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【摘要】目的：建立天黄猴枣散中胆红素HPLC含量测定方法。方法：采用CAPCELLPAK C18色谱柱（250mm×46mm，5μm），以乙腈-甲醇-01%磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至60）（13∶50∶37）为流动相，检测波长451nm。结果：胆红素在001931～19309μg范围内呈良好的线性关系；回收率为1003% ，RSD=25%（n=9）。结论：本法专属性强，简便快速，精密度良好。
【关键词】胆红素；含量测定；HPLC；天黄猴枣散
【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）10-0014-02
Abstract：Objective To establish a method of determinating content of bilirubin in Tianhuang Houzao Powder by HPLC.Methods A CAPCELLPAK C18（250mm×46mm，5 μm）column was used with acetonitril-menthol-01%Phosphoric acid solution （adjust pH to 60 with triethylamine ）（13∶50∶37） as the mobile phase.Detector wavelength was 451nm.Results The linearity was obtained over the range of 001931～19309μg.The mean recovery was 1003%，RSD=25%（n=9）.Conclusion The method was sensitive.simple and accurate.
Keywords：Bilirubin；Content determination；HPLC；Tianhuang Houzao powder
天黄猴枣散具有清心，豁痰，开窍，凉肝，息风，解毒的功效。临床常用于热病神昏，中风痰迷，惊厥抽搐，癫痫发狂，咽喉肿痛，口舌生疮，痈肿疔疮。处方中体外培育牛黄为的君药，而胆红素为体外培育牛黄主要有效成分之一。据文献报道[1]，胆红素是一个直链四吡咯化合物，在人体内是血红素的代谢（分解）产物。药理研究表明，胆红素有解热、降压、抗病毒、抗衰老、抗癌和促进红血球新生的作用。选择胆红素作为含量测定指标，可反映和控制天黄猴枣散的内在质量。研究采用高效液相色谱法测定天黄猴枣散中胆红素的含量。
1仪器与材料
11仪器美国Agilent高效液相色谱仪（含DAD检测器、Chemstations色谱工作站）；MILLI-PROA纯水处理器。
12材料胆红素对照品（批号：100077-200503，中国药品生物制品检定所。经归一化法检查，纯度以胆红素X Ⅲα、 Ⅸα、 Ⅷα三个异构体峰面积之和计算，为9772%）。 天黄猴枣散为广西梧州制药（集团）股份有限公司和广州敬修堂（药业）股份有限公司提供。阴性样品为广西梧州制药（集团）股份有限公司提供。乙腈、甲醇为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。
2方法与结果
21色谱条件色谱柱：CAPCELLPAK C18柱（250mm×46 mm，5μm）；流动相：乙腈-甲醇-01%磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至60）（13∶50∶37）；检测波长：451nm；柱温30℃；流速10 ml/min；进样量：5μl。在此色谱条件下，并参考相关文献[2]，胆红素三个异构体出峰顺序为X Ⅲα、Ⅸα、 Ⅷα，三个异构体之间能完全分离，且与其他杂质峰有很好的分离。对照品及样品色谱图见图1。
22对照品溶液的制备取胆红素对照品，精密称定，加二甲基亚砜制成每1ml含20μg的溶液，即得。
23供试品溶液的制备取本品适量，混匀，取约50mg，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率400W，频率40KHz）30min，放冷，再称定重量，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
24线性关系考察精密称取胆红素对照品988mg，置25ml棕色量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品取贮备液05、05ml，分别置50、20ml棕色量瓶中，再精密量取对照品取贮备液05、10、15、20、30、50、10ml，分别置10ml棕色量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀得标准曲线溶液。取5μl上述对照品溶液按“21”项下色谱条件测定。以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归，得回归方程Y=62204×103X-58761，r=10000。表明胆红素在001931～19309μg范围内线性关系良好。
25精密度试验取同一供试液，在“21”项色谱条件下连续测定6次，记录各峰面积，计算RSD，结果6次测定胆红素平均峰面积RSD=06%，表明仪器精密度良好。
26重复性试验取同一批样品6份，按“23”项下的方法制备，按“21”项下的色谱条件测定。结果 6份样品测得胆红素含量的平均值为119323mg/g，RSD=11%，结果表明本法的重复性较好。
27稳定性试验取同一供试液，按“21”项色谱条件分别在0、2、5、7、9、13、18、22、27h测定。结果供试品溶液在9h内峰面积RSD=28%，13 h后峰面积RSD=42%，27 h后峰面积RSD=54%，表明应在9小时内完成胆红素的测定。
28加样回收率试验
281加样用对照品溶液的制备精密称取胆红素对照品1060mg，置25ml量瓶中，加二甲基亚砜使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为胆红素对照品储备液；精密量取对照品储备液15、30、50ml，分别置A、B、C三个100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，即得 282加样回收试验精密称取已知含量的天黄猴枣散25mg，共9份，1～3份分别精密加入“281”项下对照品混合溶液A 25ml，4～6份分别精密加入对照品混合溶液B 25ml，7～9分别精密加入对照品混合溶液C 25ml，按“23”项下的方法提取，即得。精密吸取5μl注入液相色谱仪，测定含量，计算回收率，结果见表1。
29干扰实验取阴性样品，按“23”项下供试品溶液的制备方法制备，测定，结果阴性样品在胆红素峰相应的保留时间处无干扰峰，表明处方中成分对测定无影响。
210样品测定对2个不同生产单位的10批样品进行胆红素含量测定，结果含量在95～116mg/g之间。
3讨论
31测定成分的选择参考文献[3]，体外培育牛黄在制备过程中，受生产工艺、酸、碱、光、热及贮存条件等因素影响，双吡咯环产生异构化，即X Ⅲα、Ⅸα、 Ⅷα。胆红素Ⅸα是天然产物的原型物，故以异构体的总量来控制本品中胆红素的含量，较为合理。
32流动相的选择参考《中国药典》和文献[2]，HPLC法测定胆红素的流动相有三氯甲烷-甲醇-二乙胺（80∶19∶1）、甲醇-三氯甲烷-1%磷酸溶液（80∶14∶6）、乙腈-二甲基亚砜-pH47的1%醋酸铵（40∶60∶55）等，考虑到本实验系反相色谱，三氯甲烷和二甲基亚砜对色谱柱伤害较大，经摸索，最后确定用本文列出的流动相，得到的色谱峰形对称，分离度好。
33提取溶剂的考察天黄猴枣散处方中为体外培育牛黄，其胆红素为游离型胆红素，由6个分子内氢键形成，为不溶于水的脂溶性化合物，故对二甲基亚砜、三氯甲烷、三氯甲烷-1%盐酸甲醇溶液（5∶1）、二甲基亚砜-乙腈（7∶3）、EDTA-二氯甲烷（1∶10）等提取溶剂进行考察，结果以二甲基亚砜为溶剂提取效果最好，见表2。
34提取方法的考察实验曾对静置过夜、超声处理和加热回流等3种样品溶液的制备方法进行比较，结果加热回流得到的供试品，未能检测到胆红素，表明加热后胆红素被破坏，不宜加热提取；而超声处理的含量明显高于静置过夜的样品含量。
35胆红素异构体在空气中尤其在光照下极易被氧化，因此整个操作因避光进行。稳定性实验结果进一步表明，含量测定操作方法以快速为佳。
参考文献
[1] 黄泰康.常用中药成分与药理手册[M].北京：中国医药科技出版社，1994：557.
[2] 尹华，吴健敏，梁文藻.胆红素异构体相对含量的RP-HPLC测定[J].药物分析杂志，1992，12（6）：338-339.
[3] Norbert Blanckacrt.Analysis of bilirubin and bilirubin mono and diconjugates[J]. Biochem J， 1980，18（5）：115-128.
（收稿日期：20160327）
【关键词】胆红素；含量测定；HPLC；天黄猴枣散
【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）10-0014-02
Abstract：Objective To establish a method of determinating content of bilirubin in Tianhuang Houzao Powder by HPLC.Methods A CAPCELLPAK C18（250mm×46mm，5 μm）column was used with acetonitril-menthol-01%Phosphoric acid solution （adjust pH to 60 with triethylamine ）（13∶50∶37） as the mobile phase.Detector wavelength was 451nm.Results The linearity was obtained over the range of 001931～19309μg.The mean recovery was 1003%，RSD=25%（n=9）.Conclusion The method was sensitive.simple and accurate.
Keywords：Bilirubin；Content determination；HPLC；Tianhuang Houzao powder
天黄猴枣散具有清心，豁痰，开窍，凉肝，息风，解毒的功效。临床常用于热病神昏，中风痰迷，惊厥抽搐，癫痫发狂，咽喉肿痛，口舌生疮，痈肿疔疮。处方中体外培育牛黄为的君药，而胆红素为体外培育牛黄主要有效成分之一。据文献报道[1]，胆红素是一个直链四吡咯化合物，在人体内是血红素的代谢（分解）产物。药理研究表明，胆红素有解热、降压、抗病毒、抗衰老、抗癌和促进红血球新生的作用。选择胆红素作为含量测定指标，可反映和控制天黄猴枣散的内在质量。研究采用高效液相色谱法测定天黄猴枣散中胆红素的含量。
1仪器与材料
11仪器美国Agilent高效液相色谱仪（含DAD检测器、Chemstations色谱工作站）；MILLI-PROA纯水处理器。
12材料胆红素对照品（批号：100077-200503，中国药品生物制品检定所。经归一化法检查，纯度以胆红素X Ⅲα、 Ⅸα、 Ⅷα三个异构体峰面积之和计算，为9772%）。 天黄猴枣散为广西梧州制药（集团）股份有限公司和广州敬修堂（药业）股份有限公司提供。阴性样品为广西梧州制药（集团）股份有限公司提供。乙腈、甲醇为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。
2方法与结果
21色谱条件色谱柱：CAPCELLPAK C18柱（250mm×46 mm，5μm）；流动相：乙腈-甲醇-01%磷酸溶液（用三乙胺调节pH值至60）（13∶50∶37）；检测波长：451nm；柱温30℃；流速10 ml/min；进样量：5μl。在此色谱条件下，并参考相关文献[2]，胆红素三个异构体出峰顺序为X Ⅲα、Ⅸα、 Ⅷα，三个异构体之间能完全分离，且与其他杂质峰有很好的分离。对照品及样品色谱图见图1。
22对照品溶液的制备取胆红素对照品，精密称定，加二甲基亚砜制成每1ml含20μg的溶液，即得。
23供试品溶液的制备取本品适量，混匀，取约50mg，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精密加入二甲基亚砜25ml，密塞，称定重量，超声处理（功率400W，频率40KHz）30min，放冷，再称定重量，用二甲基亚砜补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。
24线性关系考察精密称取胆红素对照品988mg，置25ml棕色量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品取贮备液05、05ml，分别置50、20ml棕色量瓶中，再精密量取对照品取贮备液05、10、15、20、30、50、10ml，分别置10ml棕色量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀得标准曲线溶液。取5μl上述对照品溶液按“21”项下色谱条件测定。以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归，得回归方程Y=62204×103X-58761，r=10000。表明胆红素在001931～19309μg范围内线性关系良好。
25精密度试验取同一供试液，在“21”项色谱条件下连续测定6次，记录各峰面积，计算RSD，结果6次测定胆红素平均峰面积RSD=06%，表明仪器精密度良好。
26重复性试验取同一批样品6份，按“23”项下的方法制备，按“21”项下的色谱条件测定。结果 6份样品测得胆红素含量的平均值为119323mg/g，RSD=11%，结果表明本法的重复性较好。
27稳定性试验取同一供试液，按“21”项色谱条件分别在0、2、5、7、9、13、18、22、27h测定。结果供试品溶液在9h内峰面积RSD=28%，13 h后峰面积RSD=42%，27 h后峰面积RSD=54%，表明应在9小时内完成胆红素的测定。
28加样回收率试验
281加样用对照品溶液的制备精密称取胆红素对照品1060mg，置25ml量瓶中，加二甲基亚砜使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为胆红素对照品储备液；精密量取对照品储备液15、30、50ml，分别置A、B、C三个100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，即得 282加样回收试验精密称取已知含量的天黄猴枣散25mg，共9份，1～3份分别精密加入“281”项下对照品混合溶液A 25ml，4～6份分别精密加入对照品混合溶液B 25ml，7～9分别精密加入对照品混合溶液C 25ml，按“23”项下的方法提取，即得。精密吸取5μl注入液相色谱仪，测定含量，计算回收率，结果见表1。
29干扰实验取阴性样品，按“23”项下供试品溶液的制备方法制备，测定，结果阴性样品在胆红素峰相应的保留时间处无干扰峰，表明处方中成分对测定无影响。
210样品测定对2个不同生产单位的10批样品进行胆红素含量测定，结果含量在95～116mg/g之间。
3讨论
31测定成分的选择参考文献[3]，体外培育牛黄在制备过程中，受生产工艺、酸、碱、光、热及贮存条件等因素影响，双吡咯环产生异构化，即X Ⅲα、Ⅸα、 Ⅷα。胆红素Ⅸα是天然产物的原型物，故以异构体的总量来控制本品中胆红素的含量，较为合理。
32流动相的选择参考《中国药典》和文献[2]，HPLC法测定胆红素的流动相有三氯甲烷-甲醇-二乙胺（80∶19∶1）、甲醇-三氯甲烷-1%磷酸溶液（80∶14∶6）、乙腈-二甲基亚砜-pH47的1%醋酸铵（40∶60∶55）等，考虑到本实验系反相色谱，三氯甲烷和二甲基亚砜对色谱柱伤害较大，经摸索，最后确定用本文列出的流动相，得到的色谱峰形对称，分离度好。
33提取溶剂的考察天黄猴枣散处方中为体外培育牛黄，其胆红素为游离型胆红素，由6个分子内氢键形成，为不溶于水的脂溶性化合物，故对二甲基亚砜、三氯甲烷、三氯甲烷-1%盐酸甲醇溶液（5∶1）、二甲基亚砜-乙腈（7∶3）、EDTA-二氯甲烷（1∶10）等提取溶剂进行考察，结果以二甲基亚砜为溶剂提取效果最好，见表2。
34提取方法的考察实验曾对静置过夜、超声处理和加热回流等3种样品溶液的制备方法进行比较，结果加热回流得到的供试品，未能检测到胆红素，表明加热后胆红素被破坏，不宜加热提取；而超声处理的含量明显高于静置过夜的样品含量。
35胆红素异构体在空气中尤其在光照下极易被氧化，因此整个操作因避光进行。稳定性实验结果进一步表明，含量测定操作方法以快速为佳。
参考文献
[1] 黄泰康.常用中药成分与药理手册[M].北京：中国医药科技出版社，1994：557.
[2] 尹华，吴健敏，梁文藻.胆红素异构体相对含量的RP-HPLC测定[J].药物分析杂志，1992，12（6）：338-339.
[3] Norbert Blanckacrt.Analysis of bilirubin and bilirubin mono and diconjugates[J]. Biochem J， 1980，18（5）：115-128.
（收稿日期：20160327）