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【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2013）12-0184-01
【摘要】本文探讨了姜黄素（Cur）对人宫颈癌Hela细胞放射增敏的可能作用机制。采用免疫细胞化学法检测细胞处理后P21和Bcl-2蛋白表达情况，结果显示姜黄素和射线单用均能升高P21蛋白表达和降低Bcl-2蛋白的表达（P﹤0.05），二者联用则变化更明显（P﹤0.01）。说明姜黄素对人宫颈癌Hela细胞具有放射增敏作用可能与其上调P21和下调Bcl-2蛋白表达有关。
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，放疗是其主要的治疗手段，但宫颈癌单纯放疗5年生存率只有50%左右，故提高宫颈癌放疗敏感性在临床上有着极其重要的意义。目前临床上放疗增敏剂主要是一些化疗药物，如顺铂、泰素等，但由于这些药物对正常细胞的毒性作用较大，而且其与放疗的毒性作用有协同作用，病人一般难以耐受。姜黄素是从姜黄属植物姜黄、郁金、莪术等植物的根茎中提取出来的多元酚，其对慢性粒细胞白血病有独特的疗效[1]，本课题组前期发现其尚对体外培养的人宫颈癌Hela细胞具有放射增敏作用[2]，但其作用机制不详，本文对此进行了探讨。
1 实验部分
1.1 试验材料 人宫颈癌HeLa细胞（湖北医药学院临床研究所）；姜黄素（HPLC>98%，成都思科华生物技术有限公司，用DMSO溶解配成1mg/mL的母液备用，使用前用10%RPMI1640培养液稀释至所需浓度）；小鼠抗人Bc1-2、P21、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG均为美国Santa Cruz公司产品；Clinac 600C/D加速器（ 美国Varian 公司）。
1.2 细胞培养及照射条件 人宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清RPMI-1640培养基中，并置于含5%CO2的37℃温箱中培养，所有照射均为室温下照射，射线剂量率为40cGy/min。
1.3 免疫细胞化学法检测P21、Bcl-2蛋白 将Hela细胞接种于加有盖玻片的2个6孔板中，分为空白组、As2O3组、单放组、药放组，每个组设3个复孔，待细胞贴壁后姜黄素组和药放组加药， 终浓度2umol/L，给药24小时后单放及药放组接受2Gy放疗，24小时后取出盖破片，以PBS（pH=7.5）冲洗，3min/次，冲洗三次后，放入4%多聚甲醛中固定20min，以PBS （pH=7.5） 冲洗， 3min/次，冲洗三次后，0.1%Triton X-100（ PBS缓冲液中含柠檬酸钠0.1%）
透膜5min，以PBS （pH=7.5）冲洗，3min/次，冲洗三次后， 3%H2O2-甲醇溶液室温孵育10min以封闭内源性过氧化物酶，按免疫试剂盒操作说明逐步进行，一抗工作浓度1：100，DAB室温显色15-20 min（显微镜下控制），自来水冲洗，中性树脂封片，显微摄影计算阳性细胞数。
1.4 统计学方法 所得数据以x±s形式表示，SPSS13.0软件进行单因素方差分析， P<0.05为差别有统计学意义， P<0.01为差别有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白 镜下可见，Bcl-2主要位于细胞质中，少许分布于胞膜中，为粗细不等的棕黄色颗粒，放射及姜黄素均能降低Bcl-2的表达，二者联合效果更明显（P〈0.01），见表1。
3 讨论
姜黄素是植物姜黄中的主要活性成分，具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗血管新生以及抗肿瘤等多种生物学功能。本课题组前期将姜黄素同步放射线照射用于体外观察对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，结果发现，单纯应用姜黄素，细胞增殖抑制率与药物浓度的增加成正比；单纯应用放射线照射，细胞抑制率也随射线剂量的增加而增加，但当辐射剂量达到12Gy时细胞增殖抑制率达到坪台期，不再随射线剂量的加大而增加，在单纯辐射剂量已达到“阈值”的情况下，联用姜黄素可使细胞增殖抑制效果得到进一步的提高，且对细胞增殖的抑制率高于单纯放射组和单纯药物组，说明同步应用姜黄素确实可对宫颈癌细胞放疗产生增效的作用，这与常萍等人观察的顺铂对宫颈癌放疗增敏作用特点相一致[3]。
为进一步探索其作用机制，本研究进一步检测了细胞内p2l和Bcl-2两蛋白的改变，p2l蛋白是细胞周期依赖性激酶抑制蛋白家族成员，其功能主要是通过抑制细胞周期调控因子与细胞周期蛋白形成复合物，从而发挥细胞增殖抑制作用，同时p2l又能抑制增殖细胞核抗原活性，从而直接抑制DNA的合成，有研究表明p2l基因的表达上调与放射敏感性增高密切相关。Bcl-2即B细胞淋巴瘤/白血病-2，是第一个被发现的能抑制多种细胞凋亡的原癌基因，也是最重要的凋亡调节因子之一，可通过调节线粒体的功能来调节凋亡，有文献报道Bcl-2基因的表达下调与放射敏感性增加密切相关[5]。本实验通过免疫细胞化学法检测发现放射及药物均能提高p21表达，下调Bcl-2表达，放射和药物联合作用效果更强。由此可推测，姜黄素放射增敏的机制可能是通过抑制Hela细胞的亚致死性损伤的修复、调整细胞周期的分布、上调p2l蛋白及下调Bcl-2蛋白的表达而实现的。[基金项目]湖北医药学院第三临床学院资助项目（201201）；湖北省十堰市科技局基金资助项目（ZD2012026）
参考文献
[1]饶佳，黄仁魏.姜黄素抗肿瘤作用及机制的研究进展[J].新医学，2011，42（2）： 127-130.
[2]张莉，邓守恒，李芳，等. 姜黄素体外同步放疗对宫颈癌细胞增殖影响的实验研究[J].山西医药杂志，2013，42（4）：369-371.
[3]常萍，刘孜，王娟，等.顺铂对Hela细胞辐射增敏的体外实验观察[J].西安交通大学学报（医学版），2011，32（4）：462-465.
[4]汤继英，潘东风，石小燕，等.三氧化二砷对人宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用[J].郧阳医学院学报，2008，27（2）：109-111.
[5]Satoshi A，Steve G，Kathleen S， et al.Knock-down of Bcl-2 by antisense oligodeoxynucleotides induces radiosensitization and inhibition of angiogenesis in human PC-3 prostate tumor xenografts[J].Mol Cancer Ther ，2007，6（1）：101–11.
【摘要】本文探讨了姜黄素（Cur）对人宫颈癌Hela细胞放射增敏的可能作用机制。采用免疫细胞化学法检测细胞处理后P21和Bcl-2蛋白表达情况，结果显示姜黄素和射线单用均能升高P21蛋白表达和降低Bcl-2蛋白的表达（P﹤0.05），二者联用则变化更明显（P﹤0.01）。说明姜黄素对人宫颈癌Hela细胞具有放射增敏作用可能与其上调P21和下调Bcl-2蛋白表达有关。
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，放疗是其主要的治疗手段，但宫颈癌单纯放疗5年生存率只有50%左右，故提高宫颈癌放疗敏感性在临床上有着极其重要的意义。目前临床上放疗增敏剂主要是一些化疗药物，如顺铂、泰素等，但由于这些药物对正常细胞的毒性作用较大，而且其与放疗的毒性作用有协同作用，病人一般难以耐受。姜黄素是从姜黄属植物姜黄、郁金、莪术等植物的根茎中提取出来的多元酚，其对慢性粒细胞白血病有独特的疗效[1]，本课题组前期发现其尚对体外培养的人宫颈癌Hela细胞具有放射增敏作用[2]，但其作用机制不详，本文对此进行了探讨。
1 实验部分
1.1 试验材料 人宫颈癌HeLa细胞（湖北医药学院临床研究所）；姜黄素（HPLC>98%，成都思科华生物技术有限公司，用DMSO溶解配成1mg/mL的母液备用，使用前用10%RPMI1640培养液稀释至所需浓度）；小鼠抗人Bc1-2、P21、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG均为美国Santa Cruz公司产品；Clinac 600C/D加速器（ 美国Varian 公司）。
1.2 细胞培养及照射条件 人宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清RPMI-1640培养基中，并置于含5%CO2的37℃温箱中培养，所有照射均为室温下照射，射线剂量率为40cGy/min。
1.3 免疫细胞化学法检测P21、Bcl-2蛋白 将Hela细胞接种于加有盖玻片的2个6孔板中，分为空白组、As2O3组、单放组、药放组，每个组设3个复孔，待细胞贴壁后姜黄素组和药放组加药， 终浓度2umol/L，给药24小时后单放及药放组接受2Gy放疗，24小时后取出盖破片，以PBS（pH=7.5）冲洗，3min/次，冲洗三次后，放入4%多聚甲醛中固定20min，以PBS （pH=7.5） 冲洗， 3min/次，冲洗三次后，0.1%Triton X-100（ PBS缓冲液中含柠檬酸钠0.1%）
透膜5min，以PBS （pH=7.5）冲洗，3min/次，冲洗三次后， 3%H2O2-甲醇溶液室温孵育10min以封闭内源性过氧化物酶，按免疫试剂盒操作说明逐步进行，一抗工作浓度1：100，DAB室温显色15-20 min（显微镜下控制），自来水冲洗，中性树脂封片，显微摄影计算阳性细胞数。
1.4 统计学方法 所得数据以x±s形式表示，SPSS13.0软件进行单因素方差分析， P<0.05为差别有统计学意义， P<0.01为差别有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白 镜下可见，Bcl-2主要位于细胞质中，少许分布于胞膜中，为粗细不等的棕黄色颗粒，放射及姜黄素均能降低Bcl-2的表达，二者联合效果更明显（P〈0.01），见表1。
3 讨论
姜黄素是植物姜黄中的主要活性成分，具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗血管新生以及抗肿瘤等多种生物学功能。本课题组前期将姜黄素同步放射线照射用于体外观察对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，结果发现，单纯应用姜黄素，细胞增殖抑制率与药物浓度的增加成正比；单纯应用放射线照射，细胞抑制率也随射线剂量的增加而增加，但当辐射剂量达到12Gy时细胞增殖抑制率达到坪台期，不再随射线剂量的加大而增加，在单纯辐射剂量已达到“阈值”的情况下，联用姜黄素可使细胞增殖抑制效果得到进一步的提高，且对细胞增殖的抑制率高于单纯放射组和单纯药物组，说明同步应用姜黄素确实可对宫颈癌细胞放疗产生增效的作用，这与常萍等人观察的顺铂对宫颈癌放疗增敏作用特点相一致[3]。
为进一步探索其作用机制，本研究进一步检测了细胞内p2l和Bcl-2两蛋白的改变，p2l蛋白是细胞周期依赖性激酶抑制蛋白家族成员，其功能主要是通过抑制细胞周期调控因子与细胞周期蛋白形成复合物，从而发挥细胞增殖抑制作用，同时p2l又能抑制增殖细胞核抗原活性，从而直接抑制DNA的合成，有研究表明p2l基因的表达上调与放射敏感性增高密切相关。Bcl-2即B细胞淋巴瘤/白血病-2，是第一个被发现的能抑制多种细胞凋亡的原癌基因，也是最重要的凋亡调节因子之一，可通过调节线粒体的功能来调节凋亡，有文献报道Bcl-2基因的表达下调与放射敏感性增加密切相关[5]。本实验通过免疫细胞化学法检测发现放射及药物均能提高p21表达，下调Bcl-2表达，放射和药物联合作用效果更强。由此可推测，姜黄素放射增敏的机制可能是通过抑制Hela细胞的亚致死性损伤的修复、调整细胞周期的分布、上调p2l蛋白及下调Bcl-2蛋白的表达而实现的。[基金项目]湖北医药学院第三临床学院资助项目（201201）；湖北省十堰市科技局基金资助项目（ZD2012026）
参考文献
[1]饶佳，黄仁魏.姜黄素抗肿瘤作用及机制的研究进展[J].新医学，2011，42（2）： 127-130.
[2]张莉，邓守恒，李芳，等. 姜黄素体外同步放疗对宫颈癌细胞增殖影响的实验研究[J].山西医药杂志，2013，42（4）：369-371.
[3]常萍，刘孜，王娟，等.顺铂对Hela细胞辐射增敏的体外实验观察[J].西安交通大学学报（医学版），2011，32（4）：462-465.
[4]汤继英，潘东风，石小燕，等.三氧化二砷对人宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用[J].郧阳医学院学报，2008，27（2）：109-111.
[5]Satoshi A，Steve G，Kathleen S， et al.Knock-down of Bcl-2 by antisense oligodeoxynucleotides induces radiosensitization and inhibition of angiogenesis in human PC-3 prostate tumor xenografts[J].Mol Cancer Ther ，2007，6（1）：101–11.