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【摘要】 目的：建立逆转录（RT）-环介导等温扩增方法（LAMP），以快速检测手足口病最重要的两种病原体：肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。方法：收集手足口病患儿咽拭子标本93份，针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物，分别于63 ℃（EV71）、65 ℃（CA16A）扩增1 h，日光下观察结果，与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果：EV71、CA16的LAMP最低检测限均为500拷贝/管，与对照病毒无交叉反应。93份标本中，RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例，CA16阳性36例；RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例，CA16阳性36例，两种方法间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高，适合在基层医疗机构推广应用。
【关键词】 逆转录-环介导等温扩增技术； 肠道病毒71型； 柯萨奇病毒A组16型； 手足口病
【Abstract】 Objective：To rapidly detect pathogens of hand-foot-and-mouth disease （HFMD） by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP），the two most important pathogens：enterovirus 71 （EV71） and coxsackievirus group A type 16 （CA16）.Method：A total of 93 swab specimens were collected from HFMD children.Six primers which recognized 8 distinct regions on the VP1 gene of enterovirus 71 （EV71） and coxsackievirus A16 （CA16） were designed for RT-LAMP assay.The target genes were amplified for 1 hour at isothermal temperatures of 63 ℃ for EV71 and 65 ℃ for CA16，respectively.The sensitivity and specificity of RT-LAMP were compared with fluorescence quantitative PCR using chi-square test measures.Result：The lower limits of EV71 and CA16 detection were both 500 copies/tube by RT-LAMP assay.No cross reaction was shown among other viruses.Of all the 93 swab specimens，46 cases were EV71 positive and 36 cases were CA16 positive by RT-LAMP，while 44 cases were EV71 positive and 36 cases were CA16 positive by quantitative PCR.There were no significant differences between the two measures（P>0.05）.Conclusion：RT-LAMP may be a more rapid，sensitive，specific and economical measure for detection of HFMD pathogens，especially in primary health service.
【Key words】 Loop-mediated isothermal amplification； Enterovirus 71； Coxsackievirus A16； Hand-foot-and-mouth disease
First-author’s address：Huaihe Hospital of He’nan University，Kaifeng 475003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.024
手足口病（hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是以发热、口腔溃疡和疱疹为特征的一种常见的儿童传染病，可导致心肌炎、无菌性脑脊髓膜炎和脑炎等严重并发症[1-2]。据统计，2011年全国手足口病的患病总人数达1 619 706人，死亡509人[3]。肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CA16）是HFMD最重要的两种病原体，尤其是EV71与HFMD的暴发流行密切相关，可引起较严重的中枢神经系统病变，病死率高[4-5]。因此，建立快速、准确、特异的EV71和CA16病毒检测方法十分重要[6]。
目前，RT-PCR（real-time polymerase chain reaction）技术已成为临床快速诊断肠道病毒的重要手段，其特点为敏感性高，检测迅速，扩增产物无需电泳，可直接定量，检测系统密闭，不易发生污染，但需要昂贵的RT-PCR仪，试剂的价格也较高，故较难在基层推广应用。逆转录（reverse transcription，RT）-环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi在2000年开发的一种核酸扩增技术[7]。即建立针对靶基因8个特定区域的6条特异性引物，在恒温条件下（60～65 ℃），利用链置换DNA聚合酶在几十分钟内快速、高效、特异地完成对靶DNA序列的扩增，目前此技术已广泛用于临床微生物检测[8-10]。本研究采用RT-LAMP技术检测HFMD病原体EV71和CA16，评价其特异性和敏感性，探讨在基层医疗单位中推广应用的前景。 1 材料与方法
1.1 临床样本 收集2012年1-10月本院临床诊断为手足口病的患儿咽拭子标本93份。用采样棉签拭抹扁桃体和口腔咽后壁，然后将采样棉签在标本保存液中充分搅动，将病毒洗下，4 ℃，8000 rpm，5 min。将咽拭液于-80 ℃冻存，用于RT-LAMP和荧光定量PCR检测。
1.2 试剂 RNA提取试剂盒为天根生物公司生产，AMV反转录酶和RT-PCR试剂盒TAKARA公司生产，Bst DNA聚合酶为NEB公司生产，Betaine为Sigma公司生产，羟基萘酚蓝（HNB）为晶纯试剂有限公司产品，CA16、EV71、诺如病毒和轮状病毒阳性核酸购自河南省疾病控制中心，CA16、EV71 RT-PCR检测试剂盒购自达安公司。
1.3 核酸提取 采用天根生物公司生产的核酸提取试剂盒，按照说明书对临床样本进行核酸抽提。
1.4 荧光定量PCR检测 将模板逆转录后，按照操作说明书操作：94 ℃预变性5 min；93 ℃变性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。
1.5 建立RT-LAMP
1.5.1 引物设计 EV71和CA16均以VP1基因作为引物设计的靶基因。在序列的保守区域，利用PE4软件设计引物。引物由上海生工公司合成。
1.5.2 反应体系建立与优化 设置不同的dNTPs浓度、内外引物浓度比（1：1、1：2、1：4、1：8、1：10）、Mg2+浓度（2 mM、2.8 mM、3.6 mM、4.4 mM、5.2 mM）、Betaine不同的反应时间（30 min、40 min、50 min、60 min、
70 min）和不同反应温度（60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃），获得EV71和CA16病毒的最佳反应体系为：15 U/L AMV逆转录酶1.5μL，8 U/μL BstDNA聚合酶1 μL，10×反应缓冲液2.5 μL，0.3 mM/L HNB，0.4 M dNTPs，0.8 μM FIP和BIP，0.2 μM F3和B3，2.8 M MgSO4，1 M Betaine，5 μL模板RNA，加DEPC水至25 μL。充分混匀后，置于水浴锅内1 h，EV71病毒、CA16病毒分别63 ℃、65 ℃。80 ℃，2 min后终止反应。
1.5.3 扩增产物的检测
1.5.3.1 肉眼检测 根据日光下反应液颜色变化判断结果：浅蓝色为阴性，深蓝色为阳性。
1.5.3.2 电泳检测 将扩增产物点样于2%琼脂糖凝胶中，电泳约1 h，成像，阳性电泳结果显示为梯状条带；阴性电泳结果无任何条带。
1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，两种检测方法采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-LAMP法检测EV71、CA16病毒的特异性 对临床样本的RNA分别进行EV71和CA16病毒的RT-LAMP检测。EV71检测结果的见图1，电泳泳道中的样品从左到右依次是DNA marker、EV71、空白对照、CA16、轮状病毒、诺如病毒。只有EV71呈现LAMP典型的梯状条带，而其余泳道均无梯状条带，因此本研究的RT-LAMP方法对检测EV71方法具有高度特异性。
3 讨论
HFMD是我国儿童高发传染病之一，如果能够在基层医疗单位确诊病情，就可以在第一时间有效地控制疫情的暴发与蔓延。荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高的优点，是目前临床检测EV71、CA16等病原体的首选方法，但由于受到要求昂贵的设备仪器等限制，不宜在普通医疗单位中应用[11]。
RT-LAMP方法是利用有链置换活性的Bst DNA聚合酶和两对特殊引物，可以在不改变温度的条件下使引物与模板结合，并进行链置换扩增反应。本研究建立了EV71和CA16病毒的RT-LAMP检测技术，只需在63 ℃或65 ℃的恒温条件下反应60 min，检测迅速，耗时短。
RT-LAMP法可扩增出109～1010倍靶序列拷贝，灵敏度相当、甚至高于定量荧光PCR方法[12]。LAMP反应的结果判断须利用不同染料，常见的染料有SYBR Green和羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue，HNB）等，其中HNB在反应前即可加入，不干扰反应[13]。本研究的LAMP技术选择HNB作为颜色指示剂，其灵敏度与荧光定量PCR相同，达到500拷贝/管[14]，两种方法的EV71、CA16检测结果亦无显著差异。
对于细菌类病原体的检测，LAMP技术可直接取患病部位的体液进行病原检测；反应结束后无需电泳，只需观察颜色变化来判断检测结果；整个反应在一个管中进行，操作简单方便。LAMP所需试剂在常温下比较稳定[15]。LAMP反应不需要昂贵的PCR仪和试剂，只需一个简单的恒温器，因此具有在基层医疗单位推广应用的价值。
本研究建立了HFMD病原体EV71和CA16的单管RT-LAMP检测技术，该方法快速、敏感、特异、经济，适合在基层医疗机构推广应用。
参考文献
[1]黄汉先，温素琴.手足口病死亡病例的流行病学特点和临床特点分析[J].中国医学创新，2013，10（2）：128-129.
[2]周文亮，邢秀伟.216例重症手足口病高危特征的临床分析[J].中国医学创新，2013，10（6）：119-120.
[3]孙唯，祝小平，曹慧.我国手足口病防治研究现状[J].寄生虫病与感染性疾病，2012，10（3）：175-177.
[4]乔梦凯，石利民，王燕，等.南京市2011年手足口病流行病学及病原学特征分析[J].中国医学创新，2013，10（1）：89-91. [5] Li L，He Y，Yang H，et al.Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，People’s Republic of China[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3835-3839.
[6]金玉娟，甘莉萍，陈应坚，等.肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型实验室检测研究进展[J].职业与健康，2009，25（17）：1878-1879.
[7] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.
[8]黄火清，郁昂.环介导等温扩增技术的研究进展[J].生物技术，2012，22（3）：90-93.
[9] Kim H J，Kim Y J，Yong D E，et al.Loop-mediated isothermal amplification of vanA gene enables a rapid and naked-eye detection of vancomycin-resistant enterococci infection[J].J Microbiol Methods，2014，5（104）：61-66.
[10] Nzelu C O，Gomez E A，Cáceres A G，et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid mass-screening of sand flies for Leishmania infection[J].Acta Trop，2014，132（12）：1-6.
[11] Yu N，Guo M，He S J，et al.Evaluation of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 specific immunoglobulin M antibodies for diagnosis of hand-foot-and-mouth disease[J].Virol J，2012，9（12）：1254-1260.
[12] Jiang T，Liu J，Deng Y Q，et al.Development of RT-LAMP and real-time RT-PCR assays for the rapid detection of the new duck Tembusu-like BYD virus[J].Arch Virol，2012，157（12）：2273-2280.
[13] Goto M，Honda E，Ogura A，et al.Colorimetric detection of loop-mediated isotheral amplification reaction by using hydroxy naphthol blue[J].Biotechniques，2009，46（6）：167-172.
[14] Mong H O，Tom S，Yuwa P，et al.Evaluation of different clinical sample types in diagnosis of human enterovirus 71-associated hand-foot-and-mouth disease[J].J Clin Microbiol，2007，45（6）：1858-1866.
[15] Thekisoe O M，Bazie R S，Coronel-Servian A M，et al.Stability of loop-mediated isothermal amplification （LAMP） reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates[J].J Vet Med Sci，2009，71（4）：471-475.
（收稿日期：2014-03-09） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 逆转录-环介导等温扩增技术； 肠道病毒71型； 柯萨奇病毒A组16型； 手足口病
【Abstract】 Objective：To rapidly detect pathogens of hand-foot-and-mouth disease （HFMD） by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP），the two most important pathogens：enterovirus 71 （EV71） and coxsackievirus group A type 16 （CA16）.Method：A total of 93 swab specimens were collected from HFMD children.Six primers which recognized 8 distinct regions on the VP1 gene of enterovirus 71 （EV71） and coxsackievirus A16 （CA16） were designed for RT-LAMP assay.The target genes were amplified for 1 hour at isothermal temperatures of 63 ℃ for EV71 and 65 ℃ for CA16，respectively.The sensitivity and specificity of RT-LAMP were compared with fluorescence quantitative PCR using chi-square test measures.Result：The lower limits of EV71 and CA16 detection were both 500 copies/tube by RT-LAMP assay.No cross reaction was shown among other viruses.Of all the 93 swab specimens，46 cases were EV71 positive and 36 cases were CA16 positive by RT-LAMP，while 44 cases were EV71 positive and 36 cases were CA16 positive by quantitative PCR.There were no significant differences between the two measures（P>0.05）.Conclusion：RT-LAMP may be a more rapid，sensitive，specific and economical measure for detection of HFMD pathogens，especially in primary health service.
【Key words】 Loop-mediated isothermal amplification； Enterovirus 71； Coxsackievirus A16； Hand-foot-and-mouth disease
First-author’s address：Huaihe Hospital of He’nan University，Kaifeng 475003，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.024
手足口病（hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是以发热、口腔溃疡和疱疹为特征的一种常见的儿童传染病，可导致心肌炎、无菌性脑脊髓膜炎和脑炎等严重并发症[1-2]。据统计，2011年全国手足口病的患病总人数达1 619 706人，死亡509人[3]。肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CA16）是HFMD最重要的两种病原体，尤其是EV71与HFMD的暴发流行密切相关，可引起较严重的中枢神经系统病变，病死率高[4-5]。因此，建立快速、准确、特异的EV71和CA16病毒检测方法十分重要[6]。
目前，RT-PCR（real-time polymerase chain reaction）技术已成为临床快速诊断肠道病毒的重要手段，其特点为敏感性高，检测迅速，扩增产物无需电泳，可直接定量，检测系统密闭，不易发生污染，但需要昂贵的RT-PCR仪，试剂的价格也较高，故较难在基层推广应用。逆转录（reverse transcription，RT）-环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由Notomi在2000年开发的一种核酸扩增技术[7]。即建立针对靶基因8个特定区域的6条特异性引物，在恒温条件下（60～65 ℃），利用链置换DNA聚合酶在几十分钟内快速、高效、特异地完成对靶DNA序列的扩增，目前此技术已广泛用于临床微生物检测[8-10]。本研究采用RT-LAMP技术检测HFMD病原体EV71和CA16，评价其特异性和敏感性，探讨在基层医疗单位中推广应用的前景。 1 材料与方法
1.1 临床样本 收集2012年1-10月本院临床诊断为手足口病的患儿咽拭子标本93份。用采样棉签拭抹扁桃体和口腔咽后壁，然后将采样棉签在标本保存液中充分搅动，将病毒洗下，4 ℃，8000 rpm，5 min。将咽拭液于-80 ℃冻存，用于RT-LAMP和荧光定量PCR检测。
1.2 试剂 RNA提取试剂盒为天根生物公司生产，AMV反转录酶和RT-PCR试剂盒TAKARA公司生产，Bst DNA聚合酶为NEB公司生产，Betaine为Sigma公司生产，羟基萘酚蓝（HNB）为晶纯试剂有限公司产品，CA16、EV71、诺如病毒和轮状病毒阳性核酸购自河南省疾病控制中心，CA16、EV71 RT-PCR检测试剂盒购自达安公司。
1.3 核酸提取 采用天根生物公司生产的核酸提取试剂盒，按照说明书对临床样本进行核酸抽提。
1.4 荧光定量PCR检测 将模板逆转录后，按照操作说明书操作：94 ℃预变性5 min；93 ℃变性15 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。
1.5 建立RT-LAMP
1.5.1 引物设计 EV71和CA16均以VP1基因作为引物设计的靶基因。在序列的保守区域，利用PE4软件设计引物。引物由上海生工公司合成。
1.5.2 反应体系建立与优化 设置不同的dNTPs浓度、内外引物浓度比（1：1、1：2、1：4、1：8、1：10）、Mg2+浓度（2 mM、2.8 mM、3.6 mM、4.4 mM、5.2 mM）、Betaine不同的反应时间（30 min、40 min、50 min、60 min、
70 min）和不同反应温度（60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃），获得EV71和CA16病毒的最佳反应体系为：15 U/L AMV逆转录酶1.5μL，8 U/μL BstDNA聚合酶1 μL，10×反应缓冲液2.5 μL，0.3 mM/L HNB，0.4 M dNTPs，0.8 μM FIP和BIP，0.2 μM F3和B3，2.8 M MgSO4，1 M Betaine，5 μL模板RNA，加DEPC水至25 μL。充分混匀后，置于水浴锅内1 h，EV71病毒、CA16病毒分别63 ℃、65 ℃。80 ℃，2 min后终止反应。
1.5.3 扩增产物的检测
1.5.3.1 肉眼检测 根据日光下反应液颜色变化判断结果：浅蓝色为阴性，深蓝色为阳性。
1.5.3.2 电泳检测 将扩增产物点样于2%琼脂糖凝胶中，电泳约1 h，成像，阳性电泳结果显示为梯状条带；阴性电泳结果无任何条带。
1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，两种检测方法采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RT-LAMP法检测EV71、CA16病毒的特异性 对临床样本的RNA分别进行EV71和CA16病毒的RT-LAMP检测。EV71检测结果的见图1，电泳泳道中的样品从左到右依次是DNA marker、EV71、空白对照、CA16、轮状病毒、诺如病毒。只有EV71呈现LAMP典型的梯状条带，而其余泳道均无梯状条带，因此本研究的RT-LAMP方法对检测EV71方法具有高度特异性。
3 讨论
HFMD是我国儿童高发传染病之一，如果能够在基层医疗单位确诊病情，就可以在第一时间有效地控制疫情的暴发与蔓延。荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高的优点，是目前临床检测EV71、CA16等病原体的首选方法，但由于受到要求昂贵的设备仪器等限制，不宜在普通医疗单位中应用[11]。
RT-LAMP方法是利用有链置换活性的Bst DNA聚合酶和两对特殊引物，可以在不改变温度的条件下使引物与模板结合，并进行链置换扩增反应。本研究建立了EV71和CA16病毒的RT-LAMP检测技术，只需在63 ℃或65 ℃的恒温条件下反应60 min，检测迅速，耗时短。
RT-LAMP法可扩增出109～1010倍靶序列拷贝，灵敏度相当、甚至高于定量荧光PCR方法[12]。LAMP反应的结果判断须利用不同染料，常见的染料有SYBR Green和羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue，HNB）等，其中HNB在反应前即可加入，不干扰反应[13]。本研究的LAMP技术选择HNB作为颜色指示剂，其灵敏度与荧光定量PCR相同，达到500拷贝/管[14]，两种方法的EV71、CA16检测结果亦无显著差异。
对于细菌类病原体的检测，LAMP技术可直接取患病部位的体液进行病原检测；反应结束后无需电泳，只需观察颜色变化来判断检测结果；整个反应在一个管中进行，操作简单方便。LAMP所需试剂在常温下比较稳定[15]。LAMP反应不需要昂贵的PCR仪和试剂，只需一个简单的恒温器，因此具有在基层医疗单位推广应用的价值。
本研究建立了HFMD病原体EV71和CA16的单管RT-LAMP检测技术，该方法快速、敏感、特异、经济，适合在基层医疗机构推广应用。
参考文献
[1]黄汉先，温素琴.手足口病死亡病例的流行病学特点和临床特点分析[J].中国医学创新，2013，10（2）：128-129.
[2]周文亮，邢秀伟.216例重症手足口病高危特征的临床分析[J].中国医学创新，2013，10（6）：119-120.
[3]孙唯，祝小平，曹慧.我国手足口病防治研究现状[J].寄生虫病与感染性疾病，2012，10（3）：175-177.
[4]乔梦凯，石利民，王燕，等.南京市2011年手足口病流行病学及病原学特征分析[J].中国医学创新，2013，10（1）：89-91. [5] Li L，He Y，Yang H，et al.Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，People’s Republic of China[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3835-3839.
[6]金玉娟，甘莉萍，陈应坚，等.肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型实验室检测研究进展[J].职业与健康，2009，25（17）：1878-1879.
[7] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res，2000，28（12）：E63.
[8]黄火清，郁昂.环介导等温扩增技术的研究进展[J].生物技术，2012，22（3）：90-93.
[9] Kim H J，Kim Y J，Yong D E，et al.Loop-mediated isothermal amplification of vanA gene enables a rapid and naked-eye detection of vancomycin-resistant enterococci infection[J].J Microbiol Methods，2014，5（104）：61-66.
[10] Nzelu C O，Gomez E A，Cáceres A G，et al.Development of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid mass-screening of sand flies for Leishmania infection[J].Acta Trop，2014，132（12）：1-6.
[11] Yu N，Guo M，He S J，et al.Evaluation of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 specific immunoglobulin M antibodies for diagnosis of hand-foot-and-mouth disease[J].Virol J，2012，9（12）：1254-1260.
[12] Jiang T，Liu J，Deng Y Q，et al.Development of RT-LAMP and real-time RT-PCR assays for the rapid detection of the new duck Tembusu-like BYD virus[J].Arch Virol，2012，157（12）：2273-2280.
[13] Goto M，Honda E，Ogura A，et al.Colorimetric detection of loop-mediated isotheral amplification reaction by using hydroxy naphthol blue[J].Biotechniques，2009，46（6）：167-172.
[14] Mong H O，Tom S，Yuwa P，et al.Evaluation of different clinical sample types in diagnosis of human enterovirus 71-associated hand-foot-and-mouth disease[J].J Clin Microbiol，2007，45（6）：1858-1866.
[15] Thekisoe O M，Bazie R S，Coronel-Servian A M，et al.Stability of loop-mediated isothermal amplification （LAMP） reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates[J].J Vet Med Sci，2009，71（4）：471-475.
（收稿日期：2014-03-09） （本文编辑：欧丽）