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[目的]摸索一种适合昆明小鼠ES细胞分离培养的方法,以提高昆明小鼠ES细胞的建系率。[方法]分别采用5种方法分离ICM和ES细胞集落,摸索了以BMSCs作为饲养层时,丝裂酶素处理的合适时间。[结果]连续消化法要明显好于其他4种方法。MMC处理BMSCs1、1.5、2h时效果较好,3个时间点无显著差异（P〉0.05）。mMEF作为饲养层与BMSCs作为饲养层时获得5代ES细胞相比差异不显著（P〉0.05）。[结论]连续消化法分离ES细胞效率较高,饲养层采用MMC处理1～2h的BMSCs饲养层或常规mMEF饲