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摘要：将葡萄糖氧化酶、电子介体、增稠剂、表面活性剂、缓冲液制成的酶浆液滴加到碳浆印刷电极表面，在粘合隔片与表面封装片之间设有一前处理层，该前处理层设置于粘合隔片上的采样口之上，如此制得一次性电化学尿糖试纸。该一次性电化学尿糖试纸由于增设了经特殊处理的前处理层及干扰消除电极，可达到抑制尿液中干扰物质产生干扰电流的目的，从而提高测试结果的准确度，尤其提高干扰物含量较高的高比重尿液的检测结果的准确度。
为了控制新陈代谢的情况，特别是对于糖尿病病例，需要定期地控制体循环中的葡萄糖浓度。这不仅对于要注射胰岛素的I型糖尿病患者来说是必须的，对于II型糖尿病患者也是如此，后者约占这种糖代谢疾病的85%。
鉴于糖尿病的高发病率，仅有常规的通过皮肤穿刺进行的血糖测量不能够满足定期的新陈代谢控制的需要和希望。这需要患者在每次测量前克服刺伤皮肤的心理障碍。对于大多数患者来说，并不需要测量血糖，而只要控制尿液中的葡萄糖浓度就行了。如果通过新陈代谢的刺激超过了肾脏的阈值，就导致生理需要之外的葡萄糖作为尿糖经过肾脏排出，在尿液中的葡萄糖就体现为可以检测出的浓度。因此，尽管血糖检测已经相当普及，但尿糖检测作为一种使用操作很简便的无创的检测方法，仍深受相当部分糖尿病患者的欢迎。
对于预防用的筛选家庭及个人尿液中的葡萄糖含量的方法通常采用尿糖检测试纸，这类试纸多数是在酶化学基础上产生葡萄糖依从性的颜色反应。这些试纸条的缺点是准确性差，只能用于尿糖的半定量检测，且灵敏度比较低，一般都在尿糖含量达到50mg/dl，甚至100mg/dl才能显示出阳性，测试时还必须用时钟严格控制时间才能准确判断结果，从而测量结果很不可靠。并且只有能分辨颜色的人才能采用，而糖尿病患者，特别是II型糖尿病的老年患者中，相当多的人是色盲，至少辩色不准确。
上述偏光光度计是作为实验室设备而配备的用于临床化学中，而尿糖试纸又不适宜用作日常新陈代谢控制中可靠地表达尿液中的葡萄糖存在及其浓度的常规方法。因此研究和开发越来越集中于酶促电化学测量装置及其在葡萄糖测定方面的应用。2008年，日本的一家公司研制推出了一种可对尿糖进行定量检测的生物传感器尿糖测试仪，但由于其采用固定传感器检测头，价格昂贵，使用成本高，且检测头是多次反复使用，需要清洗，还会面临消毒方面的一些问题。
尿液中各种杂质对尿糖测量造成严重的干扰，不管是比色反射法还是电化学生物传感器法。不同比重尿液中存在干扰物的量有较大差别，高比重尿中含有更多的Vc、尿酸等还原性干扰物，高比重尿中含有的大量电解质离子、金属离子均会影响尿糖检测的特异性，造成测试结果不准确。
因此，研制准确、高灵敏度、使用方便、价格便宜的便携式家用尿糖试纸及尿糖仪，具有重要意义及市场前景。
本文报道了一种新型的一次性电化学尿糖试纸，将葡萄糖氧化酶、电子介体、增稠剂、表面活性剂、缓冲液制成的酶浆液滴加到碳浆印刷电极表面，在粘合隔片与表面封装片之间设有一前处理层，该前处理层设置于粘合隔片上的采样口之上，制得一次性电化学尿糖试纸。该一次性电化学尿糖试纸由于增设了经特殊处理的前处理层因而可达到抑制尿液中干扰物质产生干扰电流的目的，从而提高测试结果的准确度，尤其提高干扰物含量较高的高比重尿液的检测结果的准确度。
1 材料与方法
1.1仪器与试剂
78-1型磁力加热搅拌器（金坛市医疗仪器厂），PHS-3C酸度计（上海精密科学仪器有限公司），HS-6070 CCD全自动对位丝网印刷机（东莞市恒锦印刷机械有限公司），高速精密紫外激光蚀刻机（武汉拓普银光电技术有限公司），红外隧道炉（自制），滚切机（自制），多参数分析仪（桂林乐尔医疗器械有限公司），YSI 2300葡萄糖乳酸分析仪（美国YSI公司）。
碳浆油墨（美国艾奇森），聚酯膜（日本东丽），葡萄糖氧化酶（东洋纺），铁氰化钾、羧甲基纤维素钠、曲拉通-100、柠檬酸、柠檬酸钠均来自国药集团，除指明的外，所用试剂为分析纯，实验用水为纯化水。
1.2电化学尿糖试纸的制作
1.2.1前处理膜制作
配制处理液，处理液由海藻酸钠0.5%、曲拉通X-100 0.5%和浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液组成。
将孔径为0.5μm的玻璃纤维纸基材置于处理液中浸泡120s（浸泡液的用量为可以浸没玻璃纤维纸即可），取出，于60℃条件下干燥40min，裁剪至合适大小而得。
1.2.2电化学尿糖试纸成品制作
使用全自动对位丝网印刷机将碳浆油墨印刷到聚酯膜表面，紅外隧道炉150度烘干30分钟，印好碳浆油墨的聚酯膜干燥后用高速精密紫外激光蚀刻机蚀刻出需要的参比电极、工作电极及干扰消除电极及其导线，在形成电路的聚酯膜参比电极及工作电极区域印刷上含有葡萄糖氧化酶、铁氰化钾、羧甲基纤维素钠、曲拉通-100、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的酶浆液，放到红外隧道炉50度烘干20分钟，随后在虹吸进样区贴合虹吸导样槽，在前处理区贴合尿液前处理膜，制作成电化学尿糖试纸大板，使用滚切机把电化学尿糖试纸大板裁切成长37.5mm宽6.5mm的单片试纸，置于放置有分子筛干燥剂的试纸瓶中备用。
1 绝缘基片 2导电电极 2-1工作电极 2-2 参比电极 2-3干扰消除电极 3 绝缘隔离层
4前处理膜 5酶反应膜 6虹吸导样槽 7 采样口 8 粘合隔片9 导气孔 10 表面封装片
1.3实验方法
收集比重为1.015的新鲜尿液，配制尿糖浓度为10mg/dL，25mg/dL，50mg/dL，100mg/dL，250mg/dL，375mg/dL，500mg/dL，1000mg/dLmg/dL，2000mg/dL的尿样。将电化学尿糖试纸置于多参数分析仪中并在工作电极和参考电极两端施加300mV工作电压；取适量配制尿液，加到采样口，尿液经过前处理层后，通过虹吸导样槽自动吸取尿液进入反应区与酶反应膜中试剂反应形成电流，在多参数分析仪上可快速检测出与葡萄糖浓度相对应的电流，尿糖浓度与电流的线性关系见图2。每一尿样使用YSI 2300葡萄糖乳酸分析仪测试尿糖浓度。将YSI 2300葡萄糖乳酸分析仪测试浓度值与电化学尿糖试纸及多参数分析仪测试电流作图，得到的线性曲线。用上述方法定标后，将得到的线性曲线输入到多参数分析仪的存储设备中，测试未知样品的尿糖浓度可以直接从多参数分析仪中读出。 2结果与讨论
2.1前处理液PH对尿中干扰物电流的消除
处理液海藻酸钠0.5%、曲拉通X-100 0.5%和1mol/L的柠檬酸缓冲液不变，调整柠檬酸缓冲液PH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，将孔径为0.5μm的玻璃纤维纸基材置于处理液中浸泡120s（浸泡液的用量为可以浸没玻璃纤维纸即可），取出，于60℃条件下干燥40min，裁剪至合适大小制作成电化学尿糖试纸。收集尿比重分别为1.005，1.015，1.030三个尿样，取每个比重尿液，配制尿糖浓度为50mg/dL，100mg/dL，250mg/dL，500mg/dL，1000mg/dLmg/dL的尿样，用不同PH前处理液的电化学尿糖试纸及多参数分析仪测试尿样。结果表明，前处理液PH低的电化学尿糖试纸可以压制尿液中还原物质及离子产生的电流，且PH越低消除干扰效果越好，但PH过低也会影响电化学尿糖试纸的反应响应性能，综合考虑消除干扰效果及电化学尿糖试纸的反应响应性能，前处理液PH为4最佳。
2.2 电化学尿糖试纸酶浆PH选择
酶浆的PH会影响葡萄糖氧化酶的活性，将酶浆柠檬酸缓冲体系PH分别调整为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，制作成电化学尿糖试纸，用制作的电化学尿糖试纸测试比重为1.015，浓度分别为100mg/dL，500mg/dL的两个尿样，观察电化学尿糖试纸的反应响应性。结果表明，酶浆PH为6的电化学尿糖试纸，测试两个尿样的电流差值最大，说明酶浆PH为6的电化学尿糖试纸响应性最好。葡萄糖氧化酶的活性在PH5-9时，随PH增大活性变高，但电化学尿糖试纸中含有铁氰化钾，铁氰化钾在PH低于4.0或高于7.0时，会影响电化学尿糖试纸长期保存。因而，电化学尿糖试纸酶浆的PH确定为6。
2.3葡萄糖氧化酶用量对电化学尿糖试纸响应的影响
酶浆中葡萄糖氧化酶用量会影响电化学尿糖试纸的响应性，将酶浆葡萄糖氧化酶分别调整为0.5%，1%，1.5%，2.0%，2.5%，制作成电化学尿糖试纸，用制作的电化学尿糖试纸测试比重为1.015，浓度分别为100mg/dL，500mg/dL 的两个尿样，观察电化学尿糖试纸的反应响应性，结果见表1。结果表明，酶浆中葡萄糖氧化酶用量为1.5%和2.0%的电化学尿糖试纸，测试两个尿样的电流差值最大，说明电化学尿糖试纸响应性最好。葡萄糖氧化酶是电化学尿糖试纸中成本最高的试剂，从成本考虑，葡萄糖氧化酶用量。
2.4 干扰消除电极的设置对尿中干扰物电流的消除
本文的电化学尿糖试纸设置有参比电极、工作电极，还设置了一个干扰消除电极，将酶浆印刷在参比电极、工作电极上，干扰消除电极裸露，将电化学尿糖试纸插入多参数分析仪，仪器给电化学尿糖试纸的电极加上300mv电压，将样品加到电化学尿糖试纸反应区，可以测量工作电极及干扰消除电极电流，其中，工作电极的电流包含样品中葡萄糖与酶及其它试剂反应的电流，还包含样品中干扰物与反应区试剂反应的电流，干扰消除电极电流则只包含样品中干扰物与反应区试剂反应的电流，通过将工作电极电流减去干扰消除电极电流即可消除样品中所含的还原性干扰物质对检测结果的影响，由于不同尿液，所含的还原性干扰物质不同且差异很大，在电化学尿糖试纸上设置干扰消除电极消除尿液的差异，大大的提高了检测准确度。
2.5 線性范围及检测限
收集比重为1.015的新鲜尿液，配制尿糖浓度为0mg/dL，10mg/dL，25mg/dL，100mg/dL，500mg/dL，1000mg/dLmg/dL，2000mg/dL的尿样。每一尿样使用YSI 2300 葡萄糖乳酸分析仪测试尿糖浓度。同时将电化学尿糖试纸置于已经标定好的多参数分析仪中并在工作电极和参考电极两端施加300mV工作电压；取适量配制尿液，加到采样口，尿液经过前处理层后，通过虹吸导样槽自动吸取尿液进入反应区与酶反应膜中试剂反应形成电流，测试样品的尿糖浓度。其线性范围为10mg/dL-2000mg/dL，最低检出限为0 mg/dL，检测时间仅为5秒。
3结论
本文报道了一种电化学尿糖试纸，这种电化学尿糖试纸应用电化学生物传感器原理，可以全定量检测尿液中葡萄糖浓度。该电化学尿糖试纸通过在试纸结构上设置前处理膜，在电极系统中设置干扰消除电极，能很好的消除尿液基质及还原性物质对检测结果的干扰，从而大大提高了检测灵敏度及准确度。该电化学尿糖试纸具有制作工艺简单，检测时间短，使用方便，抗干扰能力强，全定量，检测准确度高等特点；克服了现行光化学试纸检测时间长，检测灵敏度不高，只能半定量等缺点，适用于临床无痛监测血糖，具有广阔的市场前景。
为了控制新陈代谢的情况，特别是对于糖尿病病例，需要定期地控制体循环中的葡萄糖浓度。这不仅对于要注射胰岛素的I型糖尿病患者来说是必须的，对于II型糖尿病患者也是如此，后者约占这种糖代谢疾病的85%。
鉴于糖尿病的高发病率，仅有常规的通过皮肤穿刺进行的血糖测量不能够满足定期的新陈代谢控制的需要和希望。这需要患者在每次测量前克服刺伤皮肤的心理障碍。对于大多数患者来说，并不需要测量血糖，而只要控制尿液中的葡萄糖浓度就行了。如果通过新陈代谢的刺激超过了肾脏的阈值，就导致生理需要之外的葡萄糖作为尿糖经过肾脏排出，在尿液中的葡萄糖就体现为可以检测出的浓度。因此，尽管血糖检测已经相当普及，但尿糖检测作为一种使用操作很简便的无创的检测方法，仍深受相当部分糖尿病患者的欢迎。
对于预防用的筛选家庭及个人尿液中的葡萄糖含量的方法通常采用尿糖检测试纸，这类试纸多数是在酶化学基础上产生葡萄糖依从性的颜色反应。这些试纸条的缺点是准确性差，只能用于尿糖的半定量检测，且灵敏度比较低，一般都在尿糖含量达到50mg/dl，甚至100mg/dl才能显示出阳性，测试时还必须用时钟严格控制时间才能准确判断结果，从而测量结果很不可靠。并且只有能分辨颜色的人才能采用，而糖尿病患者，特别是II型糖尿病的老年患者中，相当多的人是色盲，至少辩色不准确。
上述偏光光度计是作为实验室设备而配备的用于临床化学中，而尿糖试纸又不适宜用作日常新陈代谢控制中可靠地表达尿液中的葡萄糖存在及其浓度的常规方法。因此研究和开发越来越集中于酶促电化学测量装置及其在葡萄糖测定方面的应用。2008年，日本的一家公司研制推出了一种可对尿糖进行定量检测的生物传感器尿糖测试仪，但由于其采用固定传感器检测头，价格昂贵，使用成本高，且检测头是多次反复使用，需要清洗，还会面临消毒方面的一些问题。
尿液中各种杂质对尿糖测量造成严重的干扰，不管是比色反射法还是电化学生物传感器法。不同比重尿液中存在干扰物的量有较大差别，高比重尿中含有更多的Vc、尿酸等还原性干扰物，高比重尿中含有的大量电解质离子、金属离子均会影响尿糖检测的特异性，造成测试结果不准确。
因此，研制准确、高灵敏度、使用方便、价格便宜的便携式家用尿糖试纸及尿糖仪，具有重要意义及市场前景。
本文报道了一种新型的一次性电化学尿糖试纸，将葡萄糖氧化酶、电子介体、增稠剂、表面活性剂、缓冲液制成的酶浆液滴加到碳浆印刷电极表面，在粘合隔片与表面封装片之间设有一前处理层，该前处理层设置于粘合隔片上的采样口之上，制得一次性电化学尿糖试纸。该一次性电化学尿糖试纸由于增设了经特殊处理的前处理层因而可达到抑制尿液中干扰物质产生干扰电流的目的，从而提高测试结果的准确度，尤其提高干扰物含量较高的高比重尿液的检测结果的准确度。
1 材料与方法
1.1仪器与试剂
78-1型磁力加热搅拌器（金坛市医疗仪器厂），PHS-3C酸度计（上海精密科学仪器有限公司），HS-6070 CCD全自动对位丝网印刷机（东莞市恒锦印刷机械有限公司），高速精密紫外激光蚀刻机（武汉拓普银光电技术有限公司），红外隧道炉（自制），滚切机（自制），多参数分析仪（桂林乐尔医疗器械有限公司），YSI 2300葡萄糖乳酸分析仪（美国YSI公司）。
碳浆油墨（美国艾奇森），聚酯膜（日本东丽），葡萄糖氧化酶（东洋纺），铁氰化钾、羧甲基纤维素钠、曲拉通-100、柠檬酸、柠檬酸钠均来自国药集团，除指明的外，所用试剂为分析纯，实验用水为纯化水。
1.2电化学尿糖试纸的制作
1.2.1前处理膜制作
配制处理液，处理液由海藻酸钠0.5%、曲拉通X-100 0.5%和浓度为1mol/L的柠檬酸缓冲液组成。
将孔径为0.5μm的玻璃纤维纸基材置于处理液中浸泡120s（浸泡液的用量为可以浸没玻璃纤维纸即可），取出，于60℃条件下干燥40min，裁剪至合适大小而得。
1.2.2电化学尿糖试纸成品制作
使用全自动对位丝网印刷机将碳浆油墨印刷到聚酯膜表面，紅外隧道炉150度烘干30分钟，印好碳浆油墨的聚酯膜干燥后用高速精密紫外激光蚀刻机蚀刻出需要的参比电极、工作电极及干扰消除电极及其导线，在形成电路的聚酯膜参比电极及工作电极区域印刷上含有葡萄糖氧化酶、铁氰化钾、羧甲基纤维素钠、曲拉通-100、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的酶浆液，放到红外隧道炉50度烘干20分钟，随后在虹吸进样区贴合虹吸导样槽，在前处理区贴合尿液前处理膜，制作成电化学尿糖试纸大板，使用滚切机把电化学尿糖试纸大板裁切成长37.5mm宽6.5mm的单片试纸，置于放置有分子筛干燥剂的试纸瓶中备用。
1 绝缘基片 2导电电极 2-1工作电极 2-2 参比电极 2-3干扰消除电极 3 绝缘隔离层
4前处理膜 5酶反应膜 6虹吸导样槽 7 采样口 8 粘合隔片9 导气孔 10 表面封装片
1.3实验方法
收集比重为1.015的新鲜尿液，配制尿糖浓度为10mg/dL，25mg/dL，50mg/dL，100mg/dL，250mg/dL，375mg/dL，500mg/dL，1000mg/dLmg/dL，2000mg/dL的尿样。将电化学尿糖试纸置于多参数分析仪中并在工作电极和参考电极两端施加300mV工作电压；取适量配制尿液，加到采样口，尿液经过前处理层后，通过虹吸导样槽自动吸取尿液进入反应区与酶反应膜中试剂反应形成电流，在多参数分析仪上可快速检测出与葡萄糖浓度相对应的电流，尿糖浓度与电流的线性关系见图2。每一尿样使用YSI 2300葡萄糖乳酸分析仪测试尿糖浓度。将YSI 2300葡萄糖乳酸分析仪测试浓度值与电化学尿糖试纸及多参数分析仪测试电流作图，得到的线性曲线。用上述方法定标后，将得到的线性曲线输入到多参数分析仪的存储设备中，测试未知样品的尿糖浓度可以直接从多参数分析仪中读出。 2结果与讨论
2.1前处理液PH对尿中干扰物电流的消除
处理液海藻酸钠0.5%、曲拉通X-100 0.5%和1mol/L的柠檬酸缓冲液不变，调整柠檬酸缓冲液PH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，将孔径为0.5μm的玻璃纤维纸基材置于处理液中浸泡120s（浸泡液的用量为可以浸没玻璃纤维纸即可），取出，于60℃条件下干燥40min，裁剪至合适大小制作成电化学尿糖试纸。收集尿比重分别为1.005，1.015，1.030三个尿样，取每个比重尿液，配制尿糖浓度为50mg/dL，100mg/dL，250mg/dL，500mg/dL，1000mg/dLmg/dL的尿样，用不同PH前处理液的电化学尿糖试纸及多参数分析仪测试尿样。结果表明，前处理液PH低的电化学尿糖试纸可以压制尿液中还原物质及离子产生的电流，且PH越低消除干扰效果越好，但PH过低也会影响电化学尿糖试纸的反应响应性能，综合考虑消除干扰效果及电化学尿糖试纸的反应响应性能，前处理液PH为4最佳。
2.2 电化学尿糖试纸酶浆PH选择
酶浆的PH会影响葡萄糖氧化酶的活性，将酶浆柠檬酸缓冲体系PH分别调整为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，制作成电化学尿糖试纸，用制作的电化学尿糖试纸测试比重为1.015，浓度分别为100mg/dL，500mg/dL的两个尿样，观察电化学尿糖试纸的反应响应性。结果表明，酶浆PH为6的电化学尿糖试纸，测试两个尿样的电流差值最大，说明酶浆PH为6的电化学尿糖试纸响应性最好。葡萄糖氧化酶的活性在PH5-9时，随PH增大活性变高，但电化学尿糖试纸中含有铁氰化钾，铁氰化钾在PH低于4.0或高于7.0时，会影响电化学尿糖试纸长期保存。因而，电化学尿糖试纸酶浆的PH确定为6。
2.3葡萄糖氧化酶用量对电化学尿糖试纸响应的影响
酶浆中葡萄糖氧化酶用量会影响电化学尿糖试纸的响应性，将酶浆葡萄糖氧化酶分别调整为0.5%，1%，1.5%，2.0%，2.5%，制作成电化学尿糖试纸，用制作的电化学尿糖试纸测试比重为1.015，浓度分别为100mg/dL，500mg/dL 的两个尿样，观察电化学尿糖试纸的反应响应性，结果见表1。结果表明，酶浆中葡萄糖氧化酶用量为1.5%和2.0%的电化学尿糖试纸，测试两个尿样的电流差值最大，说明电化学尿糖试纸响应性最好。葡萄糖氧化酶是电化学尿糖试纸中成本最高的试剂，从成本考虑，葡萄糖氧化酶用量。
2.4 干扰消除电极的设置对尿中干扰物电流的消除
本文的电化学尿糖试纸设置有参比电极、工作电极，还设置了一个干扰消除电极，将酶浆印刷在参比电极、工作电极上，干扰消除电极裸露，将电化学尿糖试纸插入多参数分析仪，仪器给电化学尿糖试纸的电极加上300mv电压，将样品加到电化学尿糖试纸反应区，可以测量工作电极及干扰消除电极电流，其中，工作电极的电流包含样品中葡萄糖与酶及其它试剂反应的电流，还包含样品中干扰物与反应区试剂反应的电流，干扰消除电极电流则只包含样品中干扰物与反应区试剂反应的电流，通过将工作电极电流减去干扰消除电极电流即可消除样品中所含的还原性干扰物质对检测结果的影响，由于不同尿液，所含的还原性干扰物质不同且差异很大，在电化学尿糖试纸上设置干扰消除电极消除尿液的差异，大大的提高了检测准确度。
2.5 線性范围及检测限
收集比重为1.015的新鲜尿液，配制尿糖浓度为0mg/dL，10mg/dL，25mg/dL，100mg/dL，500mg/dL，1000mg/dLmg/dL，2000mg/dL的尿样。每一尿样使用YSI 2300 葡萄糖乳酸分析仪测试尿糖浓度。同时将电化学尿糖试纸置于已经标定好的多参数分析仪中并在工作电极和参考电极两端施加300mV工作电压；取适量配制尿液，加到采样口，尿液经过前处理层后，通过虹吸导样槽自动吸取尿液进入反应区与酶反应膜中试剂反应形成电流，测试样品的尿糖浓度。其线性范围为10mg/dL-2000mg/dL，最低检出限为0 mg/dL，检测时间仅为5秒。
3结论
本文报道了一种电化学尿糖试纸，这种电化学尿糖试纸应用电化学生物传感器原理，可以全定量检测尿液中葡萄糖浓度。该电化学尿糖试纸通过在试纸结构上设置前处理膜，在电极系统中设置干扰消除电极，能很好的消除尿液基质及还原性物质对检测结果的干扰，从而大大提高了检测灵敏度及准确度。该电化学尿糖试纸具有制作工艺简单，检测时间短，使用方便，抗干扰能力强，全定量，检测准确度高等特点；克服了现行光化学试纸检测时间长，检测灵敏度不高，只能半定量等缺点，适用于临床无痛监测血糖，具有广阔的市场前景。