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摘要据2011-2014年调查，甘肃省柴胡斑枯病发生严重，常年发病率为13%～21%，严重度1～2級。本研究以形态学和分子生物学方法相结合，明确了甘肃省柴胡斑枯病病原及其生物学特性。甘肃省柴胡斑枯病菌分生孢子器近球形或球形，黑褐色，高66.4～90.2 μm，平均77.5 μm；直径57.3～90.0 μm，平均70.5 μm。分生孢子针形、无色，有些稍弯曲，具1～3隔膜，大小（13.0～26.0）μm×（1.5～3.0）μm，平均19.0 μm×2.0 μm。通过ITS、LSU、RBP2和βtubline多基因位点构建系统发育树，将柴胡斑枯病病原鉴定为柴胡壳针孢Septoria bupleuricola Sacc.。该菌菌丝生长、分生孢子萌发和产孢的温度范围分别为0～35℃、0～35℃、5～35℃，最适温度分别为20～25℃、15℃、10～15℃；连续光照有利于菌丝生长、孢子萌发和病菌产孢；菌丝生长、孢子萌发和产孢的适宜pH范围分别为4.0～10.0、4.51～9.19和5.0～9.0，最适pH分别为5.0、6.49和5.5；此菌在相对湿度75%以上可萌发，以水中萌发最好；柴胡叶或根渍液对孢子萌发有较强的促进作用。表明柴胡壳针孢菌丝生长和孢子萌发的适宜温度偏低，因此该病害在气温偏低及持续阴雨结露条件下发生较重。
关键词
柴胡斑枯病；形态学；分子生物学；病原鉴定；生物学特性
中图分类号：
S 435.67
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.012
Pathogen identification and biological characteristics of leaf spot on
Bupleurum chinense
Wang Yan，Jin Ling，Zeng Cuiyun，Luo Jun，Zhu Tiantian
（Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）
Abstract
During disease surveys on medicinal plants in Gansu Province in 2011-2014， we found that leaf spot on Bupleurum chinense DC.was a serious disease with 13%-21% disease incidence and 1-2 level of disease severity. Morphological and molecular methods were combined to identify and test the biological characteristics of the pathogen. The pycnidia of the pathogen was spherical or subspherical， 66.4-90.2 μm （mean： 77.5 μm）in height， 57.3-90.0 μm （mean： 70.5 μm） in diameter， conidia hyaline， needle， with 1-3 septates of （13.0-26.0）μm×（1.5-3.0）μm （mean： 19.0 μm×2.0 μm） in size. Multilocus phylogenic analysis of the five loci： ITS， LSU， RBP2 and βtubulin showed that the pathogen was Septoria bupleuricola Sacc. The temperature ranges of hypha growth， spore germination and production were 0-35， 0-35 and 5-35℃， respectively. The optimum temperatures were 20-25， 15 and 10-15℃， correspondingly. Continuous illumination facilitates hyphal growth， spore production and germination. The pH ranges of the hypha growth， spore germination and production were 4.0-10.0， 4.51-9.19 and 5.0-9.0， with the optimum values of 5.0， 6.49 and 5.5， respectively. The relative humidity for spore germination was above 75%. Spores germinated well in water. Root and leaf extracts stimulated spore germination. The optimum temperature for mycelium growth and spore germination of the pathogen was low， indicating that the disease might worsen under lowtemperature， dewing and continuous rainy weather.
Key words
Bupleurum chinense leafspot；morphology；multilocus phylogeny；pathogen identification；biological characteristic 柴胡Bupleurum chinense DC.属伞形科多年生草本植物[1]，为我国常用大宗药材，始载于《神农本草经》，列为上品，以根入药，性味苦、微寒，具疏散退热，升阳，舒肝等功效，主治疟疾，肝郁气滞，胸肋胀痛等症[2]。主产于我国东北、华北、内蒙古、河南、陕西及甘肃等省区，多为野生[3]。由于长期过度采挖，野生资源不能满足市场需要，中国从20世纪80年代初开始研究野生变家种试验[4]。甘肃省是柴胡的道地产区之一，经调查，甘肃省定西市、陇南市以及河西地区均有大面积种植，仅定西市的陇西县柴胡种植面积就达到约2 000 hm2，陇南一带的礼县、清水县，河西地区的金昌、天祝、武威等地种植规模也在400 hm2，使甘肃的柴胡产量跃居全国之首[5]，2012年甘肃柴胡种植面积达19 090 hm2，年产量达4.34万t，占全国的50%[6]。
但是随着栽培面积逐年增大，柴胡病害发生日趋严重，国内记载柴胡病害主要有斑枯病Septoria bupleuri Sacc.[79]、壳二孢叶斑病Ascochyta bupleuri Thüm.[9]、锈病Puccinia bupleuri Rudolphi[10]、根腐病Fusarium oxysporum Schl.[11]、Rhizoctonia sp.[12]和链格孢叶斑病Alternaria alternata （Fr.：Fr.） Keissl.[13]。在2011-2014年甘肃省药用植物病害调查中，发现斑枯病是甘肃省柴胡生产中的主要病害，甘肃省定西地区陇西县、灵台县、渭源县、漳县及安定区都有发生，发病率平均13%～21%，严重度1～2级[12]。
作为柴胡栽培过程中影响柴胡质量和产量的重要病害，国内仅对其病原进行了记载，但是对该病害的发生危害情况，病原的生物学特性及病害的防治措施等均无系统的研究报道。本研究旨在对该病的病原进行研究，测定其生物学特性，同时提出一定的防治建议，为柴胡规范化种植以及斑枯病的有效防治提供一定的科学依据。
1材料与方法
1.1材料
供试菌种：2007年10月采自甘肃中医药大学药材示范园的柴胡斑枯病新鲜标样，经分离培养后镜检确定为壳针孢属真菌Septoria sp.，纯化后接种健康柴胡叶片发病的病菌，再次分离后，于4℃下保存备用。
1.2方法
1.2.1病原形态观察
从采集的柴胡斑枯病病叶组织上挑取病原分生孢子器，置于载玻片上，以水为浮载剂，在光学显微镜下观察并测定分生孢子器20个，分生孢子30个，分别取最大值和最小值作为该指标的上限和下限，同时观察菌株在PDA、OA和MEA培养基[14]上，于25℃下黑暗培养20 d的培养性状，并利用冷冻切片机对分生孢子器进行切片，观察分生孢子器内部结构，再参照相关资料[79]鉴定病原。
1.2.2病原菌DNA提取及系统发育树的构建
取在PD培养液中于20℃、45 r/min振荡培养7 d的柴胡斑枯病病原菌菌丝在液氮中研磨，用UNIQ10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（SK1375，上海生工）提取DNA。ITS、LSU、RBP2和βtubline 4个片段的PCR扩增分别采用引物ITS1/ITS4、LROR/LR5[15]、fRPB25f/fRPB27cR[16]、T1/βSandyR[1718]。50 μL PCR反应体系：10×PCR Buffer（含MgCl2 20 mmol/L）5 μL、dNTPs 10 mmol/L 0.5 μL、10 μmol/L引物各2.5 μL、2 U/μL Taq 4 μL、模板DNA 2 μL。PCR扩增条件：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，分别以53℃（ITS、LSU），55℃（RBP2），52℃（βtubulin）退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸8 min，4℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像仪进行观察并照相。PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序。并用BioEdit[19]软件反复校对，去除两端不确定的序列后，在GenBank中进行BLASTn比较搜索，下载相似序列并进行多基因片段的拼接，选用Readeriella mirabilis作为外群（菌株号：CBS125000；ITS、LSU、RBP2和βtublin在GenBank登录号分别为：KF251332、KF251836、KF252335和KF252804）。MEGA 6.0软件采用邻接法构建系统发育树。
1.2.3柴胡斑枯病菌生物学特性测定
1.2.3.1不同温度对菌丝生长、产孢量及孢子萌发的影响
在已培养30 d的菌落边缘打取直径为7 mm的菌饼接种于PDA平板上，分别置于5、10、15、20、25、30、35℃温度下培养，每温度处理重复3皿。每隔4 d用十字交叉法测定菌落大小，20 d后测定产孢量。孢子量测定采用血球计数板计数；孢子萌发采用悬滴培养，每温度处理重复3次，定時观察孢子萌发率，每重复观察计数5个视野约300个孢子，统计其萌发率。
1.2.3.2不同光照对菌丝生长、产孢量及孢子萌发的影响
将菌饼接种于PDA平板上，置25℃连续光照，光暗12 h交替及连续黑暗条件下培养；将孢子悬浮液于20℃在上述光照条件下悬滴培养，其他同上。
1.2.3.3不同pH对菌丝生长、产孢量及孢子萌发的影响
将菌饼接种于由NaOH和HCl调制的pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的PDA培养基平板上，25℃下培养；用柠檬酸磷酸二氢钾缓冲液配制pH为4.51、5.58、6.49、7.00、7.41、8.39、9.19的孢子悬浮液，20℃下悬滴培养，其他同上。 1.2.3.4不同湿度对孢子萌发的影响
将孢子悬浮液均匀涂抹于载玻片上，在室温下自然干燥，用小容器调节法，以硫酸控制相对湿度，湿度设置为70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99.5%，以100%饱和湿度为对照，共9个处理，20℃下培养。其他同上。
1.2.3.5不同营养条件对孢子萌发的影响
分别以尿素、马粪浸渍液、土壤浸渍液、葡萄糖、柴胡根浸液、柴胡叶浸液1∶5、1∶10、1∶20稀释成孢子悬浮液，20℃下悬滴培养[16]，其他同上。
2结果与分析
2.1症状
病原菌主要危害叶片、茎秆。叶部产生直径为1～2.5 mm的近圆形、椭圆形、半圆形小病斑，边缘紫褐色，稍隆起，中部黄褐色、灰褐色，后变灰白色。叶片两面的病斑上均可产生黑色小颗粒，即病菌的分生孢子器。有些病斑自叶尖向下扩展呈“V”字形，有些沿叶缘发生，造成中脉一侧枯死。发病严重时，病斑相互汇合，引起叶片枯死。
2.2病原
病原菌在PDA培养基上菌落灰白色至肉粉色，分生孢子器埋生在菌丝中，孢子量少，菌丝呈紫红色，菌丝壁较厚，产紫色色素，生长速度0.73 mm/d（图1a）；在OA培养上的培养性状同PDA培养基，生长速度：0.99 mm/d，有少量分生孢子器，似乎孢子还未成熟（图1b）；在MEA培养基上，菌落黑灰色，有大量的分生孢子器，孢子角肉粉色，生长速度0.44 mm/d（图1c）。
挑取组织上病原并对分生孢子器切片观察，此菌分生孢子器近球形或球形，黑褐色，器壁由1～2层细胞构成，高66.4～90.2 μm（平均77.5 μm），直径57.3～90.0 μm（平均70.5 μm）（图1d），外壁细胞黑褐色，内层淡褐色至无色，具圆形孔口，大小（10～30.2）μm×（10～31.4）μm，平均18 μm×20.25 μm，孔口细胞壁明显增厚；分生孢子梗产生于内壁细胞，无色，大小为（1.5～5.0）μm×（1.0～3.0）μm，平均2.7 μm×2.8 μm（图1e）。分生孢子针形、基部较圆，顶部较细、无色，有些稍弯曲，具1～3隔膜，大小（13.0～26.0）μm×（1.5～3.0）μm，平均19.0 μm×2.0 μm（图1f）。此菌分生孢子两端和中间细胞均可萌发长出无色芽管。经分离培养和从组织上挑取病原镜检，内有顺序排列的小油珠。该菌引起的病害在甘肃省干旱地区种植的柴胡上发生普遍，且较严重。
依据形态和培养特性，根据参考资料，将柴胡斑枯病菌鉴定为真菌界无性态真菌柴胡壳针孢Septaria bupleuricola Sacc.。
2.3柴胡枯斑病病原系统发育分析
通过对ITS、LSU、RBP2和βtubline片段的扩增和测序，得到长度分别为516、894、1 166和423 bp的序列（登录号分别为：KC874675，KY798144，KY798146和KY798145）。用BLASTn在GenBank中搜索并下载同源序列，通过多基因片段拼接并构建系统发育树发现，菌株TCM5与寄生于柴胡B.chinense的柴胡壳针孢S.bupleuricola（菌株：CBS128601，CBS128603）聚类在同一分支上（图2），同时该菌株分生孢子1～3个隔膜，孢子大小为（15.3～38.8）μm×（0.9～1.2）μm，与柴胡壳针孢S.bupleuricola相似，依据多基因序列片段和形态鉴定结果，将柴胡斑枯病菌TCM5鉴定为柴胡壳针孢S.bupleuricola。
2.4病原菌生物学特性
2.4.1温度对菌丝生长，产孢和孢子萌发的影响
该菌在0～35℃范围内均能生长，适宜温度为20～25℃，但生长缓慢，5～25℃病菌的生长量随温度的升高而缓慢升高，低于5℃或高于30℃生长速率急剧下降，在20℃下，生长速度最快，为0.6 mm/d，20 d时菌落直径11.8 mm；而35℃时急剧下降，20 d菌落直径仅为1.8 mm。这表明该菌生长极其缓慢，并且高温抑制该菌正常生长发育（表1）。
该菌产孢温度范围较宽，在5～35℃均能产孢，适宜温度为10～15℃，产孢量分别为18.1×104个/ cm2和18.5×104个/cm2，与其他温度的产孢量存在极显著的差异。低于5℃不产孢，高于30℃产孢量急剧下降（表1）。
1） 表中数据为平均值±SD，同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同。
Data are mean±SD.Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level by LSD. The same below.
分生孢子在0～35℃均可萌发，15℃为适宜萌发温度，30℃时萌发率急剧下降，35℃不萌发。该菌孢子萌发速度很缓慢，最適温度下8 h萌发率08%，72 h最高萌发率达36.5%（表1）。由此可见，病菌菌丝生长和孢子萌发速度均缓慢；孢子萌发和孢子形成的适温均为15℃，而菌丝生长的适温为（20～25℃），由此可见，柴胡壳针孢孢子形成、萌发和菌丝生长缓慢，但是适应温度范围较广，所以在甘肃省发生面积和地域范围较广。
2.4.2菌丝生长、产孢及孢子萌发的光照条件
从表2可以看出，菌丝在连续光照条件下生长较好，20 d菌落直径可达到11.0 mm，产孢量最大，达到5.8×104个/cm2，显著高于其他处理；同样分生孢子在连续光照条件下，72 h萌发率最高达34.3%。而在光暗交替和连续黑暗条件下菌落生长、产孢量和孢子萌发率无显著差异，但均低于连续光照。表明连续光照有利于菌丝生长、孢子萌发和病菌产孢。 2.4.3菌丝生长、产孢及孢子萌发的pH
表3结果表明：病菌生长适宜的pH范围较宽，在pH 4.0～10.0范围内均能生长，pH5.0时菌落生长最快，20 d可达到13.8 mm；产孢要求的pH为5.0～9.0。其中以pH 5.5产孢量最大，达到6.7×104个/cm2，pH低于5.0和高于9.0均不产孢。
表4结果表明：分生孢子在pH 4.51～9.19间均可萌发，以pH 6.49最好，72 h孢子萌发率达10.33%，pH高于7.00孢子萌发率逐渐下降。孢子的形成、萌发及菌丝的生长均以偏酸性条件为好。
2.4.4孢子萌发的湿度条件
表5结果表明：分生孢子在相对湿度75%～99.5%和水滴中均可萌发，以对照水滴中萌发最好，达到23.0%，与其他处理均有极显著差异，其次为100%的相对湿度，萌发率13.7%，而RH在99.5%以下，孢子萌发率逐渐下降，70%时不萌发。
2.4.5孢子萌发的营养条件
图3表明，分生孢子在柴胡叶片浸渍液中萌发最好，萌发率达57.0%～60.33%，高出对照40.66百分点，其次是柴胡根浸液和土壤浸渍液，分别为49.3%～60.5%及15.3%～26.5%，均高于清水對照的萌发率。
图4表明，柴胡斑枯病菌分生孢子萌发时速度很慢，即使在适宜的营养液中，前期12 h萌发率在10%左右， 24～48 h间增长至54%，说明24～48 h是孢子萌发的最快时期，这与温度、湿度等试验中的结果一致。
3讨论
3.1病原
生于柴胡叶上的壳针孢属真菌记载有4种：（1）S.amphigena Miyake，其分生孢子器120～150 μm，分生孢子3个隔膜，大小（18～22）μm×（1.5～2）μm； （2）S.buplenricola Sacc.，其分生孢子大小（24～30）μm×2 μm；（3）S.buplenrina，其分生孢子3个隔膜，大小（32～43）μm×2.2 μm；（4）S.buplenritaleati Diet.，其分生孢子3个隔膜，大小（30～40）μm×2 μm[9]。白金铠认为这4种菌在形态上均与S.buplenri相似，其分生孢子器大小（55～135）μm×（50～110）μm，分生孢子1～4个隔膜，多为2～3个隔膜，分生孢子器球形，分生孢子隔膜和大小也均相近，均应视为其异名。甘肃省柴胡斑枯病的病原通过形态学和分子生物学鉴定，确定为S.bupleuricola Sacc.。
3.2病原菌的生物学特性
病原菌的培养特性和生物学特性与病害的发生发展密切相关。壳针孢属Septoria真菌是在全球分布最广泛、最常见的一类病原菌，寄主范围广泛，可寄生于很多植物的叶片和果实上，引起叶斑或果斑症状[20]。该属真菌普遍生长缓慢，菌丝生长、产孢和孢子萌发均需要较低的温度和持续的露水。如当归褐斑病菌Septoria sp.分生孢子萌发的适温为20℃，相对湿度要求在75%以上[21]。本研究对柴胡斑枯病菌生物学特性的测定结果表明，该菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的最适温度分别为20～25℃、15、10～15℃，孢子萌发相对湿度要求在75%以上，菌丝生长、孢子萌发和产孢的适宜pH分别为5.0、6.49和5.5，因此在低温，高湿和中性偏酸环境下该病易于侵染和发生。甘肃省定西地区柴胡主产区陇西县、灵台县、渭源县、漳县及安定区等地属高寒阴湿地区，气温较低，阴湿多露，适于孢子的萌发和侵染，因此病害发生重。
3.3防治建议
在栽培过程中，建议多采用玉米柴胡和小麦柴胡套种模式， 不仅利用前作物的遮阴保湿作用代替地面盖草，节约了盖草成本，有利于柴胡出苗、出壮苗，而且还可以减少病虫害的发生[22]。依据课题组对当归褐斑病防治的研究[23]以及国内对龙胆草斑枯病的药剂防治研究结果[24]，建议在柴胡斑枯病发病初期喷施50%多菌灵可湿性粉剂600倍液、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂700倍液、10%苯醚甲环唑水分散颗粒剂1 800倍液、78%波·锰锌可湿性粉剂600倍液及70%丙森锌可湿性粉剂600倍液。7～10 d喷施1次，连续喷施3次。并且在柴胡收获后，彻底清除病残组织，集中烧毁或沤肥，减少越冬菌源，可减轻来年病害的发生。
参考文献
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（责任编辑：田喆）
关键词
柴胡斑枯病；形态学；分子生物学；病原鉴定；生物学特性
中图分类号：
S 435.67
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.06.012
Pathogen identification and biological characteristics of leaf spot on
Bupleurum chinense
Wang Yan，Jin Ling，Zeng Cuiyun，Luo Jun，Zhu Tiantian
（Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）
Abstract
During disease surveys on medicinal plants in Gansu Province in 2011-2014， we found that leaf spot on Bupleurum chinense DC.was a serious disease with 13%-21% disease incidence and 1-2 level of disease severity. Morphological and molecular methods were combined to identify and test the biological characteristics of the pathogen. The pycnidia of the pathogen was spherical or subspherical， 66.4-90.2 μm （mean： 77.5 μm）in height， 57.3-90.0 μm （mean： 70.5 μm） in diameter， conidia hyaline， needle， with 1-3 septates of （13.0-26.0）μm×（1.5-3.0）μm （mean： 19.0 μm×2.0 μm） in size. Multilocus phylogenic analysis of the five loci： ITS， LSU， RBP2 and βtubulin showed that the pathogen was Septoria bupleuricola Sacc. The temperature ranges of hypha growth， spore germination and production were 0-35， 0-35 and 5-35℃， respectively. The optimum temperatures were 20-25， 15 and 10-15℃， correspondingly. Continuous illumination facilitates hyphal growth， spore production and germination. The pH ranges of the hypha growth， spore germination and production were 4.0-10.0， 4.51-9.19 and 5.0-9.0， with the optimum values of 5.0， 6.49 and 5.5， respectively. The relative humidity for spore germination was above 75%. Spores germinated well in water. Root and leaf extracts stimulated spore germination. The optimum temperature for mycelium growth and spore germination of the pathogen was low， indicating that the disease might worsen under lowtemperature， dewing and continuous rainy weather.
Key words
Bupleurum chinense leafspot；morphology；multilocus phylogeny；pathogen identification；biological characteristic 柴胡Bupleurum chinense DC.属伞形科多年生草本植物[1]，为我国常用大宗药材，始载于《神农本草经》，列为上品，以根入药，性味苦、微寒，具疏散退热，升阳，舒肝等功效，主治疟疾，肝郁气滞，胸肋胀痛等症[2]。主产于我国东北、华北、内蒙古、河南、陕西及甘肃等省区，多为野生[3]。由于长期过度采挖，野生资源不能满足市场需要，中国从20世纪80年代初开始研究野生变家种试验[4]。甘肃省是柴胡的道地产区之一，经调查，甘肃省定西市、陇南市以及河西地区均有大面积种植，仅定西市的陇西县柴胡种植面积就达到约2 000 hm2，陇南一带的礼县、清水县，河西地区的金昌、天祝、武威等地种植规模也在400 hm2，使甘肃的柴胡产量跃居全国之首[5]，2012年甘肃柴胡种植面积达19 090 hm2，年产量达4.34万t，占全国的50%[6]。
但是随着栽培面积逐年增大，柴胡病害发生日趋严重，国内记载柴胡病害主要有斑枯病Septoria bupleuri Sacc.[79]、壳二孢叶斑病Ascochyta bupleuri Thüm.[9]、锈病Puccinia bupleuri Rudolphi[10]、根腐病Fusarium oxysporum Schl.[11]、Rhizoctonia sp.[12]和链格孢叶斑病Alternaria alternata （Fr.：Fr.） Keissl.[13]。在2011-2014年甘肃省药用植物病害调查中，发现斑枯病是甘肃省柴胡生产中的主要病害，甘肃省定西地区陇西县、灵台县、渭源县、漳县及安定区都有发生，发病率平均13%～21%，严重度1～2级[12]。
作为柴胡栽培过程中影响柴胡质量和产量的重要病害，国内仅对其病原进行了记载，但是对该病害的发生危害情况，病原的生物学特性及病害的防治措施等均无系统的研究报道。本研究旨在对该病的病原进行研究，测定其生物学特性，同时提出一定的防治建议，为柴胡规范化种植以及斑枯病的有效防治提供一定的科学依据。
1材料与方法
1.1材料
供试菌种：2007年10月采自甘肃中医药大学药材示范园的柴胡斑枯病新鲜标样，经分离培养后镜检确定为壳针孢属真菌Septoria sp.，纯化后接种健康柴胡叶片发病的病菌，再次分离后，于4℃下保存备用。
1.2方法
1.2.1病原形态观察
从采集的柴胡斑枯病病叶组织上挑取病原分生孢子器，置于载玻片上，以水为浮载剂，在光学显微镜下观察并测定分生孢子器20个，分生孢子30个，分别取最大值和最小值作为该指标的上限和下限，同时观察菌株在PDA、OA和MEA培养基[14]上，于25℃下黑暗培养20 d的培养性状，并利用冷冻切片机对分生孢子器进行切片，观察分生孢子器内部结构，再参照相关资料[79]鉴定病原。
1.2.2病原菌DNA提取及系统发育树的构建
取在PD培养液中于20℃、45 r/min振荡培养7 d的柴胡斑枯病病原菌菌丝在液氮中研磨，用UNIQ10柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒（SK1375，上海生工）提取DNA。ITS、LSU、RBP2和βtubline 4个片段的PCR扩增分别采用引物ITS1/ITS4、LROR/LR5[15]、fRPB25f/fRPB27cR[16]、T1/βSandyR[1718]。50 μL PCR反应体系：10×PCR Buffer（含MgCl2 20 mmol/L）5 μL、dNTPs 10 mmol/L 0.5 μL、10 μmol/L引物各2.5 μL、2 U/μL Taq 4 μL、模板DNA 2 μL。PCR扩增条件：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，分别以53℃（ITS、LSU），55℃（RBP2），52℃（βtubulin）退火45 s，72℃延伸1 min，共30个循环；最后72℃延伸8 min，4℃保存。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像仪进行观察并照相。PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序。并用BioEdit[19]软件反复校对，去除两端不确定的序列后，在GenBank中进行BLASTn比较搜索，下载相似序列并进行多基因片段的拼接，选用Readeriella mirabilis作为外群（菌株号：CBS125000；ITS、LSU、RBP2和βtublin在GenBank登录号分别为：KF251332、KF251836、KF252335和KF252804）。MEGA 6.0软件采用邻接法构建系统发育树。
1.2.3柴胡斑枯病菌生物学特性测定
1.2.3.1不同温度对菌丝生长、产孢量及孢子萌发的影响
在已培养30 d的菌落边缘打取直径为7 mm的菌饼接种于PDA平板上，分别置于5、10、15、20、25、30、35℃温度下培养，每温度处理重复3皿。每隔4 d用十字交叉法测定菌落大小，20 d后测定产孢量。孢子量测定采用血球计数板计数；孢子萌发采用悬滴培养，每温度处理重复3次，定時观察孢子萌发率，每重复观察计数5个视野约300个孢子，统计其萌发率。
1.2.3.2不同光照对菌丝生长、产孢量及孢子萌发的影响
将菌饼接种于PDA平板上，置25℃连续光照，光暗12 h交替及连续黑暗条件下培养；将孢子悬浮液于20℃在上述光照条件下悬滴培养，其他同上。
1.2.3.3不同pH对菌丝生长、产孢量及孢子萌发的影响
将菌饼接种于由NaOH和HCl调制的pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的PDA培养基平板上，25℃下培养；用柠檬酸磷酸二氢钾缓冲液配制pH为4.51、5.58、6.49、7.00、7.41、8.39、9.19的孢子悬浮液，20℃下悬滴培养，其他同上。 1.2.3.4不同湿度对孢子萌发的影响
将孢子悬浮液均匀涂抹于载玻片上，在室温下自然干燥，用小容器调节法，以硫酸控制相对湿度，湿度设置为70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99.5%，以100%饱和湿度为对照，共9个处理，20℃下培养。其他同上。
1.2.3.5不同营养条件对孢子萌发的影响
分别以尿素、马粪浸渍液、土壤浸渍液、葡萄糖、柴胡根浸液、柴胡叶浸液1∶5、1∶10、1∶20稀释成孢子悬浮液，20℃下悬滴培养[16]，其他同上。
2结果与分析
2.1症状
病原菌主要危害叶片、茎秆。叶部产生直径为1～2.5 mm的近圆形、椭圆形、半圆形小病斑，边缘紫褐色，稍隆起，中部黄褐色、灰褐色，后变灰白色。叶片两面的病斑上均可产生黑色小颗粒，即病菌的分生孢子器。有些病斑自叶尖向下扩展呈“V”字形，有些沿叶缘发生，造成中脉一侧枯死。发病严重时，病斑相互汇合，引起叶片枯死。
2.2病原
病原菌在PDA培养基上菌落灰白色至肉粉色，分生孢子器埋生在菌丝中，孢子量少，菌丝呈紫红色，菌丝壁较厚，产紫色色素，生长速度0.73 mm/d（图1a）；在OA培养上的培养性状同PDA培养基，生长速度：0.99 mm/d，有少量分生孢子器，似乎孢子还未成熟（图1b）；在MEA培养基上，菌落黑灰色，有大量的分生孢子器，孢子角肉粉色，生长速度0.44 mm/d（图1c）。
挑取组织上病原并对分生孢子器切片观察，此菌分生孢子器近球形或球形，黑褐色，器壁由1～2层细胞构成，高66.4～90.2 μm（平均77.5 μm），直径57.3～90.0 μm（平均70.5 μm）（图1d），外壁细胞黑褐色，内层淡褐色至无色，具圆形孔口，大小（10～30.2）μm×（10～31.4）μm，平均18 μm×20.25 μm，孔口细胞壁明显增厚；分生孢子梗产生于内壁细胞，无色，大小为（1.5～5.0）μm×（1.0～3.0）μm，平均2.7 μm×2.8 μm（图1e）。分生孢子针形、基部较圆，顶部较细、无色，有些稍弯曲，具1～3隔膜，大小（13.0～26.0）μm×（1.5～3.0）μm，平均19.0 μm×2.0 μm（图1f）。此菌分生孢子两端和中间细胞均可萌发长出无色芽管。经分离培养和从组织上挑取病原镜检，内有顺序排列的小油珠。该菌引起的病害在甘肃省干旱地区种植的柴胡上发生普遍，且较严重。
依据形态和培养特性，根据参考资料，将柴胡斑枯病菌鉴定为真菌界无性态真菌柴胡壳针孢Septaria bupleuricola Sacc.。
2.3柴胡枯斑病病原系统发育分析
通过对ITS、LSU、RBP2和βtubline片段的扩增和测序，得到长度分别为516、894、1 166和423 bp的序列（登录号分别为：KC874675，KY798144，KY798146和KY798145）。用BLASTn在GenBank中搜索并下载同源序列，通过多基因片段拼接并构建系统发育树发现，菌株TCM5与寄生于柴胡B.chinense的柴胡壳针孢S.bupleuricola（菌株：CBS128601，CBS128603）聚类在同一分支上（图2），同时该菌株分生孢子1～3个隔膜，孢子大小为（15.3～38.8）μm×（0.9～1.2）μm，与柴胡壳针孢S.bupleuricola相似，依据多基因序列片段和形态鉴定结果，将柴胡斑枯病菌TCM5鉴定为柴胡壳针孢S.bupleuricola。
2.4病原菌生物学特性
2.4.1温度对菌丝生长，产孢和孢子萌发的影响
该菌在0～35℃范围内均能生长，适宜温度为20～25℃，但生长缓慢，5～25℃病菌的生长量随温度的升高而缓慢升高，低于5℃或高于30℃生长速率急剧下降，在20℃下，生长速度最快，为0.6 mm/d，20 d时菌落直径11.8 mm；而35℃时急剧下降，20 d菌落直径仅为1.8 mm。这表明该菌生长极其缓慢，并且高温抑制该菌正常生长发育（表1）。
该菌产孢温度范围较宽，在5～35℃均能产孢，适宜温度为10～15℃，产孢量分别为18.1×104个/ cm2和18.5×104个/cm2，与其他温度的产孢量存在极显著的差异。低于5℃不产孢，高于30℃产孢量急剧下降（表1）。
1） 表中数据为平均值±SD，同列数据后不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同。
Data are mean±SD.Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level by LSD. The same below.
分生孢子在0～35℃均可萌发，15℃为适宜萌发温度，30℃时萌发率急剧下降，35℃不萌发。该菌孢子萌发速度很缓慢，最適温度下8 h萌发率08%，72 h最高萌发率达36.5%（表1）。由此可见，病菌菌丝生长和孢子萌发速度均缓慢；孢子萌发和孢子形成的适温均为15℃，而菌丝生长的适温为（20～25℃），由此可见，柴胡壳针孢孢子形成、萌发和菌丝生长缓慢，但是适应温度范围较广，所以在甘肃省发生面积和地域范围较广。
2.4.2菌丝生长、产孢及孢子萌发的光照条件
从表2可以看出，菌丝在连续光照条件下生长较好，20 d菌落直径可达到11.0 mm，产孢量最大，达到5.8×104个/cm2，显著高于其他处理；同样分生孢子在连续光照条件下，72 h萌发率最高达34.3%。而在光暗交替和连续黑暗条件下菌落生长、产孢量和孢子萌发率无显著差异，但均低于连续光照。表明连续光照有利于菌丝生长、孢子萌发和病菌产孢。 2.4.3菌丝生长、产孢及孢子萌发的pH
表3结果表明：病菌生长适宜的pH范围较宽，在pH 4.0～10.0范围内均能生长，pH5.0时菌落生长最快，20 d可达到13.8 mm；产孢要求的pH为5.0～9.0。其中以pH 5.5产孢量最大，达到6.7×104个/cm2，pH低于5.0和高于9.0均不产孢。
表4结果表明：分生孢子在pH 4.51～9.19间均可萌发，以pH 6.49最好，72 h孢子萌发率达10.33%，pH高于7.00孢子萌发率逐渐下降。孢子的形成、萌发及菌丝的生长均以偏酸性条件为好。
2.4.4孢子萌发的湿度条件
表5结果表明：分生孢子在相对湿度75%～99.5%和水滴中均可萌发，以对照水滴中萌发最好，达到23.0%，与其他处理均有极显著差异，其次为100%的相对湿度，萌发率13.7%，而RH在99.5%以下，孢子萌发率逐渐下降，70%时不萌发。
2.4.5孢子萌发的营养条件
图3表明，分生孢子在柴胡叶片浸渍液中萌发最好，萌发率达57.0%～60.33%，高出对照40.66百分点，其次是柴胡根浸液和土壤浸渍液，分别为49.3%～60.5%及15.3%～26.5%，均高于清水對照的萌发率。
图4表明，柴胡斑枯病菌分生孢子萌发时速度很慢，即使在适宜的营养液中，前期12 h萌发率在10%左右， 24～48 h间增长至54%，说明24～48 h是孢子萌发的最快时期，这与温度、湿度等试验中的结果一致。
3讨论
3.1病原
生于柴胡叶上的壳针孢属真菌记载有4种：（1）S.amphigena Miyake，其分生孢子器120～150 μm，分生孢子3个隔膜，大小（18～22）μm×（1.5～2）μm； （2）S.buplenricola Sacc.，其分生孢子大小（24～30）μm×2 μm；（3）S.buplenrina，其分生孢子3个隔膜，大小（32～43）μm×2.2 μm；（4）S.buplenritaleati Diet.，其分生孢子3个隔膜，大小（30～40）μm×2 μm[9]。白金铠认为这4种菌在形态上均与S.buplenri相似，其分生孢子器大小（55～135）μm×（50～110）μm，分生孢子1～4个隔膜，多为2～3个隔膜，分生孢子器球形，分生孢子隔膜和大小也均相近，均应视为其异名。甘肃省柴胡斑枯病的病原通过形态学和分子生物学鉴定，确定为S.bupleuricola Sacc.。
3.2病原菌的生物学特性
病原菌的培养特性和生物学特性与病害的发生发展密切相关。壳针孢属Septoria真菌是在全球分布最广泛、最常见的一类病原菌，寄主范围广泛，可寄生于很多植物的叶片和果实上，引起叶斑或果斑症状[20]。该属真菌普遍生长缓慢，菌丝生长、产孢和孢子萌发均需要较低的温度和持续的露水。如当归褐斑病菌Septoria sp.分生孢子萌发的适温为20℃，相对湿度要求在75%以上[21]。本研究对柴胡斑枯病菌生物学特性的测定结果表明，该菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的最适温度分别为20～25℃、15、10～15℃，孢子萌发相对湿度要求在75%以上，菌丝生长、孢子萌发和产孢的适宜pH分别为5.0、6.49和5.5，因此在低温，高湿和中性偏酸环境下该病易于侵染和发生。甘肃省定西地区柴胡主产区陇西县、灵台县、渭源县、漳县及安定区等地属高寒阴湿地区，气温较低，阴湿多露，适于孢子的萌发和侵染，因此病害发生重。
3.3防治建议
在栽培过程中，建议多采用玉米柴胡和小麦柴胡套种模式， 不仅利用前作物的遮阴保湿作用代替地面盖草，节约了盖草成本，有利于柴胡出苗、出壮苗，而且还可以减少病虫害的发生[22]。依据课题组对当归褐斑病防治的研究[23]以及国内对龙胆草斑枯病的药剂防治研究结果[24]，建议在柴胡斑枯病发病初期喷施50%多菌灵可湿性粉剂600倍液、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂700倍液、10%苯醚甲环唑水分散颗粒剂1 800倍液、78%波·锰锌可湿性粉剂600倍液及70%丙森锌可湿性粉剂600倍液。7～10 d喷施1次，连续喷施3次。并且在柴胡收获后，彻底清除病残组织，集中烧毁或沤肥，减少越冬菌源，可减轻来年病害的发生。
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（责任编辑：田喆）