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摘要 [目的]了解红柴胡nrDNA序列ITS2片段特征，为中药柴胡的分子鉴定提供科学依据。 [方法]从GenBank中获取已公布红柴胡ITS全长序列38条和ITS2序列3条，利用MEGA6.0 进行多序列比对，分析ITS2片段碱基成分、变异位点、信息位点，计算遗传距离，并用邻接法（NJ）构建系统聚类树。[结果]ITS2片段长度为224～230 bp，共发现14个简约信息位点，最大遗传距离0.124，系统树可明显分为4组，85.37%的聚为一组。[结论]ITS2在红柴胡居群中比较保守，可作为DNA barcoding鉴定的片段使用。
关键词 红柴胡;ITS2;遗传距离;发育分析
中图分类号 S188文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）04-0114-03
Abstract [Objective]Sequence character of nrDNA ITS2 fragment in Bupleurum scorzonerifolium Willd. was analyzed to provide scientific evidence in identification of traditional Chinese medicinal herb chaihu.[Method]Fortyone sequences including thirtyeight full length ITS and three ITS2 fragments were downloaded from GenBank.Nucleotide composition，variable sites，parsimony informative sites were analyzed after alignment in MEGA6.0.Meanwhile，the genetic distances were computed using Kimura2parameter （K2P） model and phylogenetic tree was constructed using the neighborjoining （NJ） method.[Result]The length of ITS2 varied from 224 bp to 230 bp including 14 parsimony informative sites，and the maximum K2P distance was 0.124.Four clades were grouped in NJ tree among which 85.37% sequences clustered in clade IV.[Conclusion]ITS2 is an ideal sequence in chaihu identification for its conservatism among B.scorzonerifolium populations.
Key words Bupleurum scorzonerifolium Willd.;ITS2;Genetic distance;Phylogenetic analysis
红柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）是《中国药典》收录的中药柴胡的2种基源植物之一，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气功效[1]。红柴胡广布于我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、山西、陕西、江苏、安徽、广西及内蒙古、甘肃诸省区，在俄罗斯远东、蒙古、朝鲜至日本也有分布[2]。虽然柴胡属的多数种类在国内各地均作为药材收购使用，但药性的差异仍不容忽视，因此，对红柴胡基源植物的准确鉴定依然是值得关注的问题。
核糖体内转录间隔区序列（internal translation spacer，ITS） 由于所受选择压力小、碱基替换较快、协同进化，且具有拷贝数大等特点，在植物种质资源鉴定、系统演化、遗传多样性等研究中被广泛应用[3-5]。ITS2 片段是位于5.8S 序列和 28S序列之间的nrDNA间隔区，片段短且易扩增、测序，变异位点能够保证其鉴定能力及鉴定的成功率，其具有良好的通用性，在多个科属基源植物及药材的鉴定中已得到了验证，被认为是最适合作为DNA 条形码的片段[6-10]。笔者基于GenBank数据对红柴胡nrDNA序列ITS2片段进行分析，以期为中药柴胡的分子鉴定提供科学依据。
1 研究方法
1.1 数据来源
从GenBank中下载已公布的所有红柴胡ITS全长序列38条和ITS2序列3条，与柴胡属标准ITS2序列对比，确定共计41条ITS2序列长度边界后作为该研究的DNA序列。
1.2 数据处理
首先，将序列导入MegAlign （Lasergene7.1）[11]，另存成.fas文件后，将所有序列用软件MEGA6.0[12]进行多序列比对，分析ITS2序列碱基成分、变异位点、信息位点，利用Kimura’s双参数模型计算遗传距离，并用邻接法（NJ）构建系统聚类树，Bootstrap设置1 000 次重复检验各分支的支持率。
2 结果与分析
2.1 序列特征与ITS2多态性
红柴胡的ITS2序列長度为224～230 bp，比对后长度为230 bp，含3处插入/缺失。 其中，KF573806长度为224 bp，AY551294长度为226 bp，其余39条序列均为230 bp，平均为229.8 bp，长度变异较小。GC含量占总核苷酸碱基的60.3%。共检测到32个变异位点，单变异位点18个，简约信息位点14个（表1）。
2.2 遗传距离 经比对，在41条序列中，有32条碱基完全一致，因此，在遗传距离运算中，除去了大部分相同序列，保留其中15条。采用Kimura-2参数模型计算ITS2序列间的遗传距离，结果见表2。其中AY551294与其他序列的距离为0.102～0.124，最大值在AY551294与MG770584和MG770585之间，为0.124。除碱基完全相同序列间的距离为0.000外，最小值出现在DQ285465与其他序列之间，为0.005。
2.3 系统发育分析
NJ系统发育分析将41条序列分为4个分支（图1）， Clade Ⅱ 仅有AY551294这1条序列;Clade Ⅱ包括EU001347、HM114235和JQ794896 这3条序列，自展支持率为94%;Clade Ⅲ由MG770585和MG770584这2条序列构成，自展支持率为99%;其余35条序列（包括32条完全相同）构成了Clade IV，自展支持率为95%，占全部序列的85.37%。
3 讨论
3.1 Gene Bank中红柴胡ITS2序列的存疑
对所有41条序列变异位点、遗传距离及系统树构建分析可以看出，序列AY551294与其他剩余序列差别最大，独立成为一支;序列EU001347、HM114235、JQ794896与其他序列间也存在较大差异，遗传距离在0.028～0.047;序列MG770585和 MG770584与其他序列的遗传距离在0.047～0.052。王长宝等[13]的研究表明AY551294代表的红柴胡与竹叶柴胡（B.marginatum）、窄竹叶柴胡（B.marginatum var.stenophyllum）关系较近，EU001347代表的红柴胡与三岛柴胡复合群（B.falcatum complex，2n=26 ）亲缘较近。通过在NCBI中Run Blast也发现AY551294与竹叶柴胡（KR902809）、窄竹叶柴胡（KX865159）的一致性（identites）=100%;EU001347与三岛柴胡复合群（KX865160、KP281271、KP058322、GU570603）的总分（total score）最大为1110，一致性（identites）=99%;MG770585和 MG770584序列代表的红柴胡与北柴胡（B.chinense）的总分（total score）最大为431，一致性（identites）=100%。因此，推测上述6条序列所代表的基源植物可能鉴定有误。
3.2 ITS2序列的分子鉴定意义
排除6条可疑序列，剩余35条聚成一支，且32条序列完全相同，即红柴胡ITS2片段的多态性很低，种内变异小。同时也说明了ITS2片段在红柴胡中谱系筛选比较完整，消除了不同拷贝之间的差异性，
完成了协同进化且具有系统学意义，显示出ITS2可以作为红柴胡DNA barcoding的备选序列。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：280.
[2] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志：第55卷[M].北京：科学出版社，1979：95-215.
[3] 王川易，郭宝林.植物核基因组核糖体基因间隔区序列的结构特点及其在系统发育研究中的应用[J].武汉植物学研究，2008，26（4）：417-423.
[4] 李学营，彭建营，白瑞霞.基于核 rDNA的 ITS 序列在种子植物系统发育研究中的应用[J].西北植物学报，2005，25（4）：829-834.
[5] VIJAYAN K，TSOU C H.DNA barcoding in plants：Taxonomy in a new perspective [J].Current science，2010，99（11）：1530-1541.
[6] 罗焜，陈士林，陈科力，等.基于芸香科的植物通用 DNA 条形码研究[J]. 中国科学：生命科学，2010，40（4）：342-358.
[7] YAO H，SONG J Y，LIU C，et al.Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals [J].PLoS One，2010，5（10）：1-9.
[8] PANG X H，SHI L C，SONG J Y，et al. Use of the potential DNA barcode ITS2 to identify herbal materials [J]. Journal of natural medicines，2013，67（3）：571-575.
[9] 李栎，肖憬，苏振宇，等.ITS2 条形码序列对茜草科黎药植物的鉴定[J]. 中草药，2013，43（13）：1814-1818.
[10] 侯典云，宋经元，石林春，等. 中药材锁阳的 ITS2 条形码分子鉴定研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（23）：4028-4032.
[11] BURLAND T G.DNASTAR's Lasergene sequence analysis software[M]//MISENER S，KRAWETZ S A.Bioinformatics methods and protocols.Totowa，New Jersey：Humana Press，2000.
[12] LEWIS P O，KUMAR S，TAMURA K，et al. MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J].Molecular biology & evolution，2013，30（12）：2725-2729.
[13] 王長宝，马祥光，何兴金.对东亚广义三岛柴胡的再认识及GenBank中几个有疑问nrDNA ITS序列的评价[J].江苏师范大学学报（自然科学版），2013，31（1）：64-73.
关键词 红柴胡;ITS2;遗传距离;发育分析
中图分类号 S188文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）04-0114-03
Abstract [Objective]Sequence character of nrDNA ITS2 fragment in Bupleurum scorzonerifolium Willd. was analyzed to provide scientific evidence in identification of traditional Chinese medicinal herb chaihu.[Method]Fortyone sequences including thirtyeight full length ITS and three ITS2 fragments were downloaded from GenBank.Nucleotide composition，variable sites，parsimony informative sites were analyzed after alignment in MEGA6.0.Meanwhile，the genetic distances were computed using Kimura2parameter （K2P） model and phylogenetic tree was constructed using the neighborjoining （NJ） method.[Result]The length of ITS2 varied from 224 bp to 230 bp including 14 parsimony informative sites，and the maximum K2P distance was 0.124.Four clades were grouped in NJ tree among which 85.37% sequences clustered in clade IV.[Conclusion]ITS2 is an ideal sequence in chaihu identification for its conservatism among B.scorzonerifolium populations.
Key words Bupleurum scorzonerifolium Willd.;ITS2;Genetic distance;Phylogenetic analysis
红柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）是《中国药典》收录的中药柴胡的2种基源植物之一，具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气功效[1]。红柴胡广布于我国黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东、山西、陕西、江苏、安徽、广西及内蒙古、甘肃诸省区，在俄罗斯远东、蒙古、朝鲜至日本也有分布[2]。虽然柴胡属的多数种类在国内各地均作为药材收购使用，但药性的差异仍不容忽视，因此，对红柴胡基源植物的准确鉴定依然是值得关注的问题。
核糖体内转录间隔区序列（internal translation spacer，ITS） 由于所受选择压力小、碱基替换较快、协同进化，且具有拷贝数大等特点，在植物种质资源鉴定、系统演化、遗传多样性等研究中被广泛应用[3-5]。ITS2 片段是位于5.8S 序列和 28S序列之间的nrDNA间隔区，片段短且易扩增、测序，变异位点能够保证其鉴定能力及鉴定的成功率，其具有良好的通用性，在多个科属基源植物及药材的鉴定中已得到了验证，被认为是最适合作为DNA 条形码的片段[6-10]。笔者基于GenBank数据对红柴胡nrDNA序列ITS2片段进行分析，以期为中药柴胡的分子鉴定提供科学依据。
1 研究方法
1.1 数据来源
从GenBank中下载已公布的所有红柴胡ITS全长序列38条和ITS2序列3条，与柴胡属标准ITS2序列对比，确定共计41条ITS2序列长度边界后作为该研究的DNA序列。
1.2 数据处理
首先，将序列导入MegAlign （Lasergene7.1）[11]，另存成.fas文件后，将所有序列用软件MEGA6.0[12]进行多序列比对，分析ITS2序列碱基成分、变异位点、信息位点，利用Kimura’s双参数模型计算遗传距离，并用邻接法（NJ）构建系统聚类树，Bootstrap设置1 000 次重复检验各分支的支持率。
2 结果与分析
2.1 序列特征与ITS2多态性
红柴胡的ITS2序列長度为224～230 bp，比对后长度为230 bp，含3处插入/缺失。 其中，KF573806长度为224 bp，AY551294长度为226 bp，其余39条序列均为230 bp，平均为229.8 bp，长度变异较小。GC含量占总核苷酸碱基的60.3%。共检测到32个变异位点，单变异位点18个，简约信息位点14个（表1）。
2.2 遗传距离 经比对，在41条序列中，有32条碱基完全一致，因此，在遗传距离运算中，除去了大部分相同序列，保留其中15条。采用Kimura-2参数模型计算ITS2序列间的遗传距离，结果见表2。其中AY551294与其他序列的距离为0.102～0.124，最大值在AY551294与MG770584和MG770585之间，为0.124。除碱基完全相同序列间的距离为0.000外，最小值出现在DQ285465与其他序列之间，为0.005。
2.3 系统发育分析
NJ系统发育分析将41条序列分为4个分支（图1）， Clade Ⅱ 仅有AY551294这1条序列;Clade Ⅱ包括EU001347、HM114235和JQ794896 这3条序列，自展支持率为94%;Clade Ⅲ由MG770585和MG770584这2条序列构成，自展支持率为99%;其余35条序列（包括32条完全相同）构成了Clade IV，自展支持率为95%，占全部序列的85.37%。
3 讨论
3.1 Gene Bank中红柴胡ITS2序列的存疑
对所有41条序列变异位点、遗传距离及系统树构建分析可以看出，序列AY551294与其他剩余序列差别最大，独立成为一支;序列EU001347、HM114235、JQ794896与其他序列间也存在较大差异，遗传距离在0.028～0.047;序列MG770585和 MG770584与其他序列的遗传距离在0.047～0.052。王长宝等[13]的研究表明AY551294代表的红柴胡与竹叶柴胡（B.marginatum）、窄竹叶柴胡（B.marginatum var.stenophyllum）关系较近，EU001347代表的红柴胡与三岛柴胡复合群（B.falcatum complex，2n=26 ）亲缘较近。通过在NCBI中Run Blast也发现AY551294与竹叶柴胡（KR902809）、窄竹叶柴胡（KX865159）的一致性（identites）=100%;EU001347与三岛柴胡复合群（KX865160、KP281271、KP058322、GU570603）的总分（total score）最大为1110，一致性（identites）=99%;MG770585和 MG770584序列代表的红柴胡与北柴胡（B.chinense）的总分（total score）最大为431，一致性（identites）=100%。因此，推测上述6条序列所代表的基源植物可能鉴定有误。
3.2 ITS2序列的分子鉴定意义
排除6条可疑序列，剩余35条聚成一支，且32条序列完全相同，即红柴胡ITS2片段的多态性很低，种内变异小。同时也说明了ITS2片段在红柴胡中谱系筛选比较完整，消除了不同拷贝之间的差异性，
完成了协同进化且具有系统学意义，显示出ITS2可以作为红柴胡DNA barcoding的备选序列。
参考文献
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[7] YAO H，SONG J Y，LIU C，et al.Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals [J].PLoS One，2010，5（10）：1-9.
[8] PANG X H，SHI L C，SONG J Y，et al. Use of the potential DNA barcode ITS2 to identify herbal materials [J]. Journal of natural medicines，2013，67（3）：571-575.
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[10] 侯典云，宋经元，石林春，等. 中药材锁阳的 ITS2 条形码分子鉴定研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（23）：4028-4032.
[11] BURLAND T G.DNASTAR's Lasergene sequence analysis software[M]//MISENER S，KRAWETZ S A.Bioinformatics methods and protocols.Totowa，New Jersey：Humana Press，2000.
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