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摘要[目的] 优化松茸浓缩口服液制备过程中碱性蛋白的提取工艺。 [方法]以新鲜松茸为原料，利用超声波辅助水提、弱碱盐溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的营养物质，制备成了松茸浓缩口服液；并以弱碱盐溶液提取松茸碱性蛋白，对影响因素碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提取时间、提取温进行了正交试验分析，确定最佳工艺。 [结果]试验确定了弱碱盐溶液提取松茸碱性蛋白的最佳工艺为：碳酸氢钠浓度0.3%，氯化钠浓度0.5%，提取时间150 min，提取温度80 ℃；此条件下碱性蛋白质的得率为1.16%。[结论] 试验打破了松茸在传统口服液中利用率低的局限性，通过改变提取方式，增加了松茸浓缩液的提取率，大大提高了松茸的利用价值与经济效益。
关键词松茸；提取方法；碱性蛋白
中图分类号S646.1+5文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-267-03
松茸[Tricholoma matsutake（S.Ito et Imai）Sing]，又名松口蘑，与温带和寒温带的松林与栎林共生生长，为共生菌[1]。野生松茸的生长环境极为苛刻，需要依赖柏树、橡树等阔叶林为其生长发育提供营养支持，只有这样才能形成健康的子实体[2-3]。松茸含有丰富的氨基酸、维生素和脂肪及丰富的膳食纤维和多种活性酶，另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多糖、松茸多肽和松茸醇[4-5]。松茸有很多保健功能，如提高免疫力、抗癌抗肿瘤、治疗糖尿病及心血管疾病、抗衰老养颜和促肠胃保肝脏等多种功效[6-8]。笔者以新鲜松茸为原料，利用超声波辅助水提、弱碱盐溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的营养物质，并制备成了松茸浓缩口服液。试验打破了松茸在传统口服液中利用率低的局限性，通过改变提取方式，增加了松茸浓缩液的提取率，并结合口服液使用简单、方便，便于保藏等优势，大大提高了松茸的利用价值与经济效益。其中以弱碱盐溶液提取松茸碱性蛋白，在试验中对碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提取时间、提取温度4个因素进行正交试验和分析，确定最佳工艺。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试原料。试验所需松茸来源于黑龙江省牡丹江市东宁县。
1.1.2主要试剂。柠檬酸、正丁醇、肉豆蔻酯、EDTA、柠檬酸钠、纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、碳酸钠、氯化钠、95%乙醇、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、草酸、维生素C、偏磷酸、醋酸、氯酸铵、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、磷酸、没食子酸、福林酚、熊果酸、香草醛、冰醋酸、高氯酸等试剂，均为国产分析纯。
1.1.3主要仪器与设备。试验所用主要仪器设备见表1。
表1主要试验仪器
仪器生产厂家型号岛津紫外分光光度计日本岛津公司UV2550电热鼓风干燥箱天津市通利信达仪器厂1013A数控恒温水浴锅上海申胜生物科技有限公司W201高速离心机北京医用离心机厂LD152A分析天平梅特勒·托利多仪器上海有限公司AB104N飞利浦粉碎机飞利浦（珠海）有限公司HR2003
1.2试验方法
1.2.1原材料预处理。选择新鲜、无病残、无虫蛀的松茸，于清水中洗净，沥水。将松茸子实体进行切片处理；用电子天平称量重量，加入20倍体积无菌蒸馏水，将切片后的松茸减压浸渍在含有0.03%的柠檬酸、0.02%正丁醇与0.02%肉豆蔻酯的混合溶液中，减压浸渍10 min。加入0.02%EDTA、0.2%柠檬酸钠，用组织捣碎器将组织破坏。加入纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶，按6.8 g/L加入，3种酶的比例为1∶1∶1.4。
1.2.2弱碱盐溶液提取工艺。
1.2.2.1弱碱盐溶液提取工艺的优化。为了得到松茸中的碱溶性成分，将超声波辅助水提取后的残渣用碳酸氢钠与氯化钠混合溶液进行提取，以碱性蛋白质的得率为检测指标确定最佳工艺。
以碱性蛋白质的提取率为检测指标，称取超声波辅助水提取后的残渣50 g，分别改变提取条件（碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提取时间、提取温度）4个因素，考察各因素对总提取率的影响，各因素水平设置如下：碳酸氢钠浓度：0.1%、02%、0.3%、0.4%、0.5%；氯化钠浓度：0.5%、1.0%、15%、2.0%、2.5%；提取时间：30、60、90、120、150 min；提取温度：50、60、70、80、90 ℃。
在上述单因素试验的基础上，运用L9（34）正交表，由碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提取时间、提取温度作正交表，因素水平见表2。
表2弱碱盐溶液提取工艺的正交试验
水平因素碳酸氢钠
浓度（A）∥%氯化钠浓
度（B）∥%提取时间（C）
min提取温度（D）
℃10.20.5906020.31.01207030.41.515080
1.2.2.2碱溶性物质总得率的计算。蛋白质标准曲线的绘制：首先将牛血清白蛋白用0.15 mol/ml的氯化钠溶液配成1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液。再准确称取100 mg考马斯亮蓝G250，溶于50 ml 95%的乙醇后，加入120 ml 85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1 L。取6支试管分别加入1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，然后用0.15 mol/ml氯化钠溶液补充到1.0 ml，最后各试管分别加入5.0 ml考马斯亮蓝G250试剂。每加完一管，立即在旋涡混合器上混匀。加完试剂2～5 min后，于595 nm处测吸光值。以牛血清白蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光值（OD595）为纵坐标，如图1所示。
图1蛋白质标准曲线碱溶性蛋白质得率的计算：取1 ml提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中碱溶性蛋白质的浓度，可计算： 碱溶性蛋白质得率=提取液中碱溶性蛋白质量/松茸质量×100%
2结果与分析
2.1碳酸氢钠浓度对蛋白质得率的影响在一定范围内，碱液可以使碱溶性蛋白质析出，但是当碱液浓度过大时，则可能使蛋白质发生变性，从而影响得率，结果如图2所示。
图2碱液浓度对蛋白质得率的影响由图2可知，碱溶性蛋白质的得率在碳酸氢钠浓度为03%时达到最大。碳酸氢钠浓度小时，松茸中的碱溶性蛋白质并没有完全溶解到溶液中；而碳酸氢钠浓度大时可能会导致蛋白质变性影响得率。所以，以碳酸氢钠浓度0.3%为宜。
2.2氯化钠浓度对蛋白质得率的影响低浓度的氯化钠可以改变细胞膜表面的通透性，而高浓度的氯化钠则会使蛋白质发生变性，所以氯化钠的浓度对蛋白质的得率有一定的影响，结果如图3所示。
图3氯化钠浓度对蛋白质得率的影响由图3可知，碱溶性蛋白质的得率在氯化钠浓度为10%时达到最大，而后随着氯化钠浓度增大而减少。可能是由于氯化钠浓度过大导致蛋白质变性影响得率。所以，以氯化钠浓度1.0%为宜。
2.3提取时间对蛋白质提取率的影响提取时间直接反映溶液对松茸的作用效果，只有达到一定的提取时间，才能使松茸中的碱溶性成分最大的浸出，结果如图4所示。
图4提取时间对蛋白质得率的影响由图4可知，随着提取时间的增加，蛋白质的得率也逐渐增加，当提取时间达到120 min时，得率基本保持不变，从消耗能源和蛋白质得率考虑，以提取时间120 min为宜。
2.4提取温度对蛋白质得率的影响温度会影响溶液的热效应，高温可以使溶液中的水分子运动加速，有利于蛋白质的溶解，但是温度过高会使蛋白质发生变性反应降低得率，结果如图5所示。
图5提取温度对蛋白质得率的影响由图5可知，随着提取温度的增加，蛋白质的得率也逐渐增加，当提取温度达到70 ℃时，得率基本保持不变，从消耗能源和蛋白质得率考虑，以提取温度70 ℃为宜。
2.5弱碱盐溶液提取工艺正交试验为得到最优提取条件而进行正交试验，设计了3水平4因素的正交试验优化提取工艺，具体试验方案与结果分析见表3。由表3可以看出，通过极差分析，得到因素显著性主次顺序为温度>时间>氯化钠水浓度>碳酸氢钠浓度。比较试验结果可以得出4个因素的最佳组成为：碳酸氢钠浓度0.3%，氯化钠浓度0.5%，提取时间150 min，提取温度80 ℃。方差分析显示，FA=1.000，FB=7.750，FC=10.875，FD=21.000，F临界值=19.000。结果表明，温度对弱碱盐提取的影响达到显著水平（P<0.05）。
在最佳工艺条件下测得弱碱盐提取液中的碱性蛋白质得率为1.16%。
3结论
为了得到松茸中的碱性蛋白成分，用碳酸氢钠与氯化钠混合溶液进行提取，以碱性蛋白质的得率为检测指标确定最佳工艺。分别改变提取条件（碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提表3弱碱盐溶液提取率正交设计试验结果
4个因素，考察各因素对总提取率的影响，通过单因素及正交试验得到了松茸碱性蛋白提取的最优条件和测定计算了碱性蛋白。弱碱盐溶液提取碱性蛋白质的最佳提取工艺：碳酸氢钠浓度0.3%，氯化钠浓度0.5%，提取时间150 min，提取温度80 ℃；此条件下碱性蛋白质的得率为1.16%。
参考文献
[1] BYEON S E，LEE J，LEE E，et al.Functional activation of macrophages，monocytes and splenic lymphocytes by polysaccharide fraction from Tricholomamatsutake[J].Archives of Pharmacal Research，2009，32（11）：1565-1572.
[2] DING X，TANG J，CAO M，et al.Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Tricholomamatsutake[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，47（2）：271-275.
[3] KIM S S，LEEJ S.Process development formycelial growth and polysaccharide production in Tricholomamatsutake liquid culture[J].Journalof Bioscienceand Bioengineering，2010，3：351-355.
[4] YIN X L，YOUQ H.Immunomodulatory activities of different solvent extracts from Tricholomamatsutake（S.Ito et S.Imai）singer （higherbasidiomycetes）on normal mice[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2012，14：547-554.
[5] YOU Q H.YIN X L.Pulsed countercurrent ultrasound-assistedextraction and characterization of polysaccharides from Boletus edulis[J].Carbohydrate Polymers，2014，101：379-385.
[6] YOU Q H，YIN X L.Extractionpurificationand antioxidant activities of polysaccharides from TricholomamongolicumImai[J].Carbohydrate Polymers，2014，99：1-10.
[7] YOU Q H，YINX L.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit of Cornusofficinalis[J].Carbohydrate Polymers，2013，98：607-610.
[8] 刘培贵，袁明生，王向华.松茸群生物资源及其合理利用与保护[J].自然资源学报，1999（3）：245-252.
关键词松茸；提取方法；碱性蛋白
中图分类号S646.1+5文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-267-03
松茸[Tricholoma matsutake（S.Ito et Imai）Sing]，又名松口蘑，与温带和寒温带的松林与栎林共生生长，为共生菌[1]。野生松茸的生长环境极为苛刻，需要依赖柏树、橡树等阔叶林为其生长发育提供营养支持，只有这样才能形成健康的子实体[2-3]。松茸含有丰富的氨基酸、维生素和脂肪及丰富的膳食纤维和多种活性酶，另含有3种珍贵的活性物质，分别是双链松茸多糖、松茸多肽和松茸醇[4-5]。松茸有很多保健功能，如提高免疫力、抗癌抗肿瘤、治疗糖尿病及心血管疾病、抗衰老养颜和促肠胃保肝脏等多种功效[6-8]。笔者以新鲜松茸为原料，利用超声波辅助水提、弱碱盐溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的营养物质，并制备成了松茸浓缩口服液。试验打破了松茸在传统口服液中利用率低的局限性，通过改变提取方式，增加了松茸浓缩液的提取率，并结合口服液使用简单、方便，便于保藏等优势，大大提高了松茸的利用价值与经济效益。其中以弱碱盐溶液提取松茸碱性蛋白，在试验中对碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提取时间、提取温度4个因素进行正交试验和分析，确定最佳工艺。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试原料。试验所需松茸来源于黑龙江省牡丹江市东宁县。
1.1.2主要试剂。柠檬酸、正丁醇、肉豆蔻酯、EDTA、柠檬酸钠、纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、碳酸钠、氯化钠、95%乙醇、葡萄糖、浓硫酸、苯酚、草酸、维生素C、偏磷酸、醋酸、氯酸铵、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、磷酸、没食子酸、福林酚、熊果酸、香草醛、冰醋酸、高氯酸等试剂，均为国产分析纯。
1.1.3主要仪器与设备。试验所用主要仪器设备见表1。
表1主要试验仪器
仪器生产厂家型号岛津紫外分光光度计日本岛津公司UV2550电热鼓风干燥箱天津市通利信达仪器厂1013A数控恒温水浴锅上海申胜生物科技有限公司W201高速离心机北京医用离心机厂LD152A分析天平梅特勒·托利多仪器上海有限公司AB104N飞利浦粉碎机飞利浦（珠海）有限公司HR2003
1.2试验方法
1.2.1原材料预处理。选择新鲜、无病残、无虫蛀的松茸，于清水中洗净，沥水。将松茸子实体进行切片处理；用电子天平称量重量，加入20倍体积无菌蒸馏水，将切片后的松茸减压浸渍在含有0.03%的柠檬酸、0.02%正丁醇与0.02%肉豆蔻酯的混合溶液中，减压浸渍10 min。加入0.02%EDTA、0.2%柠檬酸钠，用组织捣碎器将组织破坏。加入纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶，按6.8 g/L加入，3种酶的比例为1∶1∶1.4。
1.2.2弱碱盐溶液提取工艺。
1.2.2.1弱碱盐溶液提取工艺的优化。为了得到松茸中的碱溶性成分，将超声波辅助水提取后的残渣用碳酸氢钠与氯化钠混合溶液进行提取，以碱性蛋白质的得率为检测指标确定最佳工艺。
以碱性蛋白质的提取率为检测指标，称取超声波辅助水提取后的残渣50 g，分别改变提取条件（碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提取时间、提取温度）4个因素，考察各因素对总提取率的影响，各因素水平设置如下：碳酸氢钠浓度：0.1%、02%、0.3%、0.4%、0.5%；氯化钠浓度：0.5%、1.0%、15%、2.0%、2.5%；提取时间：30、60、90、120、150 min；提取温度：50、60、70、80、90 ℃。
在上述单因素试验的基础上，运用L9（34）正交表，由碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提取时间、提取温度作正交表，因素水平见表2。
表2弱碱盐溶液提取工艺的正交试验
水平因素碳酸氢钠
浓度（A）∥%氯化钠浓
度（B）∥%提取时间（C）
min提取温度（D）
℃10.20.5906020.31.01207030.41.515080
1.2.2.2碱溶性物质总得率的计算。蛋白质标准曲线的绘制：首先将牛血清白蛋白用0.15 mol/ml的氯化钠溶液配成1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液。再准确称取100 mg考马斯亮蓝G250，溶于50 ml 95%的乙醇后，加入120 ml 85%的磷酸，用蒸馏水稀释至1 L。取6支试管分别加入1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，然后用0.15 mol/ml氯化钠溶液补充到1.0 ml，最后各试管分别加入5.0 ml考马斯亮蓝G250试剂。每加完一管，立即在旋涡混合器上混匀。加完试剂2～5 min后，于595 nm处测吸光值。以牛血清白蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光值（OD595）为纵坐标，如图1所示。
图1蛋白质标准曲线碱溶性蛋白质得率的计算：取1 ml提取液，按照上述标准曲线方法测定吸光值，根据标准曲线求出提取液中碱溶性蛋白质的浓度，可计算： 碱溶性蛋白质得率=提取液中碱溶性蛋白质量/松茸质量×100%
2结果与分析
2.1碳酸氢钠浓度对蛋白质得率的影响在一定范围内，碱液可以使碱溶性蛋白质析出，但是当碱液浓度过大时，则可能使蛋白质发生变性，从而影响得率，结果如图2所示。
图2碱液浓度对蛋白质得率的影响由图2可知，碱溶性蛋白质的得率在碳酸氢钠浓度为03%时达到最大。碳酸氢钠浓度小时，松茸中的碱溶性蛋白质并没有完全溶解到溶液中；而碳酸氢钠浓度大时可能会导致蛋白质变性影响得率。所以，以碳酸氢钠浓度0.3%为宜。
2.2氯化钠浓度对蛋白质得率的影响低浓度的氯化钠可以改变细胞膜表面的通透性，而高浓度的氯化钠则会使蛋白质发生变性，所以氯化钠的浓度对蛋白质的得率有一定的影响，结果如图3所示。
图3氯化钠浓度对蛋白质得率的影响由图3可知，碱溶性蛋白质的得率在氯化钠浓度为10%时达到最大，而后随着氯化钠浓度增大而减少。可能是由于氯化钠浓度过大导致蛋白质变性影响得率。所以，以氯化钠浓度1.0%为宜。
2.3提取时间对蛋白质提取率的影响提取时间直接反映溶液对松茸的作用效果，只有达到一定的提取时间，才能使松茸中的碱溶性成分最大的浸出，结果如图4所示。
图4提取时间对蛋白质得率的影响由图4可知，随着提取时间的增加，蛋白质的得率也逐渐增加，当提取时间达到120 min时，得率基本保持不变，从消耗能源和蛋白质得率考虑，以提取时间120 min为宜。
2.4提取温度对蛋白质得率的影响温度会影响溶液的热效应，高温可以使溶液中的水分子运动加速，有利于蛋白质的溶解，但是温度过高会使蛋白质发生变性反应降低得率，结果如图5所示。
图5提取温度对蛋白质得率的影响由图5可知，随着提取温度的增加，蛋白质的得率也逐渐增加，当提取温度达到70 ℃时，得率基本保持不变，从消耗能源和蛋白质得率考虑，以提取温度70 ℃为宜。
2.5弱碱盐溶液提取工艺正交试验为得到最优提取条件而进行正交试验，设计了3水平4因素的正交试验优化提取工艺，具体试验方案与结果分析见表3。由表3可以看出，通过极差分析，得到因素显著性主次顺序为温度>时间>氯化钠水浓度>碳酸氢钠浓度。比较试验结果可以得出4个因素的最佳组成为：碳酸氢钠浓度0.3%，氯化钠浓度0.5%，提取时间150 min，提取温度80 ℃。方差分析显示，FA=1.000，FB=7.750，FC=10.875，FD=21.000，F临界值=19.000。结果表明，温度对弱碱盐提取的影响达到显著水平（P<0.05）。
在最佳工艺条件下测得弱碱盐提取液中的碱性蛋白质得率为1.16%。
3结论
为了得到松茸中的碱性蛋白成分，用碳酸氢钠与氯化钠混合溶液进行提取，以碱性蛋白质的得率为检测指标确定最佳工艺。分别改变提取条件（碳酸氢钠浓度、氯化钠浓度、提表3弱碱盐溶液提取率正交设计试验结果
4个因素，考察各因素对总提取率的影响，通过单因素及正交试验得到了松茸碱性蛋白提取的最优条件和测定计算了碱性蛋白。弱碱盐溶液提取碱性蛋白质的最佳提取工艺：碳酸氢钠浓度0.3%，氯化钠浓度0.5%，提取时间150 min，提取温度80 ℃；此条件下碱性蛋白质的得率为1.16%。
参考文献
[1] BYEON S E，LEE J，LEE E，et al.Functional activation of macrophages，monocytes and splenic lymphocytes by polysaccharide fraction from Tricholomamatsutake[J].Archives of Pharmacal Research，2009，32（11）：1565-1572.
[2] DING X，TANG J，CAO M，et al.Structure elucidation and antioxidant activity of a novel polysaccharide isolated from Tricholomamatsutake[J].International Journal of Biological Macromolecules，2010，47（2）：271-275.
[3] KIM S S，LEEJ S.Process development formycelial growth and polysaccharide production in Tricholomamatsutake liquid culture[J].Journalof Bioscienceand Bioengineering，2010，3：351-355.
[4] YIN X L，YOUQ H.Immunomodulatory activities of different solvent extracts from Tricholomamatsutake（S.Ito et S.Imai）singer （higherbasidiomycetes）on normal mice[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2012，14：547-554.
[5] YOU Q H.YIN X L.Pulsed countercurrent ultrasound-assistedextraction and characterization of polysaccharides from Boletus edulis[J].Carbohydrate Polymers，2014，101：379-385.
[6] YOU Q H，YIN X L.Extractionpurificationand antioxidant activities of polysaccharides from TricholomamongolicumImai[J].Carbohydrate Polymers，2014，99：1-10.
[7] YOU Q H，YINX L.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit of Cornusofficinalis[J].Carbohydrate Polymers，2013，98：607-610.
[8] 刘培贵，袁明生，王向华.松茸群生物资源及其合理利用与保护[J].自然资源学报，1999（3）：245-252.