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摘要：以花生幼叶为试材，对高通量DNA提取法、SDS简易法、TPS法以及TENP法4种不同的DNA提取方法进行比较和优化。结果表明，与其他3种改良方法比较，改良TPS法具有不需液氮磨样、提取速度快、试剂种类少、成本低、DNA溶解速度快、质量较好的优点，提取的DNA可用于花生SSR分析。
关键词：花生；基因组DNA；提取方法；幼叶
中图分类号：S565.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0011-04
AbstractWith the young leaves of peanut as experiment material， four different DNA extraction methods， the high-throughput DNA extraction method， the simple SDS method， TPS method and TENP method， were compared and optimized. The results showed that， compared with the other improved methods， the improved TPS method had the advantages of grinding samples with no liquid nitrogen， faster extraction rate， fewer kinds of reagent， lower cost， rapider DNA solution rate and better DNA quality. The DNA extracted through improved TPS method could be used for SSR analysis of peanut.
Key wordsPeanut （Arachis hypogaea L.）；Genomic DNA；Extraction method；Young leaves
DNA是遗传信息的载体，DNA的提取是分子生物学研究的基础。植物总DNA的提取方法主要有CTAB法[1]、高盐低pH法[2，3]、SDS法[4]等。近年来，许多研究人员根据不同的植物和不同的试验要求对传统的DNA提取方法进行改进和创新，取得了较好的效果[5，6]，但这些方法存在步骤繁琐、有机溶剂残留导致污染以及对人体造成危害等缺点。
李庆云等[6]研究发现，从花生不同部位提取DNA时，叶片的DNA产率最高。本研究对花生、小麦、玉米等植物叶片的4种DNA提取方法[7～10]进行改进和创新，力求寻找一种DNA质量和纯度相对较好、可用于SSR分析的快速简便的花生DNA提取方法，用于花生的遗传多样性分析、遗传图谱构建及分子标记辅助选择等研究。
1材料与方法
1.1试验材料
以花生品种“四粒红”的叶片为材料，由山东省花生研究所提供。
1.2DNA提取方法
分别对高通量DNA提取法[7]、SDS简易法[8]、TPS法[9]以及TENP法[10]四种简便的DNA提取方法进行改良及优化，方法如下。
1.2.1改良高通量DNA提取法（1）取新鲜幼叶约0.05 g，剪为0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL的Buffer A（100 mmol/L NaOH，2%Tween-20），95℃水浴10 min。（3）12 000 r/min离心10 min，取上清加入等体积的Buffer B （100 mmol/L Tris-HCl， 2 mmol/L EDTA-Na2）混匀。（4）加入预冷的等体积无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。
1.2.2改良SDS简易法（1）取新鲜幼叶约0.05 g，剪为0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL DNA提取液，漩涡混匀5 s，95℃水浴10 min（提取液包含200 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5% SDS）。（3）12 000 r/min 离心10 min，取上清，加入等体积预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。
1.2.3改良TPS法（1）取新鲜幼叶约0.05 g，剪为0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL TPS缓冲液，漩涡混匀5 s，95℃水浴10 min （TPS缓冲液包含100 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA）。（3）12 000 r/min离心10 min，取上清液加入等体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。
1.2.4改良TENP法（1）新鲜幼叶约0.05 g，剪为0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL DNA提取液，漩涡混匀5 s，95℃水浴10 min （提取液包含100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，50 mmol/L EDTA）。（3）12 000 r/min 离心10 min，取上清加入等体积预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min离心5 min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。 1.3DNA质量检测
用紫外分光光度计（BiophotometerRS232C，Eppendorf AG）测OD值。如果A260/A280值在1.8～2.0，表明提取的DNA质量和纯度较好，若比值小于1.8表示有蛋白质污染，大于2.0表明RNA含量较高。
DNA的电泳检测使用0.8%琼脂糖凝胶，上样缓冲液上样量为4 μL，120 V、电泳40 min。如果电泳后DNA谱带较多或连片，表明DNA分子已破碎或已降解，这样的DNA将无法用于PCR；反之，DNA为一条带，且距点样孔较近，则说明DNA完整。
1.4SSR分析及检测
SSR反应体系包含模板2 μL，2×PCR Master Mix 5 μL（包含Buffer，Taq酶，dNTPs，购自北京天根生化科技有限公司），正反引物各0.3 μL，ddH2O 2.4 μL。SSR分析热循环程序：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，5个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；94℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR扩增产物进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色[11]。
2结果与分析
2.1DNA提取方法的优化
本试验对4种不同的DNA提取方法进行了改良。①将原始的TPS法以及TENP法对材料的液氮处理改为研磨棒研磨。②改良后的TENP法中未添加RNase A。③在原始的高通量DNA提取法中增加了离心和无水乙醇沉淀的步骤。④将原始的SDS简易法、TENP法以及TPS法中加入DNA提取液后静置1 h、65℃温育40 min以及75℃水浴30 min处理均改为95℃水浴10 min。
改良之后大大缩短了整个试验过程。最后提取的DNA沉淀如图1所示，改良高通量DNA提取法最终得到半透明黄绿色胶状DNA；改良SDS简易法最终得到的DNA沉淀为含有大量叶绿素的绿色固体；改良TPS法最终得到半透明淡黄色胶状DNA；改良TENP法最后沉淀DNA为浅褐色片状固体。将DNA风干时发现，风干最快的是改良TPS法和改良TENP法提取的DNA，而改良高通量DNA提取法和改良SDS简易法所提DNA风干较慢，大约需要10 h以上。在之后的TE溶解DNA过程中，发现改良高通量DNA提取法和改良TPS法得到的胶状半透明DNA溶解最快，而改良SDS简易法和改良TENP法得到的绿色固体和褐色片状的DNA溶解慢，甚至有不溶的现象。
由于改良高通量法提取DNA含有部分叶绿素，风干速度慢，且A260/A280值小于1.8，存在蛋白质污染，琼脂糖凝胶电泳检测时无DNA条带，故排除此法。改良SDS所提取的DNA含有较多叶绿素、不易溶解、存在RNA污染，琼脂糖凝胶电泳存在DNA降解的问题，故也排除此法。改良TENP法提取的DNA较难溶解、A260/A280值大于2.0、琼脂糖电泳检测存在杂质污染的问题，故排除此法。改良TPS法提取的DNA溶解最快，A260/A280值接近2.0，琼脂糖电泳检测呈现一条谱带，且通过SSR分析可以获得理想的效果，故可作为一种较好的适用于SSR分析的花生叶片DNA快速提取方法。
3讨论
许多研究表明，健康的幼叶是试验的最佳样本来源。本研究选取新鲜的花生嫩叶，其中DNA含量相对较多，纤维素含量较少，易于提取，避免了较老叶片中含有的多糖、多酚等代谢物质对PCR反应的抑制作用。本研究对高通量DNA提取法、SDS简易法、TPS法以及TENP法4种不同的应用于其它植物的DNA提取方法进行改良，通过对DNA进行质量检测与SSR扩增验证，最终筛选出的最佳花生叶片提取方法为改良TPS法。其所提取的DNA具有良好的完整性，质量达到SSR分析的要求，可用于花生SSR分子标记分析。本方法具有以下优点：
（1）磨样简便。使用研磨棒直接在离心管中研磨，方便快捷，适用于少量DNA的提取，省去了对研钵清洗及再次灭菌的环节，避免了交叉污染，无需液氮，降低了成本。
（2）节约试剂。减少了β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、聚乙烯吡咯烷酮等的使用，避免了有机试剂对人体的危害，降低了试剂成本。
（3）用时短。避免反复抽提，省去了苯酚/氯仿和氯仿/异戊醇重复抽提的过程，仅通过提高提取液中的KCl浓度来沉淀蛋白质和阻止多酚等次生物质的氧化，达到去除蛋白质的目的[10]。同时升高水浴温度，缩短水浴时间，大大加快了提取速度。
由于提取步骤的简化，本提取方法也存在一些弊端。采用研磨棒磨样，可能会造成研磨不够彻底，有所浪费，且常温下磨样要快速进行。本方法得到的DNA对SSR标记分析没有影响，但其质量能否满足RFLP和AFLP等标记分析的需要，仍需进一步的试验。
参考文献：
[1]熊劲芳， 向育君， 张正奇. 花生总DNA的快速提取与纯化研究[J].生物学杂志， 2003， 20（2）： 32-34.
[2]苗晓燕， 贾晓梅. 药用植物虎杖毛状根DNA提取方法研究[J]. 保定学院学报， 2009， 22（4）： 67-69.
[3]Guillernsut P， Drouard L M. Isolation of plant DNA： A fast， inexpensive， and reliable method [J]. Plant Mol. Bio. Rep.， 1992， 10（1）： 60-65.
[4]詹洁， 余永昌， 何龙飞， 等. 一种优化的提取花生根尖细胞DNA的方法[J]. 花生学报， 2006， 35（3）： 10-13.
[5]谢皓， 陈学珍， 冯永庆， 等. 一种适于SSR-PCR的大豆叶片微量DNA简便提取方法[J]. 北京农学院学报， 2007， 22（1）： 62-64.
[6]陈静， 胡晓辉， 苗华荣， 等. CTAB法提取花生总DNA在SSR和SRAP中的扩增效果[J]. 花生学报， 2008， 37（1）： 29-31.
[7]Chu Y， Wu C L， Holbrook C C， et al. Marker-assisted selection to pyramid nematode resistance and the high oleic trait in peanut [J]. The Plant Genome， 2011， 4 （2）：110-117.
[8]Edwards K， Johnstone C， Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis [J]. Nucleic Acids Research， 1991， 19（6）： 1349.
[9]穆春华， 张发军， 李文才， 等. 玉米叶片基因组快速提取方法研究[J]. 玉米科学， 2010， 18（3）： 170-172.
[10]师丽红， 杨文香， 刘大群. 小麦基因组的一种简易提取方法[J]. 中国农学通报， 2010， 26（19）： 22-26.
[11]梁宏伟， 王长忠， 李忠， 等. 聚丙烯酰胺凝胶快速高效银染方法的建立[J]. 遗传， 2008， 30（10）： 1379-1382.山 东 农 业 科 学2014，46（7）：15～19Shandong Agricultural Sciences
关键词：花生；基因组DNA；提取方法；幼叶
中图分类号：S565.201文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0011-04
AbstractWith the young leaves of peanut as experiment material， four different DNA extraction methods， the high-throughput DNA extraction method， the simple SDS method， TPS method and TENP method， were compared and optimized. The results showed that， compared with the other improved methods， the improved TPS method had the advantages of grinding samples with no liquid nitrogen， faster extraction rate， fewer kinds of reagent， lower cost， rapider DNA solution rate and better DNA quality. The DNA extracted through improved TPS method could be used for SSR analysis of peanut.
Key wordsPeanut （Arachis hypogaea L.）；Genomic DNA；Extraction method；Young leaves
DNA是遗传信息的载体，DNA的提取是分子生物学研究的基础。植物总DNA的提取方法主要有CTAB法[1]、高盐低pH法[2，3]、SDS法[4]等。近年来，许多研究人员根据不同的植物和不同的试验要求对传统的DNA提取方法进行改进和创新，取得了较好的效果[5，6]，但这些方法存在步骤繁琐、有机溶剂残留导致污染以及对人体造成危害等缺点。
李庆云等[6]研究发现，从花生不同部位提取DNA时，叶片的DNA产率最高。本研究对花生、小麦、玉米等植物叶片的4种DNA提取方法[7～10]进行改进和创新，力求寻找一种DNA质量和纯度相对较好、可用于SSR分析的快速简便的花生DNA提取方法，用于花生的遗传多样性分析、遗传图谱构建及分子标记辅助选择等研究。
1材料与方法
1.1试验材料
以花生品种“四粒红”的叶片为材料，由山东省花生研究所提供。
1.2DNA提取方法
分别对高通量DNA提取法[7]、SDS简易法[8]、TPS法[9]以及TENP法[10]四种简便的DNA提取方法进行改良及优化，方法如下。
1.2.1改良高通量DNA提取法（1）取新鲜幼叶约0.05 g，剪为0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL的Buffer A（100 mmol/L NaOH，2%Tween-20），95℃水浴10 min。（3）12 000 r/min离心10 min，取上清加入等体积的Buffer B （100 mmol/L Tris-HCl， 2 mmol/L EDTA-Na2）混匀。（4）加入预冷的等体积无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。
1.2.2改良SDS简易法（1）取新鲜幼叶约0.05 g，剪为0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL DNA提取液，漩涡混匀5 s，95℃水浴10 min（提取液包含200 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5% SDS）。（3）12 000 r/min 离心10 min，取上清，加入等体积预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。
1.2.3改良TPS法（1）取新鲜幼叶约0.05 g，剪为0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL TPS缓冲液，漩涡混匀5 s，95℃水浴10 min （TPS缓冲液包含100 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA）。（3）12 000 r/min离心10 min，取上清液加入等体积预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。
1.2.4改良TENP法（1）新鲜幼叶约0.05 g，剪为0.1～0.8 cm的碎片，放入1.5 mL的EP管中，研磨棒研磨。（2）加入600 μL DNA提取液，漩涡混匀5 s，95℃水浴10 min （提取液包含100 mmol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl，50 mmol/L EDTA）。（3）12 000 r/min 离心10 min，取上清加入等体积预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，置-20℃冰箱中10 min，待析出沉淀，12 000 r/min离心5 min，弃去上清液，将DNA沉淀风干，加入200 μL TE溶解DNA。4℃保存或-20℃长期保存。 1.3DNA质量检测
用紫外分光光度计（BiophotometerRS232C，Eppendorf AG）测OD值。如果A260/A280值在1.8～2.0，表明提取的DNA质量和纯度较好，若比值小于1.8表示有蛋白质污染，大于2.0表明RNA含量较高。
DNA的电泳检测使用0.8%琼脂糖凝胶，上样缓冲液上样量为4 μL，120 V、电泳40 min。如果电泳后DNA谱带较多或连片，表明DNA分子已破碎或已降解，这样的DNA将无法用于PCR；反之，DNA为一条带，且距点样孔较近，则说明DNA完整。
1.4SSR分析及检测
SSR反应体系包含模板2 μL，2×PCR Master Mix 5 μL（包含Buffer，Taq酶，dNTPs，购自北京天根生化科技有限公司），正反引物各0.3 μL，ddH2O 2.4 μL。SSR分析热循环程序：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸45 s，5个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；94℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸45 s，30个循环；72℃延伸5 min；4℃保存。PCR扩增产物进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色[11]。
2结果与分析
2.1DNA提取方法的优化
本试验对4种不同的DNA提取方法进行了改良。①将原始的TPS法以及TENP法对材料的液氮处理改为研磨棒研磨。②改良后的TENP法中未添加RNase A。③在原始的高通量DNA提取法中增加了离心和无水乙醇沉淀的步骤。④将原始的SDS简易法、TENP法以及TPS法中加入DNA提取液后静置1 h、65℃温育40 min以及75℃水浴30 min处理均改为95℃水浴10 min。
改良之后大大缩短了整个试验过程。最后提取的DNA沉淀如图1所示，改良高通量DNA提取法最终得到半透明黄绿色胶状DNA；改良SDS简易法最终得到的DNA沉淀为含有大量叶绿素的绿色固体；改良TPS法最终得到半透明淡黄色胶状DNA；改良TENP法最后沉淀DNA为浅褐色片状固体。将DNA风干时发现，风干最快的是改良TPS法和改良TENP法提取的DNA，而改良高通量DNA提取法和改良SDS简易法所提DNA风干较慢，大约需要10 h以上。在之后的TE溶解DNA过程中，发现改良高通量DNA提取法和改良TPS法得到的胶状半透明DNA溶解最快，而改良SDS简易法和改良TENP法得到的绿色固体和褐色片状的DNA溶解慢，甚至有不溶的现象。
由于改良高通量法提取DNA含有部分叶绿素，风干速度慢，且A260/A280值小于1.8，存在蛋白质污染，琼脂糖凝胶电泳检测时无DNA条带，故排除此法。改良SDS所提取的DNA含有较多叶绿素、不易溶解、存在RNA污染，琼脂糖凝胶电泳存在DNA降解的问题，故也排除此法。改良TENP法提取的DNA较难溶解、A260/A280值大于2.0、琼脂糖电泳检测存在杂质污染的问题，故排除此法。改良TPS法提取的DNA溶解最快，A260/A280值接近2.0，琼脂糖电泳检测呈现一条谱带，且通过SSR分析可以获得理想的效果，故可作为一种较好的适用于SSR分析的花生叶片DNA快速提取方法。
3讨论
许多研究表明，健康的幼叶是试验的最佳样本来源。本研究选取新鲜的花生嫩叶，其中DNA含量相对较多，纤维素含量较少，易于提取，避免了较老叶片中含有的多糖、多酚等代谢物质对PCR反应的抑制作用。本研究对高通量DNA提取法、SDS简易法、TPS法以及TENP法4种不同的应用于其它植物的DNA提取方法进行改良，通过对DNA进行质量检测与SSR扩增验证，最终筛选出的最佳花生叶片提取方法为改良TPS法。其所提取的DNA具有良好的完整性，质量达到SSR分析的要求，可用于花生SSR分子标记分析。本方法具有以下优点：
（1）磨样简便。使用研磨棒直接在离心管中研磨，方便快捷，适用于少量DNA的提取，省去了对研钵清洗及再次灭菌的环节，避免了交叉污染，无需液氮，降低了成本。
（2）节约试剂。减少了β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、聚乙烯吡咯烷酮等的使用，避免了有机试剂对人体的危害，降低了试剂成本。
（3）用时短。避免反复抽提，省去了苯酚/氯仿和氯仿/异戊醇重复抽提的过程，仅通过提高提取液中的KCl浓度来沉淀蛋白质和阻止多酚等次生物质的氧化，达到去除蛋白质的目的[10]。同时升高水浴温度，缩短水浴时间，大大加快了提取速度。
由于提取步骤的简化，本提取方法也存在一些弊端。采用研磨棒磨样，可能会造成研磨不够彻底，有所浪费，且常温下磨样要快速进行。本方法得到的DNA对SSR标记分析没有影响，但其质量能否满足RFLP和AFLP等标记分析的需要，仍需进一步的试验。
参考文献：
[1]熊劲芳， 向育君， 张正奇. 花生总DNA的快速提取与纯化研究[J].生物学杂志， 2003， 20（2）： 32-34.
[2]苗晓燕， 贾晓梅. 药用植物虎杖毛状根DNA提取方法研究[J]. 保定学院学报， 2009， 22（4）： 67-69.
[3]Guillernsut P， Drouard L M. Isolation of plant DNA： A fast， inexpensive， and reliable method [J]. Plant Mol. Bio. Rep.， 1992， 10（1）： 60-65.
[4]詹洁， 余永昌， 何龙飞， 等. 一种优化的提取花生根尖细胞DNA的方法[J]. 花生学报， 2006， 35（3）： 10-13.
[5]谢皓， 陈学珍， 冯永庆， 等. 一种适于SSR-PCR的大豆叶片微量DNA简便提取方法[J]. 北京农学院学报， 2007， 22（1）： 62-64.
[6]陈静， 胡晓辉， 苗华荣， 等. CTAB法提取花生总DNA在SSR和SRAP中的扩增效果[J]. 花生学报， 2008， 37（1）： 29-31.
[7]Chu Y， Wu C L， Holbrook C C， et al. Marker-assisted selection to pyramid nematode resistance and the high oleic trait in peanut [J]. The Plant Genome， 2011， 4 （2）：110-117.
[8]Edwards K， Johnstone C， Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis [J]. Nucleic Acids Research， 1991， 19（6）： 1349.
[9]穆春华， 张发军， 李文才， 等. 玉米叶片基因组快速提取方法研究[J]. 玉米科学， 2010， 18（3）： 170-172.
[10]师丽红， 杨文香， 刘大群. 小麦基因组的一种简易提取方法[J]. 中国农学通报， 2010， 26（19）： 22-26.
[11]梁宏伟， 王长忠， 李忠， 等. 聚丙烯酰胺凝胶快速高效银染方法的建立[J]. 遗传， 2008， 30（10）： 1379-1382.山 东 农 业 科 学2014，46（7）：15～19Shandong Agricultural Sciences