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[摘要] 肝豆状核变性(WD)是一种铜转运障碍的常染色体隐性遗传病，铜异常沉积而致多脏器损伤。WD是由ATP7B基因突变引起的，本文通过回顾肝豆状核变性诊断的新进展．为进一步诊断WD提出可能方法。
关键词:肝豆状核变性；基因突变；ATP7B
中图分类号： R-33 文献标识码：A 文章编号：1004-7484（2012）06-0105-03
[Abstract] Wilson disease(WD)，an autosomal recessive disorder of copper transport，Copper abnormally deposit on organ and made it damaged．Mutations in theATP7B gene are responsible for WD , The article reviews the diagnosis advancement in treating wilson disease in order to propose potential diagnose approach．
[Key words] Wilson disease；Gene mutation；ATPTB
肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson's disease，WD)，是一种因铜代谢异常导致铜离子体内蓄积，进而造成组织器官铜中毒的常染色体隐性遗传性疾病，其致病基因是ATP7B，WD多见于青少年，世界范围内其发病率为1／100000至1/300000[1-2]。WD发病隐匿，常以肝硬化、豆状核变性和角膜K-F环为临床特征。病程进展缓慢，临床表现多样。
ATP7B基因特点：
WD的致病基因ATP7B， ATP7B基因最早是在1993年被克隆出来的，它位于染色体13q14.3上，正是ATP7B突变造成人体内铜转运异常，从而导致WD的发生[3]。
ATP7B长度为100kb,包含21个外显子和20个内含子[4-5]，它通过编码P型铜转运ATP酶（由1411个氨基酸组成）来参与铜离子的跨膜转运，N-端含铜结合位点，ATP7B的突变可造成铜蓝蛋白合成障碍及铜离子的胆汁代谢障碍，从而引起人体内铜转运异常，最终导致WD的发生[6]。ATP7B突变类型包括错义、无义、缺失、插入、置换和剪接等突变等。根据欧亚地区的统计结果，最常见的突变类型是14号外显子的Hisl069Gln错义突变和8号外显子的Ar9778Leu错义突变。而临床见到的多为杂合子突变，极少数为纯合子突变，且多为点突变。
有些肝豆状核变性患者未能检出ATP7B突变，推测其原因可能是：（1）尽管目前的研究已涉及等位基因的内含子和外显子的边缘区域，但是仍有可能ATP7B基因的某种突变尚未被发现；（2）可能存在某种分子生物学机制影响影响了ATP7B基因的表达[7]。
目前所知的ATP7B调控因子有很多，例如ATOX1、MURR1、XLAP、ApoE、FKBP52等，下面分别予以介绍：
（1）ATOX1蛋白由68个氪基酸残基构成，walker等证明：ATOX1和铜离子结合，然后将铜离子转运至ATP7B，从而增强ATP7B的活性，同时处于游离状态的ATOX1也可竞争性地抑制A1P7B和铜离子结合，从而降低A1P7B的活性[8]。
（2）MURR1基因位于染色体2p13-16，开始人们认为它是非WD性铜中毒性疾病的致病基因，如地方性提洛尔婴儿铜中毒及原发性铜中毒。但目前这一结论尚处于争论中。MURR1广泛表达于人体多种组织器官中，通过近年来的研究，人们倾向于MURR1是人体内铜稳态的一种重要调节因素，Tao等[9]证实:MURR1作用A1P7B的N端铜离子结合位点，参与了铜离子的肝代谢途径。
（3）XLAP首先是以抗凋亡作用被人们所认识的，随着研究的深入，人们发现XLAP能反向调节MURR1的水平，它在组织中表达的缺失能使铜离子水平降低[10]。
（4）ApoE是一种血浆糖蛋白，其基因位于染色体19q32.2。它的生物学作用主要是通过与铜离子的强亲和力，从而发挥其抗氧化作用，尤其是在神经系统表现明显。WD致使铜离子在体内浓度升高，进而通过自由基的氧化作用引起组织损伤。ApoE的抗WD作用引起了人们的关注，ApoE更多的作用机理有待于人们的揭示。
（5）FKBP52是通过与A1DXl的相互作用而对ATP7B起调控作用的，另外FKBP52也有可能是铜离子的伴侣分子。
WD的基因诊断：
目前WD的临床诊断主要依赖以下几条标准：（1）肝脏和神经系统损害表现；（2）血清铜蓝蛋白降低；（3）角膜K-F环阳性。但临床实践证明，大部分WD患者在发病早期并无上述的特征性改变。而事实上WD如能被早发现早诊断早治疗，大多预后良好。反之，如诊断和治疗被延误，则病情难以逆转，甚至危及生命。随着分子生物学技术的发展，WD的基因诊断应运而生，WD的基因诊断能及时筛检病例，准确率高，特异性强，具有较大的临床应用前景。目前已知的WD基因诊断方法有：RFLP/STR/SNP-家系连锁分析法、PCR-SSCP分析法、PCR-酶切分析法、荧光PCR技术分析法、DNA测序技术、DNA微阵列技术。下面予以分别介绍：
（1）RFLP/STR/SNP-家系连锁分析法：它是现对WD家系进行DNA遗传标记连锁分析检测，确定基因型后再分析得出诊断结果。显然这种方法操作复杂，效率低，不能对无WD家族史的可疑病例进行实施。
（2）PCR-酶切分析法、荧光PCR分析法及PCR-SSCP分析法、：无论利用限制性内切酶对已知的突变位点进行酶切分析，还是利用荧光标记及构象分析，它们的核心技术都是PCR，所以这些分析方法易出现假阳性结果，且只能对已知突变位点进行筛检。
（3）DNA测序技术：目前的DNA测序已经做到了准确、迅速、高通量，所以这种方法是进行WD检测的最佳方法，它准确可靠，其诊断结果可作为金标准，但这种方法技术要求高，普通医院难以实现。
（4）DNA微阵列技术：目前人们已经开发了几十种针对WD基因突变的DNA微阵列芯片，可以对多个突变位点及多态位点进行检测，但这种检测手段费用昂贵，难以在临床普及。
WD的临床学研究：
WD以发病隐匿，病程长，临床表现多变为特点，大量的临床资料统计后发现，半数以上的病例没有典型的临床表现。基于上述原因，Ferenci等[11]设计了HLD综合评分系统（详见表2），它依据的症状学指标为美国肝脏疾病研究学会（AASLD）所制定（详见表1）。
展望
WD作为一种遗传性疾病，对它的早期诊断是当今研究的重点，目前尚无一种简单易行的诊断金标准，相信日后这个金标准应在基因水平去寻找。随着分子生物学技术的发展，对WD发病机理的认识也将越来越深入，人们突破这一诊断上的“瓶颈”是完全有可能的。
参考文献
[1] Dedoussis GV，Genschel J，Sialvera TE，et a1．wilson disease：high prevalance in a mountainous area of Crete[J]．Ann Hum Genet,2005,69(pt3):268～74．
[2] Dhawan A，Ferenci P，GeubeI A，et aI．Genes and metaIs：a deadly combination[J]．Acta Gastroenterol Belg,2005,68(1):26～32．
[3] Ala A, Schilsky ML．Wilson disease：pathophysiology, diagnosis, treatment, and screening[J] ．Clin Liver Dis, 2004,8(4) ：787～805．
[4] Tanzi RE，Petrukhin K，Chemov I，et a1．The Wilson disease gene is a copper transporting ATPase with homology to the Menkes disease gene．Nat Genet,1993,5(4)：344～50．
[5] Kenney SM，Cox DW．Sequence variation database for the Wilson disease copper transporter，ATP7B．Hum Mutat,2007,28(12)：117I～7．
[6] Ala A, Schilsky ML. Wilson disease: pathophysiology, diagnosis, treatment, and screening[J]. Clin Liver Dis,2004,8(4): 787～805．
[7] Brage A，Tome S，Garela A，et a1．Clinical and molecular characterization
of wilson disease in Spanish patients．Hepatol Res,2007,37(7)：18～26．
[8] Walker JM, Tsivkovski R, Lutsenko S. Metallochaperone Atox1 transfers copper to the NH2-terminal domain of the Wilson‘ s disease protain and regulates its catalytic activity[J]. J Biol Chem, 2002,277(31): 27953～9．
[9] Tao TY, Liu F, Klomp L, et al. The copper toxicosis gene product Murr1 directly interacts with the Wilson disease protein[J]. J Biol Chem, 2003,278(43): 41593～6．
[10] Burstein E, Ganesh L, Dick RD, et al. A novel role for XIAP in copper homeostasis through regulation of MURR1[J].EMBO J,2004,23(1):245～54．
[11] Ferenci P, Caca K, Loudianos G, et a1. Diagnosis and pheno-typic classification of Wilson disease. Liver Inter,2003,23:139～142．
关键词:肝豆状核变性；基因突变；ATP7B
中图分类号： R-33 文献标识码：A 文章编号：1004-7484（2012）06-0105-03
[Abstract] Wilson disease(WD)，an autosomal recessive disorder of copper transport，Copper abnormally deposit on organ and made it damaged．Mutations in theATP7B gene are responsible for WD , The article reviews the diagnosis advancement in treating wilson disease in order to propose potential diagnose approach．
[Key words] Wilson disease；Gene mutation；ATPTB
肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson's disease，WD)，是一种因铜代谢异常导致铜离子体内蓄积，进而造成组织器官铜中毒的常染色体隐性遗传性疾病，其致病基因是ATP7B，WD多见于青少年，世界范围内其发病率为1／100000至1/300000[1-2]。WD发病隐匿，常以肝硬化、豆状核变性和角膜K-F环为临床特征。病程进展缓慢，临床表现多样。
ATP7B基因特点：
WD的致病基因ATP7B， ATP7B基因最早是在1993年被克隆出来的，它位于染色体13q14.3上，正是ATP7B突变造成人体内铜转运异常，从而导致WD的发生[3]。
ATP7B长度为100kb,包含21个外显子和20个内含子[4-5]，它通过编码P型铜转运ATP酶（由1411个氨基酸组成）来参与铜离子的跨膜转运，N-端含铜结合位点，ATP7B的突变可造成铜蓝蛋白合成障碍及铜离子的胆汁代谢障碍，从而引起人体内铜转运异常，最终导致WD的发生[6]。ATP7B突变类型包括错义、无义、缺失、插入、置换和剪接等突变等。根据欧亚地区的统计结果，最常见的突变类型是14号外显子的Hisl069Gln错义突变和8号外显子的Ar9778Leu错义突变。而临床见到的多为杂合子突变，极少数为纯合子突变，且多为点突变。
有些肝豆状核变性患者未能检出ATP7B突变，推测其原因可能是：（1）尽管目前的研究已涉及等位基因的内含子和外显子的边缘区域，但是仍有可能ATP7B基因的某种突变尚未被发现；（2）可能存在某种分子生物学机制影响影响了ATP7B基因的表达[7]。
目前所知的ATP7B调控因子有很多，例如ATOX1、MURR1、XLAP、ApoE、FKBP52等，下面分别予以介绍：
（1）ATOX1蛋白由68个氪基酸残基构成，walker等证明：ATOX1和铜离子结合，然后将铜离子转运至ATP7B，从而增强ATP7B的活性，同时处于游离状态的ATOX1也可竞争性地抑制A1P7B和铜离子结合，从而降低A1P7B的活性[8]。
（2）MURR1基因位于染色体2p13-16，开始人们认为它是非WD性铜中毒性疾病的致病基因，如地方性提洛尔婴儿铜中毒及原发性铜中毒。但目前这一结论尚处于争论中。MURR1广泛表达于人体多种组织器官中，通过近年来的研究，人们倾向于MURR1是人体内铜稳态的一种重要调节因素，Tao等[9]证实:MURR1作用A1P7B的N端铜离子结合位点，参与了铜离子的肝代谢途径。
（3）XLAP首先是以抗凋亡作用被人们所认识的，随着研究的深入，人们发现XLAP能反向调节MURR1的水平，它在组织中表达的缺失能使铜离子水平降低[10]。
（4）ApoE是一种血浆糖蛋白，其基因位于染色体19q32.2。它的生物学作用主要是通过与铜离子的强亲和力，从而发挥其抗氧化作用，尤其是在神经系统表现明显。WD致使铜离子在体内浓度升高，进而通过自由基的氧化作用引起组织损伤。ApoE的抗WD作用引起了人们的关注，ApoE更多的作用机理有待于人们的揭示。
（5）FKBP52是通过与A1DXl的相互作用而对ATP7B起调控作用的，另外FKBP52也有可能是铜离子的伴侣分子。
WD的基因诊断：
目前WD的临床诊断主要依赖以下几条标准：（1）肝脏和神经系统损害表现；（2）血清铜蓝蛋白降低；（3）角膜K-F环阳性。但临床实践证明，大部分WD患者在发病早期并无上述的特征性改变。而事实上WD如能被早发现早诊断早治疗，大多预后良好。反之，如诊断和治疗被延误，则病情难以逆转，甚至危及生命。随着分子生物学技术的发展，WD的基因诊断应运而生，WD的基因诊断能及时筛检病例，准确率高，特异性强，具有较大的临床应用前景。目前已知的WD基因诊断方法有：RFLP/STR/SNP-家系连锁分析法、PCR-SSCP分析法、PCR-酶切分析法、荧光PCR技术分析法、DNA测序技术、DNA微阵列技术。下面予以分别介绍：
（1）RFLP/STR/SNP-家系连锁分析法：它是现对WD家系进行DNA遗传标记连锁分析检测，确定基因型后再分析得出诊断结果。显然这种方法操作复杂，效率低，不能对无WD家族史的可疑病例进行实施。
（2）PCR-酶切分析法、荧光PCR分析法及PCR-SSCP分析法、：无论利用限制性内切酶对已知的突变位点进行酶切分析，还是利用荧光标记及构象分析，它们的核心技术都是PCR，所以这些分析方法易出现假阳性结果，且只能对已知突变位点进行筛检。
（3）DNA测序技术：目前的DNA测序已经做到了准确、迅速、高通量，所以这种方法是进行WD检测的最佳方法，它准确可靠，其诊断结果可作为金标准，但这种方法技术要求高，普通医院难以实现。
（4）DNA微阵列技术：目前人们已经开发了几十种针对WD基因突变的DNA微阵列芯片，可以对多个突变位点及多态位点进行检测，但这种检测手段费用昂贵，难以在临床普及。
WD的临床学研究：
WD以发病隐匿，病程长，临床表现多变为特点，大量的临床资料统计后发现，半数以上的病例没有典型的临床表现。基于上述原因，Ferenci等[11]设计了HLD综合评分系统（详见表2），它依据的症状学指标为美国肝脏疾病研究学会（AASLD）所制定（详见表1）。
展望
WD作为一种遗传性疾病，对它的早期诊断是当今研究的重点，目前尚无一种简单易行的诊断金标准，相信日后这个金标准应在基因水平去寻找。随着分子生物学技术的发展，对WD发病机理的认识也将越来越深入，人们突破这一诊断上的“瓶颈”是完全有可能的。
参考文献
[1] Dedoussis GV，Genschel J，Sialvera TE，et a1．wilson disease：high prevalance in a mountainous area of Crete[J]．Ann Hum Genet,2005,69(pt3):268～74．
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[3] Ala A, Schilsky ML．Wilson disease：pathophysiology, diagnosis, treatment, and screening[J] ．Clin Liver Dis, 2004,8(4) ：787～805．
[4] Tanzi RE，Petrukhin K，Chemov I，et a1．The Wilson disease gene is a copper transporting ATPase with homology to the Menkes disease gene．Nat Genet,1993,5(4)：344～50．
[5] Kenney SM，Cox DW．Sequence variation database for the Wilson disease copper transporter，ATP7B．Hum Mutat,2007,28(12)：117I～7．
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of wilson disease in Spanish patients．Hepatol Res,2007,37(7)：18～26．
[8] Walker JM, Tsivkovski R, Lutsenko S. Metallochaperone Atox1 transfers copper to the NH2-terminal domain of the Wilson‘ s disease protain and regulates its catalytic activity[J]. J Biol Chem, 2002,277(31): 27953～9．
[9] Tao TY, Liu F, Klomp L, et al. The copper toxicosis gene product Murr1 directly interacts with the Wilson disease protein[J]. J Biol Chem, 2003,278(43): 41593～6．
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