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摘要 [目的]通过对肋柱花花粉不同培养条件和测定方法进行研究，筛选出适宜花粉萌发的条件，找出简单快速测定肋柱花花粉活力方法。[方法]采用离体萌发法对不同浓度蔗糖、硼酸及培养温度下花粉萌发率进行研究，并通过醋酸洋红染色法、TTC染色法及I2-KI染色法对花粉活力进行测定。[结果]肋柱花花粉在蔗糖浓度为15%、硼酸浓度为100 mg/L、温度为25 ℃培养下，花粉萌发率达最大值，超过此条件萌发率下降。与醋酸洋红法和 TTC 法相比，I2-KI 染色法的测定结果与离体培养萌发法结果相近。[结论]适宜肋柱花花粉萌发的培养条件为15%蔗糖+100 mg/L硼酸，温度为25 ℃；I2-KI 染色法可作为肋柱花花粉活力快速测定的最佳方法。
关键词 肋柱花；花粉萌发；蔗糖；硼酸；花粉活力
中图分类号 S567.21+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0127-03
Comparison on Pollen Germination and Viability Determination Method of Lomatogonium rotatum
LI Xu-xin1， BA Gen-na2，YANG Heng-shan1 et al
（1.College of Agronomy， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao，Inner Mongolia 028042；2.College of Mongolia Medicine，Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao，Inner Mongolia 028042）
Abstract [Objective] The optimum conditions of Lomatogonium rotatum of pollen germination were studied by selecting different culture conditions and determination methods， and find a simple and rapid method to determine the pollen viability of Lomatogonium rotatum. [Methods]The germination rate of pollen germination at different concentrations of sucrose， boric acid and culture temperature was studied by in vitro germination method. The pollen viability was determined by carmine acetate staining method， TTC staining and I2-KI staining.[Result] The pollen germination rate reached the maximum at the concentration of 15% sucrose，100 mg/L boric acid and 25 ℃ culture condition， and above this condition，the germination rate decreased.Compared with carmine acetate staining method and TTC method， the determination results of I2-KI staining and in vitro germination method were similar.[Conclusion]The optimum conditions for the pollen germination were 15% sucrose+100 mg/L boric acid，the temperature is 25 ℃.I2-KI staining method can be used as the best method for rapid determination of pollen viability.
Key words Lomatogonium rotatum；Pollen germination；Sucrose；Boric acid；Pollen viability
肋柱花（Lomatogonium rotatum），別名哈比日根-地格达，属于一年生野生草本植物，为龙胆科肋柱花[Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym.]的干燥全草，主要用于协日热、瘟疫、流感、肝胆热、黄疸等病症[1]，其根、全草、叶、花中均含有齐敦果酸（oleanolic acid）[2]，具有降低转氨酶作用，对病毒性肝炎有显著治疗作用。在我国内蒙古、黑龙江、河北等地的灌丛草甸、河滩草地、高山草甸等有零星分布，但生长期短且较慢，目前临床上所使用肋柱花药源全部采自野生植株，由于其为全草入药，采集者往往将正处于花期的整株挖走，而留下的植株多数在种子未成熟时在草原秋季打草（8月中旬）时连同草也一起被割走，草地上存留的肋柱花种子很少，这导致其种群个体数量急剧下降，资源越来越少。关于肋柱花的研究主要在提取工艺[1，3-4]和化学成分[5-6]等方面，而花粉萌发方面鲜见报道。花粉活力对植物育种工作具有重要的作用，筛选适宜的花粉活力测定方法，这对提高植物繁殖效率具有重要的指导作用。该试验以肋柱花花粉为材料，研究不同蔗糖、硼酸浓度及培养温度对肋柱花花粉萌发的影响，试图筛选出适宜花粉萌发的培养条件，并通过不同染色方法对花粉活力进行测定，找出简单快速测定花粉活力的方法，进一步为肋柱花有效繁殖和育种工作提供理论指导。 1 材料与方法
1.1 试验材料
2016年8月中旬将采集的肋柱花植株花序放在硫酸纸上，待花粉从花药内散出后，将花粉装入纸形管中用于试验。
1.2 试验方法
1.2.1 蔗糖浓度试验。
采用培养基法对花粉进行萌发试验。在100 mL蒸馏水内加入1 g琼脂后，再分别添加不同浓度蔗糖（5%、10%、15%、20%），以不加蔗糖为对照（CK）。共同置于烧杯中加热煮沸，使琼脂和蔗糖充分溶解于水中，之后用玻璃棒蘸少量培养基于载玻片上，放置片刻使其冷凝作为播种花粉的发芽床。用毛笔蘸少量花粉，轻轻散落培养基表面，每一视野（10×10）中分布有100～200粒花粉为宜。将载玻片放于培养皿内，置于25 ℃光照培养箱内进行培养。每一处理设3次重复，每个重复观察4个视野，每个视野不少于100粒花粉，7 h后观察并统计花粉萌发数。花粉萌发的标准以花粉管伸长长度超过花粉粒直径为准，计算萌发率。花粉萌发率=（花粉萌发数/花粉总数）×100%。
1.2.2 硼酸浓度试验。
利用“1.2.1”筛选出的蔗糖浓度，在培养基中分别添加不同浓度硼酸（50、100、200、300 mg/L），以不加硼酸为对照（CK），按“1.2.1”蔗糖培养方法进行培养、观察和统计，筛选适宜肋柱花花粉萌发的硼酸浓度。
1.2.3 温度对花粉萌发的影响。
利用“1.2.1”和“1.2.2”中筛选出的蔗糖和硼酸浓度，分别将花粉在15、20、25、30、35 ℃进行培养，观察花粉萌发情况，计算花粉萌发率。
1.2.4 不同测定方法下花粉活力比较。
（1）氯化三苯基四氮唑（ TTC）染色法[7]。取少量花粉放在载玻片上，加1～2滴TTC溶液，盖上盖玻片后将制完的片子放入培养皿内，置于35 ℃光照培养箱内暗培养，20 min后观察花粉染色情况。染成红色的花粉活力较强，无色的为不具有活力花粉。
（2）I2-KI染色法[7]。取少量花粉放在载玻片上，再加1～2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片在显微镜下观察，凡被染成蓝色的表示花粉具有生活力，呈黄褐色的为无活力花粉。
（3）醋酸洋红染色法[8]。取少量花粉放在载玻片上，滴上 1～2 滴醋酸洋红，盖上盖玻片在显微镜下观察。凡是被染成红色的花粉粒则为有活力。
（4）离体萌发法。利用“1.2.1”筛选出的蔗糖浓度，将花粉播种在培养基上，于25 ℃光照培养箱内进行培养，观察花粉萌发情况。
以上染色方法每一处理设3次重复，每个重复观察4个视野，每个视野不少于100粒花粉，统计花粉活力。花粉活力=花粉染色总数/观察花粉总数×100%。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理和绘图，采用 SPSS 13.0 分析软件对数据进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 不同蔗糖浓度对肋柱花花粉萌发的影响
从图1可看出，在蔗糖浓度为0（CK）～15%时，花粉萌发率呈逐渐升高的变化趋势，其中在蔗糖浓度为15%时，肋柱花花粉萌发率达83.97%，显著高于对照（P<0.05），为对照的2.56倍；蔗糖浓度超过15%时，花粉萌发率开始下降。因此，肋柱花花粉萌发适宜的蔗糖浓度为15%。
2.2 不同硼酸浓度对肋柱花花粉萌发的影响
从图2可以看出，不同硼酸浓度培养下，肋柱花花粉萌发率有一定差异。硼酸浓度在0（CK）～100 mg/L时，随着浓度的增加，肋柱花花粉萌发率呈逐渐升高的变化，其中硼酸浓度达100 mg/L时，花粉萌发率达到最大值，为89.98%，显著高于对照12417%（P<0.05），浓度超过100 mg/L时，花粉萌发率开始下降。当硼酸浓度为300 mg/L时，花粉萌发率显著低于对照（P<0.05），比对照下降了46.86%。因此，硼酸浓度为100 mg/L最适宜肋柱花的花粉萌发。
2.3 不同培养温度对花粉萌发的影响
由图3可知，肋柱花花粉在不同温度培养下，花粉萌发率有所差异。培养温度在15～25 ℃时，花粉萌发率随温度升高逐渐升高；其中在25 ℃培养温度下，花粉萌发率达到最大值（77.38%），显著高于对照（P<0.05）；当温度高于25 ℃时，花粉萌发率开始逐渐下降，温度达35 ℃时，花粉萌发率仅为5.76%，显著低于对照8445%。因此，25 ℃培养条件适宜肋柱花花粉萌发。
2.4 不同测定方法下花粉活力比較
从4种方法对肋柱花花粉活力测定结果（图4）来看，花粉活力从高到低依次为离体萌发法≥I2-KI测定法>TTC染色法>醋酸洋红染色法。其中采用TTC染色法和醋酸洋红染色法测定花粉活力较低，花粉活力分别为21.79%和10.73%，而I2-KI染色法和离体萌发法测定花粉活力无显著性差异（P>0.05），花粉活力均达到80%以上。
3 结论与讨论
花粉萌发除与本身内在因素有关，还受许多外在条件限制，其中在花粉萌发过程中的培养条件（蔗糖、硼酸及温度）对花粉萌发有一定影响。在花粉萌发过程中，一方面蔗糖作为主要的碳源，提供花粉萌发所需要能量，另一方面也可以调节花粉与培养液之间渗透平衡。以往关于蔗糖对花粉萌发的研究较多，不同植物花粉萌发对蔗糖浓度的需要不同，如韩成刚等[9]研究芍药花粉活力得出，100 g/L蔗糖适宜花粉萌发；王仲等[10]通过对金银忍冬花粉萌发测定，发现最适宜的离体萌发蔗糖浓度为15%；王存纲等[11]研究得出20 mg/L 蔗糖适宜刺槐花粉萌发。该试验对肋柱花花粉培养后发现蔗糖浓度为15%时，花粉萌发率达83.97%，浓度过低或过高均不利于花粉萌发，因此适于肋柱花花粉萌发的蔗糖浓度为15%。 硼酸主要参与花粉管顶端细胞壁的构建[12]，是对花粉活力具有显著作用和广泛效果的矿质元素之一[13]。而关于硼酸浓度对花粉萌发普遍认为较低浓度硼酸可以促进花粉萌发[14-15]。该试验采用不同浓度硼酸对花粉进行培养后得出，较低浓度（100 mg/L）硼酸有利于肋柱花花粉萌发，而超过此浓度，花粉萌发率将下降，因此肋柱花花粉萌发较适宜的硼酸浓度为100 mg/L。于璐等[16]利用花粉离体萌发法筛选出最适番茄花粉萌发的培养温度是 25 ℃；李勇军等[17]研究魔芋花粉萌发条件得出，适宜花粉培养温度为 26～28 ℃。该试验中，肋柱花花粉在25 ℃ 培养时，花粉萌发率达7738%，随着培养温度的升高，花粉萌发率逐渐下降，当温度达到35 ℃时，花粉萌发受到抑制，因此适宜肋柱花花粉的萌发温度为25 ℃。
以往研究表明，离体萌发法因对花粉活力的测定结果最接近真实值而被广泛使用[18]，但采用离体萌发法进行培养，一般需要前期摸索。该试验分别对5个蔗糖、硼酸浓度及培养温度进行筛选，得出适宜肋柱花花粉萌发的条件为15%蔗糖+100 mg/L硼酸，在温度为25 ℃下进行培养，花粉萌发率较高，而这一过程操作起来较繁琐。相对于离体萌发法，染色法对花粉活力测定具有简单和快捷的优点，但不同植物花粉适宜的染色方法不同，该研究中I2-KI测定法结果与离体萌发法较接近，而且操作简单，是测定肋柱花花粉活力最适宜的方法。
参考文献
[1] 王秀梅，巴根那，白明纲.高效液相色谱法测定肋柱花中獐牙菜苦苷的含量[J].内蒙古民族大学学报（自然科学版），2007，22（3）：320-322.
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[7] 张志良，瞿伟菁，李小方.植物生理学实验指导[M].北京：高等教育出版社，2009：181-182.
[8] 王定康，孙桂芳，郭志明，等.滇重楼的花粉活力测定方法比较[J].安徽农业科学，2007，35（35）：11451，11453.
[9] 韩成刚，盖树鹏.芍药花粉活力测定方法的研究[J].江苏农业科学，2012，40（5）：124-125，126.
[10] 王仲，邵红，孙睿，等.金银忍冬花粉生活力测定方法的研究[J].黑龙江农业科学，2015（12）：22-24.
[11] 王存纲，晋佳路.刺槐花粉生活力测定方法及贮藏特性[J].南方农业学报，2014，45（8）：1443-1446.
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[15] 刘鹏，张太奎，王连春，等.牛角瓜花粉离体萌发研究[J].经济林研究，2015，33（2）：142-148.
[16] 于璐，蒋芳玲，周蓉，等.培养基类型和培养温度对引进番茄品种花粉活力的影响[J].江苏农业科学，2014，42（1）：110-113.
[17] 李勇军，王玲，陈建华，等.魔芋花粉离体萌发及花粉管生长的研究[J].西南农业学报，2011，24（6）：2316-2320.
[18] 胡春，刘左军，李富香，等.钝裂银莲花花粉活力测定方法的研究[J].植物研究，2013，33（5）：582-586.
关键词 肋柱花；花粉萌发；蔗糖；硼酸；花粉活力
中图分类号 S567.21+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0127-03
Comparison on Pollen Germination and Viability Determination Method of Lomatogonium rotatum
LI Xu-xin1， BA Gen-na2，YANG Heng-shan1 et al
（1.College of Agronomy， Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao，Inner Mongolia 028042；2.College of Mongolia Medicine，Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao，Inner Mongolia 028042）
Abstract [Objective] The optimum conditions of Lomatogonium rotatum of pollen germination were studied by selecting different culture conditions and determination methods， and find a simple and rapid method to determine the pollen viability of Lomatogonium rotatum. [Methods]The germination rate of pollen germination at different concentrations of sucrose， boric acid and culture temperature was studied by in vitro germination method. The pollen viability was determined by carmine acetate staining method， TTC staining and I2-KI staining.[Result] The pollen germination rate reached the maximum at the concentration of 15% sucrose，100 mg/L boric acid and 25 ℃ culture condition， and above this condition，the germination rate decreased.Compared with carmine acetate staining method and TTC method， the determination results of I2-KI staining and in vitro germination method were similar.[Conclusion]The optimum conditions for the pollen germination were 15% sucrose+100 mg/L boric acid，the temperature is 25 ℃.I2-KI staining method can be used as the best method for rapid determination of pollen viability.
Key words Lomatogonium rotatum；Pollen germination；Sucrose；Boric acid；Pollen viability
肋柱花（Lomatogonium rotatum），別名哈比日根-地格达，属于一年生野生草本植物，为龙胆科肋柱花[Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym.]的干燥全草，主要用于协日热、瘟疫、流感、肝胆热、黄疸等病症[1]，其根、全草、叶、花中均含有齐敦果酸（oleanolic acid）[2]，具有降低转氨酶作用，对病毒性肝炎有显著治疗作用。在我国内蒙古、黑龙江、河北等地的灌丛草甸、河滩草地、高山草甸等有零星分布，但生长期短且较慢，目前临床上所使用肋柱花药源全部采自野生植株，由于其为全草入药，采集者往往将正处于花期的整株挖走，而留下的植株多数在种子未成熟时在草原秋季打草（8月中旬）时连同草也一起被割走，草地上存留的肋柱花种子很少，这导致其种群个体数量急剧下降，资源越来越少。关于肋柱花的研究主要在提取工艺[1，3-4]和化学成分[5-6]等方面，而花粉萌发方面鲜见报道。花粉活力对植物育种工作具有重要的作用，筛选适宜的花粉活力测定方法，这对提高植物繁殖效率具有重要的指导作用。该试验以肋柱花花粉为材料，研究不同蔗糖、硼酸浓度及培养温度对肋柱花花粉萌发的影响，试图筛选出适宜花粉萌发的培养条件，并通过不同染色方法对花粉活力进行测定，找出简单快速测定花粉活力的方法，进一步为肋柱花有效繁殖和育种工作提供理论指导。 1 材料与方法
1.1 试验材料
2016年8月中旬将采集的肋柱花植株花序放在硫酸纸上，待花粉从花药内散出后，将花粉装入纸形管中用于试验。
1.2 试验方法
1.2.1 蔗糖浓度试验。
采用培养基法对花粉进行萌发试验。在100 mL蒸馏水内加入1 g琼脂后，再分别添加不同浓度蔗糖（5%、10%、15%、20%），以不加蔗糖为对照（CK）。共同置于烧杯中加热煮沸，使琼脂和蔗糖充分溶解于水中，之后用玻璃棒蘸少量培养基于载玻片上，放置片刻使其冷凝作为播种花粉的发芽床。用毛笔蘸少量花粉，轻轻散落培养基表面，每一视野（10×10）中分布有100～200粒花粉为宜。将载玻片放于培养皿内，置于25 ℃光照培养箱内进行培养。每一处理设3次重复，每个重复观察4个视野，每个视野不少于100粒花粉，7 h后观察并统计花粉萌发数。花粉萌发的标准以花粉管伸长长度超过花粉粒直径为准，计算萌发率。花粉萌发率=（花粉萌发数/花粉总数）×100%。
1.2.2 硼酸浓度试验。
利用“1.2.1”筛选出的蔗糖浓度，在培养基中分别添加不同浓度硼酸（50、100、200、300 mg/L），以不加硼酸为对照（CK），按“1.2.1”蔗糖培养方法进行培养、观察和统计，筛选适宜肋柱花花粉萌发的硼酸浓度。
1.2.3 温度对花粉萌发的影响。
利用“1.2.1”和“1.2.2”中筛选出的蔗糖和硼酸浓度，分别将花粉在15、20、25、30、35 ℃进行培养，观察花粉萌发情况，计算花粉萌发率。
1.2.4 不同测定方法下花粉活力比较。
（1）氯化三苯基四氮唑（ TTC）染色法[7]。取少量花粉放在载玻片上，加1～2滴TTC溶液，盖上盖玻片后将制完的片子放入培养皿内，置于35 ℃光照培养箱内暗培养，20 min后观察花粉染色情况。染成红色的花粉活力较强，无色的为不具有活力花粉。
（2）I2-KI染色法[7]。取少量花粉放在载玻片上，再加1～2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片在显微镜下观察，凡被染成蓝色的表示花粉具有生活力，呈黄褐色的为无活力花粉。
（3）醋酸洋红染色法[8]。取少量花粉放在载玻片上，滴上 1～2 滴醋酸洋红，盖上盖玻片在显微镜下观察。凡是被染成红色的花粉粒则为有活力。
（4）离体萌发法。利用“1.2.1”筛选出的蔗糖浓度，将花粉播种在培养基上，于25 ℃光照培养箱内进行培养，观察花粉萌发情况。
以上染色方法每一处理设3次重复，每个重复观察4个视野，每个视野不少于100粒花粉，统计花粉活力。花粉活力=花粉染色总数/观察花粉总数×100%。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理和绘图，采用 SPSS 13.0 分析软件对数据进行差异显著性检验。
2 结果与分析
2.1 不同蔗糖浓度对肋柱花花粉萌发的影响
从图1可看出，在蔗糖浓度为0（CK）～15%时，花粉萌发率呈逐渐升高的变化趋势，其中在蔗糖浓度为15%时，肋柱花花粉萌发率达83.97%，显著高于对照（P<0.05），为对照的2.56倍；蔗糖浓度超过15%时，花粉萌发率开始下降。因此，肋柱花花粉萌发适宜的蔗糖浓度为15%。
2.2 不同硼酸浓度对肋柱花花粉萌发的影响
从图2可以看出，不同硼酸浓度培养下，肋柱花花粉萌发率有一定差异。硼酸浓度在0（CK）～100 mg/L时，随着浓度的增加，肋柱花花粉萌发率呈逐渐升高的变化，其中硼酸浓度达100 mg/L时，花粉萌发率达到最大值，为89.98%，显著高于对照12417%（P<0.05），浓度超过100 mg/L时，花粉萌发率开始下降。当硼酸浓度为300 mg/L时，花粉萌发率显著低于对照（P<0.05），比对照下降了46.86%。因此，硼酸浓度为100 mg/L最适宜肋柱花的花粉萌发。
2.3 不同培养温度对花粉萌发的影响
由图3可知，肋柱花花粉在不同温度培养下，花粉萌发率有所差异。培养温度在15～25 ℃时，花粉萌发率随温度升高逐渐升高；其中在25 ℃培养温度下，花粉萌发率达到最大值（77.38%），显著高于对照（P<0.05）；当温度高于25 ℃时，花粉萌发率开始逐渐下降，温度达35 ℃时，花粉萌发率仅为5.76%，显著低于对照8445%。因此，25 ℃培养条件适宜肋柱花花粉萌发。
2.4 不同测定方法下花粉活力比較
从4种方法对肋柱花花粉活力测定结果（图4）来看，花粉活力从高到低依次为离体萌发法≥I2-KI测定法>TTC染色法>醋酸洋红染色法。其中采用TTC染色法和醋酸洋红染色法测定花粉活力较低，花粉活力分别为21.79%和10.73%，而I2-KI染色法和离体萌发法测定花粉活力无显著性差异（P>0.05），花粉活力均达到80%以上。
3 结论与讨论
花粉萌发除与本身内在因素有关，还受许多外在条件限制，其中在花粉萌发过程中的培养条件（蔗糖、硼酸及温度）对花粉萌发有一定影响。在花粉萌发过程中，一方面蔗糖作为主要的碳源，提供花粉萌发所需要能量，另一方面也可以调节花粉与培养液之间渗透平衡。以往关于蔗糖对花粉萌发的研究较多，不同植物花粉萌发对蔗糖浓度的需要不同，如韩成刚等[9]研究芍药花粉活力得出，100 g/L蔗糖适宜花粉萌发；王仲等[10]通过对金银忍冬花粉萌发测定，发现最适宜的离体萌发蔗糖浓度为15%；王存纲等[11]研究得出20 mg/L 蔗糖适宜刺槐花粉萌发。该试验对肋柱花花粉培养后发现蔗糖浓度为15%时，花粉萌发率达83.97%，浓度过低或过高均不利于花粉萌发，因此适于肋柱花花粉萌发的蔗糖浓度为15%。 硼酸主要参与花粉管顶端细胞壁的构建[12]，是对花粉活力具有显著作用和广泛效果的矿质元素之一[13]。而关于硼酸浓度对花粉萌发普遍认为较低浓度硼酸可以促进花粉萌发[14-15]。该试验采用不同浓度硼酸对花粉进行培养后得出，较低浓度（100 mg/L）硼酸有利于肋柱花花粉萌发，而超过此浓度，花粉萌发率将下降，因此肋柱花花粉萌发较适宜的硼酸浓度为100 mg/L。于璐等[16]利用花粉离体萌发法筛选出最适番茄花粉萌发的培养温度是 25 ℃；李勇军等[17]研究魔芋花粉萌发条件得出，适宜花粉培养温度为 26～28 ℃。该试验中，肋柱花花粉在25 ℃ 培养时，花粉萌发率达7738%，随着培养温度的升高，花粉萌发率逐渐下降，当温度达到35 ℃时，花粉萌发受到抑制，因此适宜肋柱花花粉的萌发温度为25 ℃。
以往研究表明，离体萌发法因对花粉活力的测定结果最接近真实值而被广泛使用[18]，但采用离体萌发法进行培养，一般需要前期摸索。该试验分别对5个蔗糖、硼酸浓度及培养温度进行筛选，得出适宜肋柱花花粉萌发的条件为15%蔗糖+100 mg/L硼酸，在温度为25 ℃下进行培养，花粉萌发率较高，而这一过程操作起来较繁琐。相对于离体萌发法，染色法对花粉活力测定具有简单和快捷的优点，但不同植物花粉适宜的染色方法不同，该研究中I2-KI测定法结果与离体萌发法较接近，而且操作简单，是测定肋柱花花粉活力最适宜的方法。
参考文献
[1] 王秀梅，巴根那，白明纲.高效液相色谱法测定肋柱花中獐牙菜苦苷的含量[J].内蒙古民族大学学报（自然科学版），2007，22（3）：320-322.
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