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摘要 蓝莓浆果因富含花色素苷而呈现蓝色或红色，具有较高的食用保健价值与商品价值，近几年受到广泛关注。从花色素苷的结构与性质、花色素苷生物合成的结构基因与调控基因以及光照调控花色素苷生物合成机制等方面进行了综述，最后展望了蓝莓花色素苷合成及其调控研究。
关键词 蓝莓;花色素苷;结构基因;调控基因;光照调控
中图分类号 S663文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）04-0008-04
Abstract Blueberry fruits are rich in anthocyanins and present blue or red.Due to the high value of food，health care and commerce，blueberry fruits have been attracted wide attention in recent years.In this research，we reviewed the structure and properties of anthocyanins，the structure genes and its regulatory genes of anthocyanins biosynthesis and the mechanism of lightcontrol anthocyanins biosynthesis and so on.Furthermore，we prospected future research on the anthocynins biosynthesis and its regulation in blueberry.
Key words Blueberry;Anthocyanin;Structural gene;Regulatory gene;Lightcontrol
果实花色素苷（anthocyanins）（又名花青苷）积累的种类、多少和分布状况与果品色泽的表现密切相关，而果品色泽不仅是评价果品质量和商品性的重要指标，还直接影响到果品的商品价值和市场竞争力。蓝莓（Vaccinium spp.）（又名越橘）为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）植物，因其浆果富含花色素苷（anthocyanin）而显蓝色或红色。蓝莓不仅色泽鲜艳、可食率高（近100%），还具有广泛的医疗保健功能，如抗氧化、延缓衰老、改善记忆力、预防癌症和心脑血管疾病、保护视力等[1-4]。蓝莓具有较高的食用保健价值与商品价值，因此不仅深受消费者青睐，近几年来还受到研究者们的广泛关注。
1 花色素苷的结构与性质
花色素苷是由花色素（anthocyanidin）（又名花青素）與糖以糖苷键结合形成。花色素是一类天然的水溶性色素，属于黄酮类物质。花色素是3，5，7-三羟基-2-苯基苯并吡喃的衍生物，基本碳骨架为C6-C3-C6（图1）[5]。目前已知花色素有20多种，其中常见的花色素有6种，分别为天竺葵色素（pelargonidin）、芍药色素（peonidin）、矢车菊色素（cyanidin）、牵牛花色素（petunidin）、锦葵色素（malvidin）和飞燕草色素（delphinidin）[6-7]。花色素基本结构中B环R1、R2和R3碳位上会因取代基的不同而形成不同的花色素，各取代基的结构信息如表1所示。
游离的花色素不稳定，在植物体内花色素通常会经过糖基化等修饰形成各种花色素苷，使植物呈现各种颜色。冯贵涛（2016）鉴定并确认兔眼蓝莓“圆蓝”果实含有18个单体花色素，大多数以花色素苷形式存在，其中锦葵类占花色素总量36.93%，其次是矢车菊类占总量26.76%、飞燕草占总量16.69%，单体花色素含量最高的为锦葵-3-葡萄糖苷15.86%。
2 花色素苷的生物合成及其调控
花色素苷生物合成及调控是自身遗传背景和外界环境因子通过复杂的调控网络共同作用完成的。从自身遗传背景方面分析，花色素苷的生物合成主要受2类基因控制，一类是编码合成途径中相关酶的结构基因，另一类是对结构基因表达起调控作用的转录因子基因[8]（图2）。
2.1 花色素苷生物合成的结构基因
花色素苷通过莽草酸途径合成，其代谢途径已经比较明晰（图2）。大概分为3个阶段，第一阶段是苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）和香豆酰辅酶A连接酶（4-coumaroyl CoA-ligase，4CL）的作用下生成香豆酰辅酶A（4-coumaroyl-CoA）[9]。第二阶段是由香豆酰辅酶A到二氢黄酮醇（dihydroflavonol），一分子的香豆酰辅酶A和3分子的丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）经过查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS ）催化形成了查尔酮（chalcone），查尔酮接着在查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）的催化下生成柚皮素（naringenin），然后柚皮素又在黄烷酮-3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）、类黄酮-3’-羟化酶（flavonoid 3’-hydroxylase，F3’H）、类黄酮-3’5’-羟化酶（flavonoid 3’5’-hydroxylase，F3’5’H）的作用下生成多种二氢黄酮醇[10]。第三阶段就是各种花色素的合成阶段，二氢黄酮醇在二氢黄酮醇还原酶（dihydroflavonol-reductase，DFR）的催化下生成了各种无色的花色素，然后在花白素双加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX）和尿苷二磷酸葡萄糖类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT）作用下将无色花色素转化为有色花色素苷。 涉及花色素苷合成的结构基因有早期生物合成基因即上游基因，如CHS（查尔酮合酶）、CHI（查尔酮异构酶）和F3H（黄烷酮-3-羟化酶）等，还有晚期生物合成基因即下游基因，如F3’H（类黄酮-3’羟化酶）、F3’5’H（类黄酮-3’，5’-羟化酶）、DFR（二氢黄酮醇还原酶）、LDOX/ANS（花白素双加氧酶或花色素合成酶）和UFGT（类黄酮-O-糖基转移酶）等。不同结构基因在花色素苷积累中的作用强弱不同。如ANS和UFGT是红皮梨花色素苷合成的决定基因，它们的表达差异导致东方梨和西洋梨果皮著色的不同[11];CHS和UFGT是成熟期花色素苷积累型红肉桃种质的关键基因[12];LDOX和UFGT是调节红肉猕猴桃[13-14]和蓝莓[15]花色素苷积累的关键基因;而DFR是血橙花色素苷积累的重要基因[16];遮光处理通过改变F3’H与F3’5’H的转录水平，降低了葡萄花色素苷含量并改变了其组成[17]。抑制结构基因表达可阻碍花色素苷的积累。如Liu等[13]利用VIGS（virus-induced gene silencing）技术使UFGT沉默，发现红肉猕猴桃红色延迟且花色素苷含量下降;应用RNAi（RNA interference）技术干涉F3H和UFGT基因表达，检测到草莓花色素苷水平大幅减少。
2.2 花色素苷生物合成的调节基因
花色素生物合成基因除了结构基因外，还有一类可调控花色素合成的调节基因。调节基因是在转录水平上，对结构基因的表达进行调控，花色素中的调节基因一般是转录因子。调控花色素合成的转录因子主要分为3类：MYB家族、bHLH家族和WD40重复蛋白[18]。但研究表明，调控结构基因的转录从来不是单个转录因子作用的结果，花色素的合成通常会受1个大的转录因子复合体的调控[19]。MYB、bHLH和WD40蛋白相互作用形成一个大的转录复合体MYB-bHLH-WD40（MBW）（图2）。转录因子是一类DNA结合蛋白，能够与结构基因启动子中含有的能被识别的顺式作用元件发生特异性结合，单独或协同调节花色素苷生物合成途径中1个或多个结构基因的表达，从而有效控制花色素苷的合成[20]。如Yao等[21]研究发现转录因子MYB114与bHLH3共同调节红皮梨花色素苷的合成;类似地，MYB10.1、MBW复合体和MYBPA1类型的MYB转录因子分别参与了甜樱桃[22]、血橙[16]和蓝莓[23]的花色素苷合成;MYB10在光诱导草莓[24]、红肉苹果[25-26]花色素苷合成中担负着重要的调节作用;套袋处理能引起苹果表观遗传变化，使绿皮转变为红皮，主要与去袋后MYBs受光激活促进花色素苷积累有关[27]。转录因子除了正向调控花色素苷积累外，还存在负向调控方式。如MYB1、MYB4和MYB16分别负向调控草莓[28]、葡萄[29]和苹果[30]的花色素苷合成。转录因子的功能可以在烟草等模式植物中得到间接验证。如MYB114和MYB10共转化到烟草或草莓后可引起转基因植株花色素苷含量明显升高[21];红皮桃MYB10.1[31]、苹果MYB1和bHLH3[32]分别转入烟草中表达后，发现烟草花色素苷积累明显升高。
2.3 光照调节花色素苷生物合成机制
花色素苷生物合成除受自身遗传背景的调控外，还受外界环境因子的影响。光照是影响果实花色素苷合成最重要的环境因子。一方面，光照可通过影响光合作用促进糖、苯丙氨酸等花色素苷前体物质的合成;另一方面，光照可通过光信号转导途径调控花色素苷生物合成的结构基因和相关转录因子的表达，进而促进花色素苷的积累[8]。植物对光信号的响应是复杂而精细的，目前已知与花色素苷合成有关的光受体有感受红光/远红光的光敏色素、感受蓝光和UV-A的隐花色素和向光素、感受UV-B的UVR8受体（UV Resistance Locus 8）[33]。将光信号与花色素苷合成直接联系起来的是光形态建成调控因子HY5和COP1（Constitutive photomorphogenic 1）。在拟南芥和茄子上的相关研究显示，光照条件下，光受体与COP1相互作用，抑制COP1的负向调控功能，下游转录因子HY5就可以通过MYB激活花色素苷合成基因，从而促进花色素苷的积累（图2）;黑暗条件下，COP1泛素化降解HY5，抑制花色素苷的积累[34-36];HY5还可以通过抑制花色素苷负向调控因子MYBL2表达，提高MBW复合体的稳定性，进而促进花色素苷后期合成基因表达，引起花色素苷积累[37]。杨俊枫等[38]发现UV可能通过诱导PAL和UFGT的转录激活促进北高丛蓝莓“北陆”果实花色素苷的积累。
在果树生产实践中，一方面可以通过套袋、叶幕管理、架遮阳网和地面遮阴等措施，适当降低光照强度，改变光质成分，防止果实日灼，使果实着色均匀;另一方面，可以通过铺反光膜和补光，适当延长光照时间，提高光照强度，增加花色素苷积累，促进果实着色。生产上经常采用果实套袋等栽培技术改进果实的着色，其依据是不同光质、光强及光照时间会对果实花色素苷的积累产生不同的影响。如冀晓昊等[39]研究发现，不同颜色果袋对葡萄花色素苷积累产生差异，其调控路径可能是通过影响转录因子HY5的表达，进而调控转录因子MYBA1和结构基因如CHS、LDOX和UFGT等的表达来实现的。类似地，不同红皮梨受光着色差异不仅与MYB10、bHLH33及WD40的不同调控方式有关，还与HY5、COP1等调控因子的参与有关[40]。可见，光照对果实花色素苷合成的调控机制也是复杂的。
当然，除了光照，还有温度与激素等内外因子均会对蓝莓果实花色素苷的合成与积累产生较大影响。内源激素主要是通过调节花色素苷合成途径中的结构基因或转录因子的表达[41]，或者通过诱导糖类物质的合成[42]进而影响花色素苷的积累。花色素苷生物合成过程中所涉及的各种酶类活性受到温度的高低变化的影响，温度过高或过低都会抑制相关酶类活性进而抑制花色素苷的合成[43-44]。 3 展望
目前，我国蓝莓产业及相关研究正处于上升时期，研究蓝莓花色素苷生物合成及其调控机制，有利于果实色泽育种及提高果实品质，是蓝莓产业化进程中很重要的应用基础研究课题。虽然果实花色素苷合成及调控机制在苹果、葡萄和梨等大宗水果中的研究相对较多，但在蓝莓这种富含花色素苷的特色浆果中的相关研究还相对滞后。栽培上蓝莓种类品种较多，不同种类品种蓝莓果实花色素苷生物合成中，哪些结构基因起到关键的调控作用;不同蓝莓种类品种间有何差异;进一步，关键结构基因的表达又受哪些关键调节基因（转录因子）的調控;光照等内外因子在调控蓝莓果实花色素的合成的内在机制也还需要进一步揭示，以及在栽培生产实际中，可采用哪些措施有利于蓝莓果实花色素苷的合成与积累，进而提高果实品质等等，都还需要进一步去探索与实践。
随着组学研究的不断深入，蓝莓花色素苷的合成以及调控机理将会逐渐清晰，这将有利于更好地开发利用花色素苷，推动蓝莓产业的可持续发展。
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关键词 蓝莓;花色素苷;结构基因;调控基因;光照调控
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Abstract Blueberry fruits are rich in anthocyanins and present blue or red.Due to the high value of food，health care and commerce，blueberry fruits have been attracted wide attention in recent years.In this research，we reviewed the structure and properties of anthocyanins，the structure genes and its regulatory genes of anthocyanins biosynthesis and the mechanism of lightcontrol anthocyanins biosynthesis and so on.Furthermore，we prospected future research on the anthocynins biosynthesis and its regulation in blueberry.
Key words Blueberry;Anthocyanin;Structural gene;Regulatory gene;Lightcontrol
果实花色素苷（anthocyanins）（又名花青苷）积累的种类、多少和分布状况与果品色泽的表现密切相关，而果品色泽不仅是评价果品质量和商品性的重要指标，还直接影响到果品的商品价值和市场竞争力。蓝莓（Vaccinium spp.）（又名越橘）为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）植物，因其浆果富含花色素苷（anthocyanin）而显蓝色或红色。蓝莓不仅色泽鲜艳、可食率高（近100%），还具有广泛的医疗保健功能，如抗氧化、延缓衰老、改善记忆力、预防癌症和心脑血管疾病、保护视力等[1-4]。蓝莓具有较高的食用保健价值与商品价值，因此不仅深受消费者青睐，近几年来还受到研究者们的广泛关注。
1 花色素苷的结构与性质
花色素苷是由花色素（anthocyanidin）（又名花青素）與糖以糖苷键结合形成。花色素是一类天然的水溶性色素，属于黄酮类物质。花色素是3，5，7-三羟基-2-苯基苯并吡喃的衍生物，基本碳骨架为C6-C3-C6（图1）[5]。目前已知花色素有20多种，其中常见的花色素有6种，分别为天竺葵色素（pelargonidin）、芍药色素（peonidin）、矢车菊色素（cyanidin）、牵牛花色素（petunidin）、锦葵色素（malvidin）和飞燕草色素（delphinidin）[6-7]。花色素基本结构中B环R1、R2和R3碳位上会因取代基的不同而形成不同的花色素，各取代基的结构信息如表1所示。
游离的花色素不稳定，在植物体内花色素通常会经过糖基化等修饰形成各种花色素苷，使植物呈现各种颜色。冯贵涛（2016）鉴定并确认兔眼蓝莓“圆蓝”果实含有18个单体花色素，大多数以花色素苷形式存在，其中锦葵类占花色素总量36.93%，其次是矢车菊类占总量26.76%、飞燕草占总量16.69%，单体花色素含量最高的为锦葵-3-葡萄糖苷15.86%。
2 花色素苷的生物合成及其调控
花色素苷生物合成及调控是自身遗传背景和外界环境因子通过复杂的调控网络共同作用完成的。从自身遗传背景方面分析，花色素苷的生物合成主要受2类基因控制，一类是编码合成途径中相关酶的结构基因，另一类是对结构基因表达起调控作用的转录因子基因[8]（图2）。
2.1 花色素苷生物合成的结构基因
花色素苷通过莽草酸途径合成，其代谢途径已经比较明晰（图2）。大概分为3个阶段，第一阶段是苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）和香豆酰辅酶A连接酶（4-coumaroyl CoA-ligase，4CL）的作用下生成香豆酰辅酶A（4-coumaroyl-CoA）[9]。第二阶段是由香豆酰辅酶A到二氢黄酮醇（dihydroflavonol），一分子的香豆酰辅酶A和3分子的丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）经过查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS ）催化形成了查尔酮（chalcone），查尔酮接着在查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）的催化下生成柚皮素（naringenin），然后柚皮素又在黄烷酮-3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）、类黄酮-3’-羟化酶（flavonoid 3’-hydroxylase，F3’H）、类黄酮-3’5’-羟化酶（flavonoid 3’5’-hydroxylase，F3’5’H）的作用下生成多种二氢黄酮醇[10]。第三阶段就是各种花色素的合成阶段，二氢黄酮醇在二氢黄酮醇还原酶（dihydroflavonol-reductase，DFR）的催化下生成了各种无色的花色素，然后在花白素双加氧酶（leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX）和尿苷二磷酸葡萄糖类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT）作用下将无色花色素转化为有色花色素苷。 涉及花色素苷合成的结构基因有早期生物合成基因即上游基因，如CHS（查尔酮合酶）、CHI（查尔酮异构酶）和F3H（黄烷酮-3-羟化酶）等，还有晚期生物合成基因即下游基因，如F3’H（类黄酮-3’羟化酶）、F3’5’H（类黄酮-3’，5’-羟化酶）、DFR（二氢黄酮醇还原酶）、LDOX/ANS（花白素双加氧酶或花色素合成酶）和UFGT（类黄酮-O-糖基转移酶）等。不同结构基因在花色素苷积累中的作用强弱不同。如ANS和UFGT是红皮梨花色素苷合成的决定基因，它们的表达差异导致东方梨和西洋梨果皮著色的不同[11];CHS和UFGT是成熟期花色素苷积累型红肉桃种质的关键基因[12];LDOX和UFGT是调节红肉猕猴桃[13-14]和蓝莓[15]花色素苷积累的关键基因;而DFR是血橙花色素苷积累的重要基因[16];遮光处理通过改变F3’H与F3’5’H的转录水平，降低了葡萄花色素苷含量并改变了其组成[17]。抑制结构基因表达可阻碍花色素苷的积累。如Liu等[13]利用VIGS（virus-induced gene silencing）技术使UFGT沉默，发现红肉猕猴桃红色延迟且花色素苷含量下降;应用RNAi（RNA interference）技术干涉F3H和UFGT基因表达，检测到草莓花色素苷水平大幅减少。
2.2 花色素苷生物合成的调节基因
花色素生物合成基因除了结构基因外，还有一类可调控花色素合成的调节基因。调节基因是在转录水平上，对结构基因的表达进行调控，花色素中的调节基因一般是转录因子。调控花色素合成的转录因子主要分为3类：MYB家族、bHLH家族和WD40重复蛋白[18]。但研究表明，调控结构基因的转录从来不是单个转录因子作用的结果，花色素的合成通常会受1个大的转录因子复合体的调控[19]。MYB、bHLH和WD40蛋白相互作用形成一个大的转录复合体MYB-bHLH-WD40（MBW）（图2）。转录因子是一类DNA结合蛋白，能够与结构基因启动子中含有的能被识别的顺式作用元件发生特异性结合，单独或协同调节花色素苷生物合成途径中1个或多个结构基因的表达，从而有效控制花色素苷的合成[20]。如Yao等[21]研究发现转录因子MYB114与bHLH3共同调节红皮梨花色素苷的合成;类似地，MYB10.1、MBW复合体和MYBPA1类型的MYB转录因子分别参与了甜樱桃[22]、血橙[16]和蓝莓[23]的花色素苷合成;MYB10在光诱导草莓[24]、红肉苹果[25-26]花色素苷合成中担负着重要的调节作用;套袋处理能引起苹果表观遗传变化，使绿皮转变为红皮，主要与去袋后MYBs受光激活促进花色素苷积累有关[27]。转录因子除了正向调控花色素苷积累外，还存在负向调控方式。如MYB1、MYB4和MYB16分别负向调控草莓[28]、葡萄[29]和苹果[30]的花色素苷合成。转录因子的功能可以在烟草等模式植物中得到间接验证。如MYB114和MYB10共转化到烟草或草莓后可引起转基因植株花色素苷含量明显升高[21];红皮桃MYB10.1[31]、苹果MYB1和bHLH3[32]分别转入烟草中表达后，发现烟草花色素苷积累明显升高。
2.3 光照调节花色素苷生物合成机制
花色素苷生物合成除受自身遗传背景的调控外，还受外界环境因子的影响。光照是影响果实花色素苷合成最重要的环境因子。一方面，光照可通过影响光合作用促进糖、苯丙氨酸等花色素苷前体物质的合成;另一方面，光照可通过光信号转导途径调控花色素苷生物合成的结构基因和相关转录因子的表达，进而促进花色素苷的积累[8]。植物对光信号的响应是复杂而精细的，目前已知与花色素苷合成有关的光受体有感受红光/远红光的光敏色素、感受蓝光和UV-A的隐花色素和向光素、感受UV-B的UVR8受体（UV Resistance Locus 8）[33]。将光信号与花色素苷合成直接联系起来的是光形态建成调控因子HY5和COP1（Constitutive photomorphogenic 1）。在拟南芥和茄子上的相关研究显示，光照条件下，光受体与COP1相互作用，抑制COP1的负向调控功能，下游转录因子HY5就可以通过MYB激活花色素苷合成基因，从而促进花色素苷的积累（图2）;黑暗条件下，COP1泛素化降解HY5，抑制花色素苷的积累[34-36];HY5还可以通过抑制花色素苷负向调控因子MYBL2表达，提高MBW复合体的稳定性，进而促进花色素苷后期合成基因表达，引起花色素苷积累[37]。杨俊枫等[38]发现UV可能通过诱导PAL和UFGT的转录激活促进北高丛蓝莓“北陆”果实花色素苷的积累。
在果树生产实践中，一方面可以通过套袋、叶幕管理、架遮阳网和地面遮阴等措施，适当降低光照强度，改变光质成分，防止果实日灼，使果实着色均匀;另一方面，可以通过铺反光膜和补光，适当延长光照时间，提高光照强度，增加花色素苷积累，促进果实着色。生产上经常采用果实套袋等栽培技术改进果实的着色，其依据是不同光质、光强及光照时间会对果实花色素苷的积累产生不同的影响。如冀晓昊等[39]研究发现，不同颜色果袋对葡萄花色素苷积累产生差异，其调控路径可能是通过影响转录因子HY5的表达，进而调控转录因子MYBA1和结构基因如CHS、LDOX和UFGT等的表达来实现的。类似地，不同红皮梨受光着色差异不仅与MYB10、bHLH33及WD40的不同调控方式有关，还与HY5、COP1等调控因子的参与有关[40]。可见，光照对果实花色素苷合成的调控机制也是复杂的。
当然，除了光照，还有温度与激素等内外因子均会对蓝莓果实花色素苷的合成与积累产生较大影响。内源激素主要是通过调节花色素苷合成途径中的结构基因或转录因子的表达[41]，或者通过诱导糖类物质的合成[42]进而影响花色素苷的积累。花色素苷生物合成过程中所涉及的各种酶类活性受到温度的高低变化的影响，温度过高或过低都会抑制相关酶类活性进而抑制花色素苷的合成[43-44]。 3 展望
目前，我国蓝莓产业及相关研究正处于上升时期，研究蓝莓花色素苷生物合成及其调控机制，有利于果实色泽育种及提高果实品质，是蓝莓产业化进程中很重要的应用基础研究课题。虽然果实花色素苷合成及调控机制在苹果、葡萄和梨等大宗水果中的研究相对较多，但在蓝莓这种富含花色素苷的特色浆果中的相关研究还相对滞后。栽培上蓝莓种类品种较多，不同种类品种蓝莓果实花色素苷生物合成中，哪些结构基因起到关键的调控作用;不同蓝莓种类品种间有何差异;进一步，关键结构基因的表达又受哪些关键调节基因（转录因子）的調控;光照等内外因子在调控蓝莓果实花色素的合成的内在机制也还需要进一步揭示，以及在栽培生产实际中，可采用哪些措施有利于蓝莓果实花色素苷的合成与积累，进而提高果实品质等等，都还需要进一步去探索与实践。
随着组学研究的不断深入，蓝莓花色素苷的合成以及调控机理将会逐渐清晰，这将有利于更好地开发利用花色素苷，推动蓝莓产业的可持续发展。
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