。
1.6生物信息学分析
团头鲂MC2R氨基酸序列与其他物种MC2R氨基酸序列的相似性分析以及序列比对均使用ClaustalW 2.0（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）进行在线分析。通过Netphos K 1.0预测团头鲂MC2R的蛋白激酶磷酸化位点（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/），通过Netphos K 2.0预测团头鲂MC2R的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化位点（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）。在MEGA 4.1中采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树，1 000次自举（Bootstrap）分析计算各节点支持率。根据牛视紫红质（BtaRHO）晶体结构模型[14-15]进行MC2R跨膜结构域（transmembrane domain，TM）的预测。
1.7质粒DNA及标准曲线的构建
含目的基因片段的质粒载体制备如下：以cDNA为模板，用荧光定量PCR引物扩增获得目的片段；PCR程序条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经纯化之后连接到pMD-18T载体并转化到DH5α中构建标曲质粒DNA。标曲采用10倍连续梯度稀释的5个点进行构建，选取的初始稀释组的浓度设为100 000，模板浓度以lg值为横坐标，循环数CT值为纵坐标，每个梯度点设置3个重复，在Microsoft Excel 2007中绘制并计算每个基因扩增的标准曲线方程。
1.8双内参实时定量PCR
根据获得的团头鲂MC2R mRNA序列设计荧光定量特异性引物，双内参基因（RPⅡ和β-actin）及MC2R引物序列在表1中列出。MC2R在团头鲂组织中的表达分布情况，采用SYBG Primix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）Kit（TaKaRa，Japan）按操作说明在ABI 7500 Real Time PCR System上进行。定量PCR体系为20 μL：2 μL cDNA模板、10 μL SYBR green mix、0.4 μL ROX、6.8 μL H2O、引物各0.4 μL。反应程序设置为：第一阶段（50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min），第二阶段（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40次循环），第三阶段溶解曲线分析（95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s）。每个待测样本同时进行目的基因MC2R以及内参基因RPⅡ和β-actin的扩增，每次运行定量PCR都分析溶解曲线以确定无非特异性扩增，阴性对照为2 μL灭菌双蒸水，为保证混合均匀、减少加样误差，每个样品均设置3次重复。 1.9数据处理
双内参荧光定量结果处理方法参照Vandesompele等[16]，采用2个内参基因几何平均值进行标准化，并采用双标准曲线法分析MC2R的表达量。得到的数据在SPSS 18.0软件中采用One-way ANOVA分析团头鲂MC2R在不同组织中的表达分布、捕捞胁迫后组织的表达变化以及血清皮质醇水平的变化，显著性检验水平设置为P<0.05。
2结果与分析
2.1团头鲂MC2R mRNA序列
通过简并引物扩增获得618 bp的MC2R基因中间片段，与其他物种MC2R具有很高的同源性；通过5′ RACE-PCR和3′ Tail-PCR扩增，分别获得长度为491 bp和1617 bp的扩增片段，序列拼接获得全长2 495 bp的片段，含有1个 915 bp 的开放阅读框，编码304个氨基酸（图1，MC2R基因登录号为KF962964），预测分子量大小为33.90 ku，pH值为7.0时的理论等电点为8.35；氨基酸组成中，强碱性氨基酸（K、R）21个，强酸性氨基酸（D、E）16个，疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）152个，极性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）70个。
2.2团头鲂MC2R的分子特征
ClaustalW分析发现，获得的团头鲂MC2R基因编码的氨基酸序列与已报道的其他脊椎动物MC2R序列具有较高的同源性。其中团头鲂MC2R与斑马鱼（Danio rerio）MC2R、鲤（Cyprinus carpio）MC2R、金鱼MC2R氨基酸序列的同源性分别高达85%、83%和87%，与人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、鼠（Mus musculus）、鸡（Gallus gallus）等MC2R氨基酸序列的同源性仅50%左右（表2）。与其他鱼类、四肢类的全长氨基酸序列进一步的系统进化分析结果（图2）表明，硬骨鱼类MC2R聚为一大支，团头鲂MC2R与鲤科鱼类聚为一支，并与鲤MC2R的进化距离最近。
与其他MCRs相类似，都具有短的EL和IL，使得MCRs成为最小的G蛋白偶联受体，对团头鲂MC2R与其他鱼类、四肢类MC2R不同结构区域的同源性分析发现，它们的不同结构区域同源性具有不均衡分布的特征。由图3序列比对统计的同源性比例表明，团头鲂MC2R与其他鱼类及四肢类MC2R在TM2、TM3、TM6和TM7区的平均同源性分别为
表2团头鲂MC2R与其他来源物种氨基酸序列同源性比较
简称种名基因
登录号与团头鲂
同源性
（%）MamMC2R团头鲂KF962964100.00HamMC2R人（Homo sapiens）NP_00052050.34BtaMC2R牛（Bos taurus）XP_00589241748.28MmuMC2R鼠（Mus musculus）NP_00125864550.17GgaMC2R鸡（Gallus gallus）NP_00102668648.68DlaMC2R狼鲈（Dicentrarchus labrax）CCA9511060.27VmoMC2R条斑星鲽（Verasper moseri）BAI6659557.91TruMC2R红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）NP_00102793656.61OmyMC2R虹鳟（Oncorhynchus mykiss）NP_00111815262.46DreMC2R斑马鱼（Danio rerio）NP_85130284.87CauMC2R金鱼（Carassius auratus）BAJ8347283.44CcaMC2R鲤（Cyprinus carpio）CAE5384586.51CmiMC2R米氏叶吻银鲛（Callorhinchus milii）FAA0070443.43
61%、66%、68%和76%，同时MC2R在EL3、IL1和IL2区的同源性更高，分别为84%、83%和80%。
团头鲂MC2R具有G蛋白偶联受体视紫红质家族A所共有的保守基序DRY（Asp、Arg、Tyr），以及在多数MCRs中都具有保守性的3个半胱氨酸（Cys232、Cys246、Cys252）（http：//www.gpcr.org/）和大多数MCRs都具有的保守基序PMY（Pro、Met、Try）。团头鲂MC2R的Thr137处为该受体的可能的PKC磷酸化位点，推测分析显示Tyr123，251、Ser32，70，203，214、Thr287为潜在的磷酸化位点。
2.3团头鲂MC2R在不同组织中的表达分析
MC2R的表达量通过实时荧光定量PCR双标曲线法进行测定和分析，目的基因和内参基因的标准曲线数据见表3。
MC2R组织分布的结果显示，MC2R除了在头肾中存在大量的表达外，在其他12种组织中也均有不同程度的表达，脾中MC2R也具有很高的表达量，其次在精巢和脑中的表达量也相对较高，其他组织中的表达量则较微量。
2.4捕捞胁迫后团头鲂皮质醇和MC2R的调控变化
捕捞胁迫后，团头鲂血清皮质醇水平在1 h内迅速升高，在恢复4 h后皮质醇水平仍表现出显著升高的趋势（P<005），在24 h时逐渐恢复至应激前的水平
捕捞胁迫后，1 h时团头鲂头肾、脾、精巢和脑中的MC2R表达量均有微弱的升高但差异不显著，头肾MC2R表达量4 h时虽仍有升高趋势，但差异也不显著；脾、精巢和脑中MC2R的表达变化与头肾MC2R不同，脾、精巢和脑中MC2R表达量在捕捞胁迫后4 h时呈现显著的下降；捕捞胁迫后24 h时4种组织中MC2R的表达量均逐渐恢复（图6）。
3讨论
3.1团头鲂MC2R序列分析
本研究克隆得到的团头鲂MC2R氨基酸序列与其他脊椎动物MC2R氨基酸序列具有较高的同源性，系统进化分析显示，团头鲂MC2R与其他鲤形目鱼类，如斑马鱼、鲤和金鱼等聚为一支，与传统的物种进化地位基本一致。 Hoffmann 等认为，GPCRs位于细胞膜表面的N端区域、胞外环，跨膜结构在膜表面形成亲水性腔的部分氨基酸残基，以及GPCR与膜结合区域暴露于胞外的部分氨基酸残基都可能参与GPCR与其配体的结合[17]。然而由于目前缺乏MCRs的晶体结构的构造模型，阻碍了MCRs具体配体结合位点的研究。基于视紫红质类GPCRs具有相同的激活机制，本研究采用已知的牛视紫红质晶体结构模型预测了团头鲂MC2R的跨膜结构域[14-15]，结果显示，团头鲂MC2R与狼鲈（Dicentrarchus labrax）[10]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[11]等MC2R的氨基酸结构类似，跨膜区TM2、TM3、TM6、TM7以及EL3、IL1、IL2等区域均表现出很高的同源性。而TM2、TM3、TM6和TM7区域被认为是MCRs与其配体MSH肽类结合的主要区域[18-19]。但是哺乳类[5]以及虹鳟[11]等鱼类的MC2R被证实
表3荧光定量PCR各基因标准曲线信息
基因标准曲线方程回归系数
（r2）扩增效率
（%）MC2Ry=-3.391x+34.0690.999 697.22RPⅡy=-3.259x+33.6470.998 6102.49β-actiny=-3.521x+31.4350.999 992.30注：x为相对浓度的lg值，y为荧光定量PCR获得的CT值。
不能与MSH肽类结合来调节皮质醇的合成，这些区域在结合ACTH上的特点还有待考证。鉴于EL3较各TM区域同源性较高，我们推测EL3可能在MC2R与ACTH的结合上发挥着更重要的作用。然而随着低等脊椎动物MC2R被克隆，研究者发现软骨鱼类米氏叶吻银鲛（Callorhinchus milii）[20]MC2R虽然也与团头鲂等鱼类跨膜区具有高度的同源性，但是米氏叶吻银鲛MC2R不需要MRAP1协助便能在细胞膜表面表
达，同时与ACTH或MSH等肽类结合均能使MC2R激活。综上，MC2R复杂的配体结合能力，其配体结合位点的研究有待补充。
3.2MC2R在团头鲂不同组织中的表达
本研究表明MC2R在头肾中表达量最高，这与头肾是ACTH作用的主要区域，并且含有大量的皮质素细胞相关。除在头肾中大量表达外，团头鲂脾中MC2R的表达量仅略低于头肾。与本研究结果类似，在对狼鲈[10]的研究中发现，除头肾外，其脾中也检测到了表达量可观的MC2R。由于头肾和脾中存在大量的巨噬细胞，而且多项研究证实应激对多种鱼类免疫相关基因均能产生影响[21-22]，因此MC2R在团头鲂头肾和脾脏中大量共表达，表明团头鲂体内的应激调节进一步印证了Agulleiro等[10]的推测，MC2R的激活在调节肾间组织合成释放皮质醇的同时，可通过内分泌途径使得应激对免疫应答产生影响。
有研究表明，ACTH在斑马鱼促性腺激素刺激卵泡细胞释放雌二醇的过程中具有一定的调控作用[23]。而且在虹鳟MC2R分布的研究中，精巢与卵巢中均检测到大量表达的MC2R，而本研究中发现精巢中MC2R具有很高的表达量，约为卵巢的3倍，卵巢中MC2R的表达量较少，条斑星鲽（Verasper moseri）[9]腺MC2R具有与本研究结果类似的表达比例。这些研究的发现使得我们推测，鱼类ACTH可能通过MC2R的激活通路调控性腺功能，MC2R在鱼类性腺中的作用及其具体机制还有待探讨。
虽然MC2R在四肢类的脑中未见明显表达[24-26]，但是与本研究结果类似，一些鱼类包括虹鳟[11]和条斑星鲽，它们的脑组织中存在大量表达的MC2R，这可能是MC2R参与神经中枢对应激源刺激的应答，调控皮质醇的释放。
3.3捕捞胁迫对团头鲂MC2R表达的影响
如图6所示，本试验捕捞胁迫60 s对团头鲂恢复期内头肾MC2R的表达无显著影响。而有研究表明[11]，急性捕捞应激5 min后恢复1 h时，虹鳟血清ACTH显著升高，肾间组织MC2R则表现出一定的延迟性，在恢复4 h时MC2R才表现出显著的升高。本研究未能测得ACTH的表达变化，然而本研究对团头鲂仅应激了60 s，可能由于时间过短，对团头鲂机体MC2R转录水平未能造成显著影响，但使得MC2R表达有持续升高的趋势，MC2R表达的上调调控了下游皮质醇水平的显著变化。
在捕捞应激恢复4 h后皮质醇水平经较缓慢的增长达到最高，这与红鲷[27]捕捞应激2 h时皮质醇仍有升高类似。此时团头鲂血清皮质醇水平处于最大值，但除头肾外，脑、脾和性腺的MC2R表达量均出现显著的下降。其可能原因是在应激后1 h内，团头鲂由于应激源刺激，各组织MC2R表达量有一定的上调（图6），但应激强度不足以造成MC2R表达量产生显著的变化；同时MC2R的上调促进皮质醇的合成，并能造成血清皮质醇水平显著升高。鱼类与哺乳动物类似，皮质醇可以通过负反馈作用刺激下丘脑，降低HPI轴的活性[28]。该捕捞胁迫虽不能显著提高MC2R表达量，但1～4 h时头肾MC2R表达量的上调，造成团头鲂皮质醇水平的持续升高，在4 h时达到最高，但由于存在负反馈调控系统，在皮质醇升高到一定程度便能通过负反馈作用于下丘脑，首先使得脾、脑和性腺MC2R的表达水平显著降低，调节免疫系统、中枢系统以及生殖系统恢复应激前的状态。由于机体应激后的调控十分复杂，涉及到神经、内分泌以及免疫等一系列活动，同时不同鱼类对应激的反应强度也各有不同，因此，还需更多的研究以揭示应激中各调控因子的作用机制。
值得注意的是，在4 h时团头鲂皮质醇水平以及MC2R表达水平分别表现为显著上升和显著下降，我们推测此时鱼体各组织可能受皮质醇作用急剧变化的影响，鱼体在此阶段机体代谢可能处于最脆弱的阶段，受外界因素干扰后极易对机体造成损伤，建议在养殖实践中，拉网后应尽量保证鱼体在此阶段内不受干扰，以免对鱼体造成危害。