【摘 要】
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目的 构建携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因的新型真核表达载体pIRES-EGFP-VEGF165,并通过转染人脐静脉内皮细胞株EA.hy926细胞,观察载体的体外表达和对血管内皮
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科
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目的 构建携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)基因的新型真核表达载体pIRES-EGFP-VEGF165,并通过转染人脐静脉内皮细胞株EA.hy926细胞,观察载体的体外表达和对血管内皮细胞增殖的影响.方法 将VEGF165目的 基因片段插入到真核表达载体pIRES-EGFP质粒中,按每孔加入质粒DNA 1.2μg介导体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞株EA.hy926细胞,通过荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,n=3)和Western blot(n=5)分别检测mRNA和蛋白水平的表达,并通过MTT法(n=5)检测转染pIRES-EGFP-VEGF165质粒对血管内皮细胞增殖的促进作用.结果 成功构建pIRES-EGFP-VEGF165真核表达载体,测序结果 与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞株EA.by926细胞的转染效率约为(11.2±2.5)%;荧光实时定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-EGFP-VEGF165质粒组细胞在mRNA和蛋白水平表达的VEGF165均高于对照组(P＜0.01),MTT法检测表明转染pIRES-EGFP-VEGF165质粒组细胞增殖速度较对照组明显增加(P＜0.01).结论 成功构建pIRES-EGFP-VEGF165真核表达载体,并实现其在人脐静脉内皮细胞株EA.hy926细胞中的表达,而且证实可以促进血管内皮细胞的增殖.
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