论文部分内容阅读
【摘要】目的：对我院实施酶转换法测定Hcy水平的情况进行观察，并总结该法在常规生化检验中的应用价值。方法：应用酶转换法测定Hcy的精密度、抗干扰性及回收率等，参照NCCLS标准。结果：应用酶转换法检测低值质控血清与高值质控血清的Hcy精密度均低于5%，精密度较高。循环酶法的测定均值为（12.9±6.6）μmol/L，酶转换法的测定均值为（12.8±7.3）μmol/L，两组数据间比较差异无统计学意义（t=0.055，P>0.05），两种方法经回归分析具有良好的相关性（r2=0.898）。酶转换法的Hcy干扰性测定偏差<10%。回收率平均101.1%。试剂稳定性较好。结论：酶转换法检测血清Hcy具有较高的精密度和较强的抗干扰度，试剂稳定性好，回收率高，适合于实验室生化检验的应用。
【关键词】酶转换法；血清同型半胱氨酸；生化检验
【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）10-0110-02
同型半胱氨酸（Hcy）为蛋氨酸的代谢中间产物，属于含硫氨基酸，目前已被证实与许多血管类病变的发病和发展密切相关[1]。也有报道指出，与传统的检测指标相比较，Hcy具有更高的应用价值，对检测与防治心血管疾病具有重要意義[2]。对Hcy的实验室测定方法很多，包括蒌光偏振免疫分析法、氨基酸分析仪法、高效液相色谱分析法、酶联免疫分析法、离子色谱法、循环酶法、毛细管电泳法等，但相关方法多显示出较复杂的操作性或较为昂贵的实验器械、试剂，不易被患者所接受，不利于临床普及应用。随着检验医学的研究水平不断进步，目前已有研究提出采用酶转化法实施Hcy的检测[3]，该方法的特点是可直接应用常规的自动生化分析仪来进行测定，简单快捷，利于临床广泛应用。现对我院实施酶转换法测定Hcy水平的情况进行观察，并总结该法在常规生化检验中的应用价值。
1 材料与方法
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器设备
全自动生化仪由美国雅培公司提供，型号Abbot Aeroset。
1.1.2试剂
Hcy试剂盒由上海复星长征医学科学有限公司生产，内含：50 mmol/L的Tris缓冲液（试剂1），50 mmol/L的FeCl3（试剂2），500 U/L的Hcy酶，5 mmol/L的磷酸吡哆醛，2 mmol/L的二乙基对苯二胺硫酸盐，5 mmol/L的二硫苏糖醇。对照试剂内含：0.2 mmol/L的还原型辅酶，0.1 mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸，0.5 mmol/L的话膦氯化氢，5 mmol/L的α-酮戊二酸，5 kU/L的Hcy甲基转移酶，10 kU/L谷氨酸脱氢酶，3 kU/L的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，5 kU/L的腺苷脱氨酶。
1.1.3测定样本
定值质控血清样本由上海复星长征医学科学有限公司生产，包括浓度10 μmol/L的Hcy低值质控血清，浓度20μmol/L的Hcy高值质控血清。取我院2013年3月至2014年2月间健康查体病例80例为临床样本，患者均未发生黄疸、脂血或溶血，患者男性48例，女性32例，年龄25-59岁，平均（43.8±5.6）岁。患者均于体检时采血（空腹）4 ml，并于1 h内进行检测，离心机转速3000 r/min，分离血清后进行检测。
1.2试验方法
1.2.1精密度试验
分别量取低值和高值质控血清进行测定，每日上午和下午分别进行一次测定，测定时取双份测定，两次测定之间时间间隔不低于2 h，连续以相同测定方法检测20 d后，计算出不同质控样本的精密度。
1.2.2对比试验
在受试样本中，每日随机选取10个样本进行测定，测定前对样本进行编码，首次测定从样本1至样本10的顺序测定，二次测定采用逆序测定，测定仪器为美国雅培公司的全自动生化仪，通过回归分析获得酶转换法测定结果。
1.2.3抗干扰试验
分别应用血红蛋白干扰物、甘油三酯干扰物、胆红素干扰物和维生素C干扰物进行干扰试验，以生理盐水作为对照，对各受试样本进行2次分析，并对照样本进行比较。
1.2.4回收试验
取混合血清样本均分为3份，每份0.9 ml，于每一份血清样本内分别加入浓度20 μmol/L标准溶液、浓度40 μmol/L标准溶液和生理盐水，加入量均为0.1 mL。对每个测试样本进行4次分析测定，获得回收样本结果。
1.2.5稳定性试验
将利用自动化生化分析仪测定Hcy含量的低值和高值质控血清样本置于仪器试剂仓内，保存温度为2℃-8℃，并于置入后24 h、48 h和72 h进行稳定性测试，每个样本均于测定日上午和下午各测定一次，取均值。
1.3检测结果评价
所有血样检测操作办法均严格按照相应试剂盒说明。评价方法参照美国临床实验室标准化委员会NCCLS标准，评价试剂的精密度、抗干扰性及回收率等，进行Hcy与对比试剂的统计学比较分析。
1.4统计学方法
数据应用SPSS19.0软件进行处理，计量资料应用t检验，相关性采用回归分析。
2 结果
2.1试剂精密度
如表1所示，应用酶转换法检测低值质控血清与高值质控血清的Hcy精密度均低于5%，说明精密度较高。
2.2对比试验
循环酶法的测定均值为（12.9±6.6）μmol/L，酶转换法的测定均值为（12.8±7.3）μmol/L，两组数据间比较差异无统计学意义（t=0.055，P>0.05），两种方法经回归分析具有良好的相关性（r2=0.898）。
2.3抗干扰试验
本组中分别采用干扰试剂浓度血红蛋白<2 g/L，总胆红素<340 μmol/L，甘油三酯<72 mmol/L，维生素C<10 g/L，如表2所示，酶转换法的Hcy干扰性测定偏差<10%。 2.4回收试验
分别加入浓度20 μmol/L标准溶液、浓度40 μmol/L标准溶液和生理盐水的回收率为97.2%、103.8%和102.3%，平均101.1%。
2.5稳定性试验
如表3所示为稳定性试验结果数据，试剂稳定性较好。
3 讨论
Hcy水平与高血压、冠心病等血管类病变密切相关，并成为其发病的独立危险因素，因而研究Hcy的临床测定方法具有重要的应用价值[4-5]。本组研究采用的Hcy试剂主要采用酶转换法测定Hcy水平，给临床检测带来便捷，也提高了诊断效率，相比于传统的Hcy检测方法更具有实用性，易被医患认同[6]。
本科转换法测定Hcy的原理为：将受试样本内的Hcy经二硫苏糖醇还原形成还原型Hcy，再通过Hcy酶分解，由于Hcy酶具有极高的特异性，对Hcy识别度高，可准确的将Hcy分解为硫化氢、α氧代丁酸、NH3等产物。氧化剂FeCl3可促使分解获得的硫化氢与呈色剂二乙基对苯二胺硫酸盐发生化学反应生成甲基蓝色化物，该物质与样本中Hcy的浓度变化成正相关性，利用660 nm的波长进行吸光度测定，结果值可表达原样本内Hcy水平。
本组研究在NCCLS标准指导下对酶转换法Hcy试剂进行精密度、抗干扰度、回收率、稳定性等的试验，并以循环酶法为对照，结果显示酶转换法检测血清Hcy具有较高的精密度和较强的抗干扰度，试剂稳定性好，回收率高，适合于实验室生化检验的应用。
參考文献：
[1] 临沂市汉族女性MTHFR和MTRR基因多态性分布及其与同型半胱氨酸水平的相关性[J]. 中华医学遗传学杂志，2012，29（6）：705-707.
[2] 张晓坤，黎文成，古雅珏，等. 酶转换法检测血清同型半胱氨酸在常规生化检验中的评价[J]. 中国医药指南，2011，9（19）：5-7.
[3] 沈国平，邢建明，毛水莹，等. 酶转换法测定同型半胱氨酸的方法学评价[J]. 医学研究杂志，2012，41（3）：131-132.
[4] 李观华，张启贵，刘晓峰，等. 血清同型半胱氨酸与高血压之间关系的研究[J]. 国际检验医学杂志，2011，32（20）：2411-2413.
[5] 邢晓光. 酶转换法检测同型半胱氨酸的评价及其对冠心病的早期诊断价值[J]. 检验医学，2012，27（7）：571-573.
[6] 刘思波. 血浆同型半胱氨酸水平与代谢综合征及其各相关因子的相关性研究[J]. 中国医药指南，2012，10（17）：510-512.
【关键词】酶转换法；血清同型半胱氨酸；生化检验
【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）10-0110-02
同型半胱氨酸（Hcy）为蛋氨酸的代谢中间产物，属于含硫氨基酸，目前已被证实与许多血管类病变的发病和发展密切相关[1]。也有报道指出，与传统的检测指标相比较，Hcy具有更高的应用价值，对检测与防治心血管疾病具有重要意義[2]。对Hcy的实验室测定方法很多，包括蒌光偏振免疫分析法、氨基酸分析仪法、高效液相色谱分析法、酶联免疫分析法、离子色谱法、循环酶法、毛细管电泳法等，但相关方法多显示出较复杂的操作性或较为昂贵的实验器械、试剂，不易被患者所接受，不利于临床普及应用。随着检验医学的研究水平不断进步，目前已有研究提出采用酶转化法实施Hcy的检测[3]，该方法的特点是可直接应用常规的自动生化分析仪来进行测定，简单快捷，利于临床广泛应用。现对我院实施酶转换法测定Hcy水平的情况进行观察，并总结该法在常规生化检验中的应用价值。
1 材料与方法
1.1仪器与试剂
1.1.1仪器设备
全自动生化仪由美国雅培公司提供，型号Abbot Aeroset。
1.1.2试剂
Hcy试剂盒由上海复星长征医学科学有限公司生产，内含：50 mmol/L的Tris缓冲液（试剂1），50 mmol/L的FeCl3（试剂2），500 U/L的Hcy酶，5 mmol/L的磷酸吡哆醛，2 mmol/L的二乙基对苯二胺硫酸盐，5 mmol/L的二硫苏糖醇。对照试剂内含：0.2 mmol/L的还原型辅酶，0.1 mmol/L的S-腺苷甲硫氨酸，0.5 mmol/L的话膦氯化氢，5 mmol/L的α-酮戊二酸，5 kU/L的Hcy甲基转移酶，10 kU/L谷氨酸脱氢酶，3 kU/L的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，5 kU/L的腺苷脱氨酶。
1.1.3测定样本
定值质控血清样本由上海复星长征医学科学有限公司生产，包括浓度10 μmol/L的Hcy低值质控血清，浓度20μmol/L的Hcy高值质控血清。取我院2013年3月至2014年2月间健康查体病例80例为临床样本，患者均未发生黄疸、脂血或溶血，患者男性48例，女性32例，年龄25-59岁，平均（43.8±5.6）岁。患者均于体检时采血（空腹）4 ml，并于1 h内进行检测，离心机转速3000 r/min，分离血清后进行检测。
1.2试验方法
1.2.1精密度试验
分别量取低值和高值质控血清进行测定，每日上午和下午分别进行一次测定，测定时取双份测定，两次测定之间时间间隔不低于2 h，连续以相同测定方法检测20 d后，计算出不同质控样本的精密度。
1.2.2对比试验
在受试样本中，每日随机选取10个样本进行测定，测定前对样本进行编码，首次测定从样本1至样本10的顺序测定，二次测定采用逆序测定，测定仪器为美国雅培公司的全自动生化仪，通过回归分析获得酶转换法测定结果。
1.2.3抗干扰试验
分别应用血红蛋白干扰物、甘油三酯干扰物、胆红素干扰物和维生素C干扰物进行干扰试验，以生理盐水作为对照，对各受试样本进行2次分析，并对照样本进行比较。
1.2.4回收试验
取混合血清样本均分为3份，每份0.9 ml，于每一份血清样本内分别加入浓度20 μmol/L标准溶液、浓度40 μmol/L标准溶液和生理盐水，加入量均为0.1 mL。对每个测试样本进行4次分析测定，获得回收样本结果。
1.2.5稳定性试验
将利用自动化生化分析仪测定Hcy含量的低值和高值质控血清样本置于仪器试剂仓内，保存温度为2℃-8℃，并于置入后24 h、48 h和72 h进行稳定性测试，每个样本均于测定日上午和下午各测定一次，取均值。
1.3检测结果评价
所有血样检测操作办法均严格按照相应试剂盒说明。评价方法参照美国临床实验室标准化委员会NCCLS标准，评价试剂的精密度、抗干扰性及回收率等，进行Hcy与对比试剂的统计学比较分析。
1.4统计学方法
数据应用SPSS19.0软件进行处理，计量资料应用t检验，相关性采用回归分析。
2 结果
2.1试剂精密度
如表1所示，应用酶转换法检测低值质控血清与高值质控血清的Hcy精密度均低于5%，说明精密度较高。
2.2对比试验
循环酶法的测定均值为（12.9±6.6）μmol/L，酶转换法的测定均值为（12.8±7.3）μmol/L，两组数据间比较差异无统计学意义（t=0.055，P>0.05），两种方法经回归分析具有良好的相关性（r2=0.898）。
2.3抗干扰试验
本组中分别采用干扰试剂浓度血红蛋白<2 g/L，总胆红素<340 μmol/L，甘油三酯<72 mmol/L，维生素C<10 g/L，如表2所示，酶转换法的Hcy干扰性测定偏差<10%。 2.4回收试验
分别加入浓度20 μmol/L标准溶液、浓度40 μmol/L标准溶液和生理盐水的回收率为97.2%、103.8%和102.3%，平均101.1%。
2.5稳定性试验
如表3所示为稳定性试验结果数据，试剂稳定性较好。
3 讨论
Hcy水平与高血压、冠心病等血管类病变密切相关，并成为其发病的独立危险因素，因而研究Hcy的临床测定方法具有重要的应用价值[4-5]。本组研究采用的Hcy试剂主要采用酶转换法测定Hcy水平，给临床检测带来便捷，也提高了诊断效率，相比于传统的Hcy检测方法更具有实用性，易被医患认同[6]。
本科转换法测定Hcy的原理为：将受试样本内的Hcy经二硫苏糖醇还原形成还原型Hcy，再通过Hcy酶分解，由于Hcy酶具有极高的特异性，对Hcy识别度高，可准确的将Hcy分解为硫化氢、α氧代丁酸、NH3等产物。氧化剂FeCl3可促使分解获得的硫化氢与呈色剂二乙基对苯二胺硫酸盐发生化学反应生成甲基蓝色化物，该物质与样本中Hcy的浓度变化成正相关性，利用660 nm的波长进行吸光度测定，结果值可表达原样本内Hcy水平。
本组研究在NCCLS标准指导下对酶转换法Hcy试剂进行精密度、抗干扰度、回收率、稳定性等的试验，并以循环酶法为对照，结果显示酶转换法检测血清Hcy具有较高的精密度和较强的抗干扰度，试剂稳定性好，回收率高，适合于实验室生化检验的应用。
參考文献：
[1] 临沂市汉族女性MTHFR和MTRR基因多态性分布及其与同型半胱氨酸水平的相关性[J]. 中华医学遗传学杂志，2012，29（6）：705-707.
[2] 张晓坤，黎文成，古雅珏，等. 酶转换法检测血清同型半胱氨酸在常规生化检验中的评价[J]. 中国医药指南，2011，9（19）：5-7.
[3] 沈国平，邢建明，毛水莹，等. 酶转换法测定同型半胱氨酸的方法学评价[J]. 医学研究杂志，2012，41（3）：131-132.
[4] 李观华，张启贵，刘晓峰，等. 血清同型半胱氨酸与高血压之间关系的研究[J]. 国际检验医学杂志，2011，32（20）：2411-2413.
[5] 邢晓光. 酶转换法检测同型半胱氨酸的评价及其对冠心病的早期诊断价值[J]. 检验医学，2012，27（7）：571-573.
[6] 刘思波. 血浆同型半胱氨酸水平与代谢综合征及其各相关因子的相关性研究[J]. 中国医药指南，2012，10（17）：510-512.