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【摘要】:目的:建立维C银翘片微生物限度检查方法｡方法:按《中国药典》2005版的要求[1],通过接种代表性的阳性菌株,用常规法､稀释法及薄膜过滤法对五株阳性菌株进行回收率测定｡结果: 该样品具有一定的抑菌活性, 用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液每筒冲洗400mL(分四次),可以消除样品的抑菌活性作用｡结论:本样品细菌数需采用薄膜过滤法进行测定､霉菌数和酵母菌数可采用稀释法进行测定､控制菌大肠埃希菌采用常规法法进行检查｡
【关键词】:维C银翘片 微生物限度检查 回收率 冲洗量 方法学验证
【中图分类号】R286.0 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8517(2008)07-0044-02
维C银翘片具有辛凉解表,清热解毒的功能[2]｡临床用于流行性感冒引起的发热头痛､咳嗽､口干､咽喉疼痛｡当建立药品的微生物限度检查法时,应进行方法的验证,以确认所采用的方法适合于该药品的细菌､霉菌及酵母菌数的测定及控制菌检查[3]｡本文通过接种代表性的五株阳性菌株,采用常规法､稀释法､薄膜过滤法进行微生物限度检查方法学验证实验,为该样品建立了微生物限度检查方法｡
1仪器与材料
1.1仪器HTY-2000A集菌仪(杭州高得医疗器械有限公司);开放式集菌器(北京牛牛基因技术有限公司,批号:20051005)｡
1.2样品维C银翘片(云南雄业制药有限公司,规格/片,批号050301 050401 050412)
1.3 培养基和试剂硫乙醇酸盐液体培养基(批号, 040212), 改良马丁液体培养基(批号,0507062), 改良马丁琼脂培养基(批号,050520), 玫瑰红钠琼脂培养基(批号,030710), 营养肉汤培养基(批号,050508), 营养琼脂培养基(批号,050328),胆盐乳糖增培养基(批号,0504192),北京三药科技开发公司｡
1.4菌种大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(F)44102]､枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]､金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]､白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]､黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003](中国药品生物制品检定所提供)
2方法
按中国药典2005版一部微生物限度检查法(附录XⅢ C)[4]进行实验｡
2.1菌液制备取经34℃培养18~24h,大肠埃希菌､金黄色葡萄球菌､枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1mL,加入9mL0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-5~10-7备用;取经24℃培养18~24h的白色念珠菌液体培养物1mL,加入9mL0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-6备用;取经培养一周的黑曲霉菌斜面物,加0.9%氯化钠溶液3mL,洗下孢子,转移至另一空管,标准比浊后,取1mL加入0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10-4备用｡
2.2 菌液的检验取上述金黄色葡萄球菌､枯草杆菌､大肠埃希菌10-5~10-7稀释液各1ml,用45℃营养琼脂培养基20ml注皿, 各平行测定两皿,30~35℃培養48小时, 计数, 应约为50~100cfu/ml;取上述白色念珠菌10-5~10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1ml,用45℃玫瑰红钠琼脂培养基20ml注皿, 各平行测定两皿,23~28℃培养, 逐日观察计数, 应约为50~100cfu/ml｡结果见表1｡
2.3供试液制备取样品10mg,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,用匀浆议混匀,作为1:10的供试液｡
2.4 回收率的测定
2.4.1 细菌数霉菌数常规法测定试验组:取1:10供试液1ml､50~100cfu试验菌同时加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果｡菌液组:测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)｡
供试品对照组:取1:10供试液1ml加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果,测定供试品本底菌数
2.4.2 细菌数霉菌数稀释法测定试验组: 取1: 10供试液0.2ml/皿､50~100cfu 试验菌同时加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果｡
菌液组:测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)｡
2.4.3 细菌数霉菌数薄膜过滤法测定取1:10的供试液1ml,注入开放式滤器(先用少量缓冲液润湿滤器),用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每次100ml共4次(每次充分振摇滤器,总冲洗400ml),留有少量缓冲液加1ml(50~100cfu) 试验菌混匀, 抽干后, 取出滤膜菌面朝上贴入规定琼脂平板培养基中,置规定温度培养48小时,结果见表2
2.5 回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率:试验组的加菌回收率=试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数×100%
2.6 控制菌检查方法的验证2.6.1 常规法:取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml,置35℃培养24小时;取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基,同时加入金黄色葡萄球菌液1ml,置35℃培养24小时,作为阴性菌对照组｡另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml, 置35℃培养24小时; 取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24小时,作为阴性对照｡
3结果与讨论
讨论: 从表2､表3知: 常规法对大肠埃希菌､白色念珠菌､黑曲霉回收率高于70%,对金黄色葡萄球菌回收率底于70%,对枯草杆菌回收率为0;稀释法对金黄色葡萄球菌､白色念珠菌､黑曲霉､大肠埃希菌回收率均高于70%,对枯草杆菌回收率还是为0,说明采用稀释法还不能消除样品的抑菌活性牷薄膜过滤法对5株阳性试验菌株回收率均达到了100%,采用薄膜过滤法可以消除该供试品的抑菌活性｡
4结论
本样品通过接种5株阳性试验菌株进行方法学验证,通过进行三次平行实验,验证了其方法的有效性和可靠性,建立了维C银翘片微生物限度检查的方法: 细菌数需采用薄膜过滤法(用2.6.1 常规法:取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml,置35℃培养24小时;取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基,同时加入金黄色葡萄球菌液1ml,置35℃培养24小时,作为阴性菌对照组｡另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml, 置35℃培养24小时; 取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24小时,作为阴性对照｡
3结果与讨论
讨论: 从表2､表3知: 常规法对大肠埃希菌､白色念珠菌､黑曲霉回收率高于70%,对金黄色葡萄球菌回收率底于70%,对枯草杆菌回收率为0;稀釋法对金黄色葡萄球菌､白色念珠菌､黑曲霉､大肠埃希菌回收率均高于70%,对枯草杆菌回收率还是为0,说明采用稀释法还不能消除样品的抑菌活性牷薄膜过滤法对5株阳性试验菌株回收率均达到了100%,采用薄膜过滤法可以消除该供试品的抑菌活性｡pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液每筒冲洗400mL)进行测定､霉菌数和酵母菌数可采用稀释法进行测定､控制菌大肠埃希菌采用常规法法进行检查｡
参考文献
[1]中国药典2005年版[S].一部.2005,附录70.
[2]国家中成药汇编[S].中成药地方标准上升国家标准部分内科肺系(一)分册,271.
[3]中国药典2005年版[S].一部.2005,附录71.
[4]中国药典2005年版[S].一部.2005,附录70.
(收稿日期:2008.4.19)
【关键词】:维C银翘片 微生物限度检查 回收率 冲洗量 方法学验证
【中图分类号】R286.0 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8517(2008)07-0044-02
维C银翘片具有辛凉解表,清热解毒的功能[2]｡临床用于流行性感冒引起的发热头痛､咳嗽､口干､咽喉疼痛｡当建立药品的微生物限度检查法时,应进行方法的验证,以确认所采用的方法适合于该药品的细菌､霉菌及酵母菌数的测定及控制菌检查[3]｡本文通过接种代表性的五株阳性菌株,采用常规法､稀释法､薄膜过滤法进行微生物限度检查方法学验证实验,为该样品建立了微生物限度检查方法｡
1仪器与材料
1.1仪器HTY-2000A集菌仪(杭州高得医疗器械有限公司);开放式集菌器(北京牛牛基因技术有限公司,批号:20051005)｡
1.2样品维C银翘片(云南雄业制药有限公司,规格/片,批号050301 050401 050412)
1.3 培养基和试剂硫乙醇酸盐液体培养基(批号, 040212), 改良马丁液体培养基(批号,0507062), 改良马丁琼脂培养基(批号,050520), 玫瑰红钠琼脂培养基(批号,030710), 营养肉汤培养基(批号,050508), 营养琼脂培养基(批号,050328),胆盐乳糖增培养基(批号,0504192),北京三药科技开发公司｡
1.4菌种大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(F)44102]､枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]､金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]､白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]､黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003](中国药品生物制品检定所提供)
2方法
按中国药典2005版一部微生物限度检查法(附录XⅢ C)[4]进行实验｡
2.1菌液制备取经34℃培养18~24h,大肠埃希菌､金黄色葡萄球菌､枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1mL,加入9mL0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-5~10-7备用;取经24℃培养18~24h的白色念珠菌液体培养物1mL,加入9mL0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-6备用;取经培养一周的黑曲霉菌斜面物,加0.9%氯化钠溶液3mL,洗下孢子,转移至另一空管,标准比浊后,取1mL加入0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10-4备用｡
2.2 菌液的检验取上述金黄色葡萄球菌､枯草杆菌､大肠埃希菌10-5~10-7稀释液各1ml,用45℃营养琼脂培养基20ml注皿, 各平行测定两皿,30~35℃培養48小时, 计数, 应约为50~100cfu/ml;取上述白色念珠菌10-5~10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1ml,用45℃玫瑰红钠琼脂培养基20ml注皿, 各平行测定两皿,23~28℃培养, 逐日观察计数, 应约为50~100cfu/ml｡结果见表1｡
2.3供试液制备取样品10mg,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,用匀浆议混匀,作为1:10的供试液｡
2.4 回收率的测定
2.4.1 细菌数霉菌数常规法测定试验组:取1:10供试液1ml､50~100cfu试验菌同时加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果｡菌液组:测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)｡
供试品对照组:取1:10供试液1ml加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果,测定供试品本底菌数
2.4.2 细菌数霉菌数稀释法测定试验组: 取1: 10供试液0.2ml/皿､50~100cfu 试验菌同时加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果｡
菌液组:测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)｡
2.4.3 细菌数霉菌数薄膜过滤法测定取1:10的供试液1ml,注入开放式滤器(先用少量缓冲液润湿滤器),用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每次100ml共4次(每次充分振摇滤器,总冲洗400ml),留有少量缓冲液加1ml(50~100cfu) 试验菌混匀, 抽干后, 取出滤膜菌面朝上贴入规定琼脂平板培养基中,置规定温度培养48小时,结果见表2
2.5 回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率:试验组的加菌回收率=试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数×100%
2.6 控制菌检查方法的验证2.6.1 常规法:取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml,置35℃培养24小时;取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基,同时加入金黄色葡萄球菌液1ml,置35℃培养24小时,作为阴性菌对照组｡另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml, 置35℃培养24小时; 取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24小时,作为阴性对照｡
3结果与讨论
讨论: 从表2､表3知: 常规法对大肠埃希菌､白色念珠菌､黑曲霉回收率高于70%,对金黄色葡萄球菌回收率底于70%,对枯草杆菌回收率为0;稀释法对金黄色葡萄球菌､白色念珠菌､黑曲霉､大肠埃希菌回收率均高于70%,对枯草杆菌回收率还是为0,说明采用稀释法还不能消除样品的抑菌活性牷薄膜过滤法对5株阳性试验菌株回收率均达到了100%,采用薄膜过滤法可以消除该供试品的抑菌活性｡
4结论
本样品通过接种5株阳性试验菌株进行方法学验证,通过进行三次平行实验,验证了其方法的有效性和可靠性,建立了维C银翘片微生物限度检查的方法: 细菌数需采用薄膜过滤法(用2.6.1 常规法:取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml,置35℃培养24小时;取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基,同时加入金黄色葡萄球菌液1ml,置35℃培养24小时,作为阴性菌对照组｡另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml, 置35℃培养24小时; 取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24小时,作为阴性对照｡
3结果与讨论
讨论: 从表2､表3知: 常规法对大肠埃希菌､白色念珠菌､黑曲霉回收率高于70%,对金黄色葡萄球菌回收率底于70%,对枯草杆菌回收率为0;稀釋法对金黄色葡萄球菌､白色念珠菌､黑曲霉､大肠埃希菌回收率均高于70%,对枯草杆菌回收率还是为0,说明采用稀释法还不能消除样品的抑菌活性牷薄膜过滤法对5株阳性试验菌株回收率均达到了100%,采用薄膜过滤法可以消除该供试品的抑菌活性｡pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液每筒冲洗400mL)进行测定､霉菌数和酵母菌数可采用稀释法进行测定､控制菌大肠埃希菌采用常规法法进行检查｡
参考文献
[1]中国药典2005年版[S].一部.2005,附录70.
[2]国家中成药汇编[S].中成药地方标准上升国家标准部分内科肺系(一)分册,271.
[3]中国药典2005年版[S].一部.2005,附录71.
[4]中国药典2005年版[S].一部.2005,附录70.
(收稿日期:2008.4.19)