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摘要：利用比较基因组学的方法，从大白菜基因组中鉴定出两个与拟南芥的耐热关键基因APXl同源的基因，并对这两个基因的结构、遗传进化、顺式元件进行了分析，为下一步研究这两个基因的功能和利用这两个基因进行大白菜耐热分子育种奠定了基础。
关键词：大白菜；APXl；基因结构；遗传进化；顺式元件
中图分类号：Q781
文献标识号：A
文章编号：1001-4942(2011)01-0009-03
大白菜性喜冷凉，主要栽培于温带地区，是我国的重要蔬菜之一。生产上随着春夏季节大白菜种植面积的日益扩大，对品种的耐热性提出了较高的要求。目前，国内外学者对植物耐热遗传机制的研究取得了很大进展，克隆了一大批与植物耐热相关的基因。有关白菜类蔬菜耐热的生理机制、耐热性指标的筛选、耐热QTL定位和耐热品种的选育研究得也比较多，但是有关耐热分子机理的研究目前报道很少。苏小俊、杨妍妍等对白菜类蔬菜的耐热鉴定方法、耐热生理指标进行了探讨；于拴仓等鉴定出5个大白菜耐热QTL，并对它们的遗传效应进行了分析；Yang等克隆了与大白菜耐热相关的细胞壁基因，郑佳秋和朱波分别克隆了一个不结球白菜的热激蛋白BcHSP基因及NAC基因。鉴于大白菜耐热遗传研究的现状，为了更好地为大白菜耐热育种服务，有必要加强大白菜耐热分子遗传机制的研究，鉴定和克隆大白菜的耐热响应关键基因。
现有研究表明，植物热胁迫过程中会产生大量的活性氧物质，对植物细胞产生毒害作用。植物清除这些有害物质的能力与耐热性存在密切的关系。拟南芥的抗坏血酸还原酶基因APXl在植物抗氧化和热、干旱等多种逆境胁迫响应过程中具有重要功能。但是有关大白菜APXl基因的研究还未见报道。本文通过比较基因组学的方法，从大白菜的基因组中鉴定出两个与拟南芥的APXl同源的基因，并对它们的结构特征、进化关系以及启动子上游序列中的顺式元件进行了分析，为进一步研究大白菜APXl基因的功能和利用此类基因进行大白菜耐热分子育种提供借鉴。
1 材料与方法
利用拟南芥的APXl基因序列来搜索NCBI数据库中大白菜的基因组序列。通过AUGUSTUS和NCBI BlastX来确定基因及其编码序列。利用Mega 4.1软件对这些基因进行遗传进化分析，并与拟南芥的APX基因进行比较分析。利用Pla-ntsP Feature Scan对大白菜的APXl蛋白进行结构域预测和分析。通过APXl编码区和基因组序列的比对来显示基因外显子和内含子的组成。根据编码区序列和其所在BAC的序列得到大白菜APXl基因起始密码子ATG上游1500 bp的序列。利用PLANTCARE对启动子区的顺式反应元件进行预测分析。利用WoLF PSORT对大白菜APXl基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测。
2 结果与分析
2.1 大白菜APXl基因的鉴定和特征分析
通过序列搜索和比对分析，从大白菜的基因组序列中鉴定出两个与拟南芥的APXl基因同源的基因，分别位于大白菜染色体文库克隆FP325101和FP085567中，暂命名为BrFP325101和BrFP085567(表1)。二者均定位在A8染色体上，编码区均为753 bp，内含子数目分别为5和6(见图1)。亚细胞定位预测显示，BrFP325101编码的蛋白定位到细胞质或者细胞核中，而BrFP085567编码的蛋白定位到线粒体和细胞质中。
2.2 大白菜APXl基因的进化分析
为了寻找大白菜APXl的功能线索，将大白菜APXl基因和拟南芥APXl基因进行遗传进化分析(图2)。结果表明，大白菜的两个APXl基因和拟南芥的APXl基因分布于一个类群，推测它们是直系同源基因。大白菜的这两个APXl基因可能是基因扩增和分化的结果。从进化上来看，BrFP085567与AtAPXl的关系更近，二者可能具有相似的功能。
2.3 大白菜APXl基因的顺式元件分析
顺式元件是重要的分子开关，基因的表达主要是顺式元件和反式作用因子相互作用的结果。为了对大白菜APXl基因的表达调控进行研究，本文进一步分析了大白菜APXl基因启动子及上游序列中的顺式调控元件(表2)。BrFP085567和BrFP325101都含有病原物响应元件Box-W1和w-box，茉莉酸甲酯响应元件CGTCA，干旱响应元件MBs，赤霉素响应元件GARE，水杨酸响应元件TEA，生长素响应元件TGA，生物钟响应元件Circadiall，但是它们含有同类元件的数目不尽相同。另外，BrFP085567含有热胁迫响应元件，而BrFP325101含有乙烯响应元件ERE和低温响应元件LTR。这说明大白菜的两个APXl基因在应答激素信号和逆境因子方面有所不同，可能研FP085567基因在热胁迫响应过程中具有重要功能。
3 结论
本研究利用比较基因组学的方法从大白菜的基因组中鉴定出两个与拟南芥APXl同源的基因BrFP085567和BrFP325101。进化分析表明它们均是拟南芥APXl的直系同源基因，启动子顺式元件分析显示这两个基因可响应荣莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸等多种激素和干旱等逆境，另外，BrFP085567还含有热激响应元件。已知拟南芥的APXl基因在热胁迫响应中具有重要功能，因此推断，大白菜的BrFP085567基因具有和拟南芥APXl基因相似的功能。本文为克隆大白菜的APXl基因和研究它们在热胁迫等逆境响应中的功能提供了有益信息。
参考文献：
[1]苏小俊，袁希汉，徐海大·白菜田间耐热性的鉴定方法江苏农业学报，2007，23(1)：78-80.
[2]苏小俊，袁希汉，徐海，大白菜耐热性和过氧化物酶活性与热害指数的相关性江苏农业学报，2007，23(5)：456-458。
[3]杨妍妍，杨建平，王清华，等，高温胁迫对大白菜超微弱发光及其他生理指标的影响西北农业学报，2006，15(S)：218-221.
[4]于拴仓，王永健，郑晓鹰，大白菜耐热性QTL定位与分析园艺学报，2003，30(4)：417-420.
[5]郑佳秋，侯喜林，陈晓峰，不结球白菜热激蛋白基因克隆及表达西北植物学报，2008，28(10)：1935-1940.
[6]朱波，不结球白菜抗逆相关转录因子的克隆及耐热耐寒
相关蛋白的功能鉴定南京：南京农业大学，2008.
[7]storozhanko s，De Pauw P，VanMontaguM，et aLThe heat-
shock element is a fynctional component of the ArabudopuisAPXl gene promoterP1ant PhysioL，1998，118(3)：1005 -1014.
[8]Pnueli L，Liang H，RozenhergM，et al，Cromh supprcssian，altered stomata]responses，and ausmented inductlon Df heatahock proteins cyto60llc ascorbate peroxldase(Apxl)-defi-clent Arabidopsis plants.plants.P1ant J，2003，34(2)：187-203.
[9]mzhskyL，Davletovas，LiangH，et al The zincfingerproteinZatl2 i8 required fbr cytosolic ascorbate peroxlda8e l expressionduring oxidative shess in Ababidopsis.J.Bi0L chem.2004，279(12)：11736-11743.
[10]Fourcroy P，vabsyyt G，Kushnir s，et al Iron-tegulated cx-pression of a cytosolic ascorbate peroxidase enceded by theAPXl gene in Arabldopsis seedlings.Plant PhysloL，2004134(2)：605-613.
[11]Dav]etova s，Rizhsky L，Liang H，et al cytosolic ascorbateporoxldase l is a central component of the reactive oxygen ganenetwork of Arabidops.Plant ceu，2005，17(1)：268-281.
[12]Kouasevltzky s，suzuki N，Huntington s，et aLAscorbate per-oxida8e1 playa key role in the response of Arabidopsis thali-aria to stress comblnation.J.BioL Chem.2008，283(49)：34197-34203.
[13]Yang K A，lim c J，Hang JK，et al.Identifieation of cellwall
genes modified by a permissive high temperature in Chinesecabbage.PlaIlt sciance，2006，171(1)：175-182.
关键词：大白菜；APXl；基因结构；遗传进化；顺式元件
中图分类号：Q781
文献标识号：A
文章编号：1001-4942(2011)01-0009-03
大白菜性喜冷凉，主要栽培于温带地区，是我国的重要蔬菜之一。生产上随着春夏季节大白菜种植面积的日益扩大，对品种的耐热性提出了较高的要求。目前，国内外学者对植物耐热遗传机制的研究取得了很大进展，克隆了一大批与植物耐热相关的基因。有关白菜类蔬菜耐热的生理机制、耐热性指标的筛选、耐热QTL定位和耐热品种的选育研究得也比较多，但是有关耐热分子机理的研究目前报道很少。苏小俊、杨妍妍等对白菜类蔬菜的耐热鉴定方法、耐热生理指标进行了探讨；于拴仓等鉴定出5个大白菜耐热QTL，并对它们的遗传效应进行了分析；Yang等克隆了与大白菜耐热相关的细胞壁基因，郑佳秋和朱波分别克隆了一个不结球白菜的热激蛋白BcHSP基因及NAC基因。鉴于大白菜耐热遗传研究的现状，为了更好地为大白菜耐热育种服务，有必要加强大白菜耐热分子遗传机制的研究，鉴定和克隆大白菜的耐热响应关键基因。
现有研究表明，植物热胁迫过程中会产生大量的活性氧物质，对植物细胞产生毒害作用。植物清除这些有害物质的能力与耐热性存在密切的关系。拟南芥的抗坏血酸还原酶基因APXl在植物抗氧化和热、干旱等多种逆境胁迫响应过程中具有重要功能。但是有关大白菜APXl基因的研究还未见报道。本文通过比较基因组学的方法，从大白菜的基因组中鉴定出两个与拟南芥的APXl同源的基因，并对它们的结构特征、进化关系以及启动子上游序列中的顺式元件进行了分析，为进一步研究大白菜APXl基因的功能和利用此类基因进行大白菜耐热分子育种提供借鉴。
1 材料与方法
利用拟南芥的APXl基因序列来搜索NCBI数据库中大白菜的基因组序列。通过AUGUSTUS和NCBI BlastX来确定基因及其编码序列。利用Mega 4.1软件对这些基因进行遗传进化分析，并与拟南芥的APX基因进行比较分析。利用Pla-ntsP Feature Scan对大白菜的APXl蛋白进行结构域预测和分析。通过APXl编码区和基因组序列的比对来显示基因外显子和内含子的组成。根据编码区序列和其所在BAC的序列得到大白菜APXl基因起始密码子ATG上游1500 bp的序列。利用PLANTCARE对启动子区的顺式反应元件进行预测分析。利用WoLF PSORT对大白菜APXl基因编码的蛋白进行亚细胞定位预测。
2 结果与分析
2.1 大白菜APXl基因的鉴定和特征分析
通过序列搜索和比对分析，从大白菜的基因组序列中鉴定出两个与拟南芥的APXl基因同源的基因，分别位于大白菜染色体文库克隆FP325101和FP085567中，暂命名为BrFP325101和BrFP085567(表1)。二者均定位在A8染色体上，编码区均为753 bp，内含子数目分别为5和6(见图1)。亚细胞定位预测显示，BrFP325101编码的蛋白定位到细胞质或者细胞核中，而BrFP085567编码的蛋白定位到线粒体和细胞质中。
2.2 大白菜APXl基因的进化分析
为了寻找大白菜APXl的功能线索，将大白菜APXl基因和拟南芥APXl基因进行遗传进化分析(图2)。结果表明，大白菜的两个APXl基因和拟南芥的APXl基因分布于一个类群，推测它们是直系同源基因。大白菜的这两个APXl基因可能是基因扩增和分化的结果。从进化上来看，BrFP085567与AtAPXl的关系更近，二者可能具有相似的功能。
2.3 大白菜APXl基因的顺式元件分析
顺式元件是重要的分子开关，基因的表达主要是顺式元件和反式作用因子相互作用的结果。为了对大白菜APXl基因的表达调控进行研究，本文进一步分析了大白菜APXl基因启动子及上游序列中的顺式调控元件(表2)。BrFP085567和BrFP325101都含有病原物响应元件Box-W1和w-box，茉莉酸甲酯响应元件CGTCA，干旱响应元件MBs，赤霉素响应元件GARE，水杨酸响应元件TEA，生长素响应元件TGA，生物钟响应元件Circadiall，但是它们含有同类元件的数目不尽相同。另外，BrFP085567含有热胁迫响应元件，而BrFP325101含有乙烯响应元件ERE和低温响应元件LTR。这说明大白菜的两个APXl基因在应答激素信号和逆境因子方面有所不同，可能研FP085567基因在热胁迫响应过程中具有重要功能。
3 结论
本研究利用比较基因组学的方法从大白菜的基因组中鉴定出两个与拟南芥APXl同源的基因BrFP085567和BrFP325101。进化分析表明它们均是拟南芥APXl的直系同源基因，启动子顺式元件分析显示这两个基因可响应荣莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸等多种激素和干旱等逆境，另外，BrFP085567还含有热激响应元件。已知拟南芥的APXl基因在热胁迫响应中具有重要功能，因此推断，大白菜的BrFP085567基因具有和拟南芥APXl基因相似的功能。本文为克隆大白菜的APXl基因和研究它们在热胁迫等逆境响应中的功能提供了有益信息。
参考文献：
[1]苏小俊，袁希汉，徐海大·白菜田间耐热性的鉴定方法江苏农业学报，2007，23(1)：78-80.
[2]苏小俊，袁希汉，徐海，大白菜耐热性和过氧化物酶活性与热害指数的相关性江苏农业学报，2007，23(5)：456-458。
[3]杨妍妍，杨建平，王清华，等，高温胁迫对大白菜超微弱发光及其他生理指标的影响西北农业学报，2006，15(S)：218-221.
[4]于拴仓，王永健，郑晓鹰，大白菜耐热性QTL定位与分析园艺学报，2003，30(4)：417-420.
[5]郑佳秋，侯喜林，陈晓峰，不结球白菜热激蛋白基因克隆及表达西北植物学报，2008，28(10)：1935-1940.
[6]朱波，不结球白菜抗逆相关转录因子的克隆及耐热耐寒
相关蛋白的功能鉴定南京：南京农业大学，2008.
[7]storozhanko s，De Pauw P，VanMontaguM，et aLThe heat-
shock element is a fynctional component of the ArabudopuisAPXl gene promoterP1ant PhysioL，1998，118(3)：1005 -1014.
[8]Pnueli L，Liang H，RozenhergM，et al，Cromh supprcssian，altered stomata]responses，and ausmented inductlon Df heatahock proteins cyto60llc ascorbate peroxldase(Apxl)-defi-clent Arabidopsis plants.plants.P1ant J，2003，34(2)：187-203.
[9]mzhskyL，Davletovas，LiangH，et al The zincfingerproteinZatl2 i8 required fbr cytosolic ascorbate peroxlda8e l expressionduring oxidative shess in Ababidopsis.J.Bi0L chem.2004，279(12)：11736-11743.
[10]Fourcroy P，vabsyyt G，Kushnir s，et al Iron-tegulated cx-pression of a cytosolic ascorbate peroxidase enceded by theAPXl gene in Arabldopsis seedlings.Plant PhysloL，2004134(2)：605-613.
[11]Dav]etova s，Rizhsky L，Liang H，et al cytosolic ascorbateporoxldase l is a central component of the reactive oxygen ganenetwork of Arabidops.Plant ceu，2005，17(1)：268-281.
[12]Kouasevltzky s，suzuki N，Huntington s，et aLAscorbate per-oxida8e1 playa key role in the response of Arabidopsis thali-aria to stress comblnation.J.BioL Chem.2008，283(49)：34197-34203.
[13]Yang K A，lim c J，Hang JK，et al.Identifieation of cellwall
genes modified by a permissive high temperature in Chinesecabbage.PlaIlt sciance，2006，171(1)：175-182.