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摘 要：根据DHBV的C基因参考序列设计一对特异性引物建立PCR检测方法。建立的PCR方法只能特异地检出DHBV，该方法最低检出模板量为146pg。用建立的PCR方法对2015～2018年不同地区的樱桃谷鸭血清进行检测，结果发现不同鸭群中乙型肝炎的感染率差异较大，没有明显的时空分布规律。对2019年不同日龄和品种的鸭进行采样检测，结果发现樱桃谷肉鸭和麻鸭的自然感染率均较高，但不同日龄之间无明显规律。种鸭的自然感染率较低，且随着日龄的增大，感染率略有升高。鹅也可以感染鸭乙型肝炎病毒。
关键词：鸭乙型肝炎病毒;流行病学
中图分类号：S858.321：31+3 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2020）4-0048-04
乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的一个主要公共卫生问题。由于HBV宿主范围狭窄，有明显嗜肝性和种属特异性，建立较理想的HBV感染细胞及动物模型都很困难，成为限制抗HBV药物开发和评价的主要障碍[1]。鸭乙型肝炎病毒（DHBV）与HBV同属嗜肝DNA病毒科，两者在形态结构、核酸组成、生物学特性、发病机理和相对嗜肝性等方面有众多相似之处，而鸭对DHBV易感，且价格低廉，易于饲养，因此鸭乙型肝炎模型被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的理想动物模型[2-3]。因此，需要建立相应的快速检测方法对模型动物中DHBV感染情况进行分析，为今后开展有效的药物评价奠定良好基础。
1 材料与方法
1.1 DHBV参考毒株（WS株） 郑州大学惠赠。
1.2 临床样品 由山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室采集保存。
1.3 鸭乙型肝炎病毒PCR检测方法的建立
1.3.1 引物设计合成 根据Genbank中登录的DHBV的C基因参考序列设计合成一对特异性引物：
DHBV-C上游：
5'-CAGGGAGGCAGAAAAACAT-3';
DHBV-C下游：
5'-TTCCTAGGCGAGGGAGATC-3'，扩增片段大小为197bp。
1.3.2 PCR扩增 常规方法提取WS毒株的DNA模板，利用设计的引物进行扩增。
1.3.3 PCR方法的特异性和敏感性 常规方法提取DHBV、DHAV-1、DHAV-3、DPV、鸭源E. coli、鸭源NDV、鸭源AIV-H9和RA等病原的模板，用建立的PCR方法检测检验该PCR方法的特异性。将DHBV参考毒株WS株提取DNA，测定其浓度，并作10倍梯度稀释，进行PCR扩增，检测该PCR方法的敏感性。
1.4 鸭乙型肝炎病毒的流行病学调查 收集不同时期不同地区的樱桃谷鸭血清，用建立的PCR方法进行检测，分析鸭乙型肝炎病毒的自然感染情况。同时对不同时间、不同地方、不同品种和不同日龄的鸭血清进行检测，分析鸭乙型肝炎病毒的感染情况。选取适量的鸡、鸽和鹅血清，检测鸭乙型肝炎病毒的感染情况。
2 结果与分析
2.1 PCR方法的特异性和敏感性 用建立的PCR方法只能特异性检出DHBV（扩增片段大小为197bp），而不能检出DHAV-1、DHAV-3、DPV、鸭源E.coli、鸭源NDV、鸭源AIV-H9和RA等其它病原，见图1。DHBV WS株DNA（1460ng）作10-4稀释后仍能扩出目的条带，表明该方法最低检出量为146pg，见图2。
2.2 鸭乙型肝炎病毒的流行病学调查 用建立的PCR方法对2015～2018年不同地区的75份樱桃谷鸭血清进行检测，结果鸭乙型肝炎阳性率高达25.33%，但不同时期不同地区鸭乙型肝炎的感染没有规律性，相同年份不同地区的感染程度差异也较大，有些为0感染，有些为100%感染。这可能与采集样品数量偏少有关。2019年采集了不同地区的樱桃谷鸭、麻鸭和种鸭血清，检测结果发现樱桃谷鸭和麻鸭中鸭乙型肝炎的感染率均较高。而种鸭的感染率较低，日龄大的种鸭群感染率略高于日龄小的种鸭群。鸡、鸽的检出率均为0%，而部分鹅场的检出率可高达20%。结果详见表1、表2、表3。
3 讨论
鸭乙型肝炎对鸭群的危害往往呈隐性感染，自然感染鸭不表现明显的临床症状，该病的病原分离也比较困难，因此，迫切需要建立快速的检测方法进行确诊。本研究根据DHBV的C基因设计一对特异性引物，建立的PCR方法特异性好，敏感性高，最低模板检出量为146pg。与已有报道相符合[4]。
鸭乙型肝炎感染雏鸭试验是目前评价抗HBV药物理想的动物模型，试验之前需对鸭群的健康背景作全面了解。因此本试验利用建立的PCR方法对2015～2018年不同地区采集的样品进行检测，结果发现不同鸭群中乙型肝炎的感染率差异较大，没有明显的时空分布规律。其它家禽品种如鸡、鸽中未检测到鸭乙型肝炎病毒的感染，而鹅可以感染鸭乙型肝炎病毒，应引起养殖户的重视。
为进一步探讨鸭乙型肝炎自然感染率与品种和日龄的关系，本研究对2019年不同日龄和品种的鸭进行采样检测，结果发现肉鸭和麻鸭的自然感染率均较高，有些甚至达到100%，但不同日龄之间无明显规律。种鸭的自然感染率较低，这可能与种鸭场生物安全制度落实到位有关。但随着日龄的增大，种鸭感染率略有升高。
综合上述检测结果，目前鸭乙型肝炎的自然感染已很普遍[5]，所以在选择鸭群作为动物感染模型时，优先选用SPF鸭，但因國内SPF鸭数量有限，所以动物感染试验前应对鸭群进行逐一排查，才能保证试验的准确性。本研究建立的PCR方法可为鸭乙型肝炎的普查和人乙型肝炎药物的评价提供技术支持。 參考文献：
[1] 周翊钟，寇平原，邵龙琪.一种可能与鸭肝炎和肝癌相关的病毒[J].上海医学，1980，3（11）：1-3。
[2] ZUCKERMAN A J.Screening of antibiral drugs for hepadna virus infection in Peking ducks：a review[J].J Virol Methods，1987，17（1）：119-126.
[3] W.S. Mason， G. Seal， J. Summers， Virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human hepatitis B virus[J]. J Virol，1980（36）：829-836.
[4] 高骏，孙凤萍，魏晓峰，等，鸭乙型肝炎病毒PCR诊断方法的建立及应用[J].上海农业学报，2013，29（6）：4-6。
[5] 杨晓雪，王玉，王敬谕，等，鸭乙型肝炎病毒的流行病学调查与全基因组序列分析[J].中国兽医学报，2018，38（10）：1878-1882。
Abstract：Polymerase chain reaction （PCR） with good specificity and high sensitivity was developed to quantification of DHBV DNA.146pg DNA of DHBV were detected by the method. There were different infection rate and no obviously spatial and temporal distribution of the sera from different areas in 2015～2018.The results showed that the infection rate of cherry valley ducks and shelducks was higher，but no changing regulation with variant age.While the infection rate of breeding duck is the lowest and there was a growing trend with age increasing in breeding ducks.Duck hepatitis B virus was existed in some goose.
Key words：duck hepatitis B virus;epidemiology
关键词：鸭乙型肝炎病毒;流行病学
中图分类号：S858.321：31+3 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2020）4-0048-04
乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的一个主要公共卫生问题。由于HBV宿主范围狭窄，有明显嗜肝性和种属特异性，建立较理想的HBV感染细胞及动物模型都很困难，成为限制抗HBV药物开发和评价的主要障碍[1]。鸭乙型肝炎病毒（DHBV）与HBV同属嗜肝DNA病毒科，两者在形态结构、核酸组成、生物学特性、发病机理和相对嗜肝性等方面有众多相似之处，而鸭对DHBV易感，且价格低廉，易于饲养，因此鸭乙型肝炎模型被用作抗HBV药物筛选及HBV致病机理研究的理想动物模型[2-3]。因此，需要建立相应的快速检测方法对模型动物中DHBV感染情况进行分析，为今后开展有效的药物评价奠定良好基础。
1 材料与方法
1.1 DHBV参考毒株（WS株） 郑州大学惠赠。
1.2 临床样品 由山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室采集保存。
1.3 鸭乙型肝炎病毒PCR检测方法的建立
1.3.1 引物设计合成 根据Genbank中登录的DHBV的C基因参考序列设计合成一对特异性引物：
DHBV-C上游：
5'-CAGGGAGGCAGAAAAACAT-3';
DHBV-C下游：
5'-TTCCTAGGCGAGGGAGATC-3'，扩增片段大小为197bp。
1.3.2 PCR扩增 常规方法提取WS毒株的DNA模板，利用设计的引物进行扩增。
1.3.3 PCR方法的特异性和敏感性 常规方法提取DHBV、DHAV-1、DHAV-3、DPV、鸭源E. coli、鸭源NDV、鸭源AIV-H9和RA等病原的模板，用建立的PCR方法检测检验该PCR方法的特异性。将DHBV参考毒株WS株提取DNA，测定其浓度，并作10倍梯度稀释，进行PCR扩增，检测该PCR方法的敏感性。
1.4 鸭乙型肝炎病毒的流行病学调查 收集不同时期不同地区的樱桃谷鸭血清，用建立的PCR方法进行检测，分析鸭乙型肝炎病毒的自然感染情况。同时对不同时间、不同地方、不同品种和不同日龄的鸭血清进行检测，分析鸭乙型肝炎病毒的感染情况。选取适量的鸡、鸽和鹅血清，检测鸭乙型肝炎病毒的感染情况。
2 结果与分析
2.1 PCR方法的特异性和敏感性 用建立的PCR方法只能特异性检出DHBV（扩增片段大小为197bp），而不能检出DHAV-1、DHAV-3、DPV、鸭源E.coli、鸭源NDV、鸭源AIV-H9和RA等其它病原，见图1。DHBV WS株DNA（1460ng）作10-4稀释后仍能扩出目的条带，表明该方法最低检出量为146pg，见图2。
2.2 鸭乙型肝炎病毒的流行病学调查 用建立的PCR方法对2015～2018年不同地区的75份樱桃谷鸭血清进行检测，结果鸭乙型肝炎阳性率高达25.33%，但不同时期不同地区鸭乙型肝炎的感染没有规律性，相同年份不同地区的感染程度差异也较大，有些为0感染，有些为100%感染。这可能与采集样品数量偏少有关。2019年采集了不同地区的樱桃谷鸭、麻鸭和种鸭血清，检测结果发现樱桃谷鸭和麻鸭中鸭乙型肝炎的感染率均较高。而种鸭的感染率较低，日龄大的种鸭群感染率略高于日龄小的种鸭群。鸡、鸽的检出率均为0%，而部分鹅场的检出率可高达20%。结果详见表1、表2、表3。
3 讨论
鸭乙型肝炎对鸭群的危害往往呈隐性感染，自然感染鸭不表现明显的临床症状，该病的病原分离也比较困难，因此，迫切需要建立快速的检测方法进行确诊。本研究根据DHBV的C基因设计一对特异性引物，建立的PCR方法特异性好，敏感性高，最低模板检出量为146pg。与已有报道相符合[4]。
鸭乙型肝炎感染雏鸭试验是目前评价抗HBV药物理想的动物模型，试验之前需对鸭群的健康背景作全面了解。因此本试验利用建立的PCR方法对2015～2018年不同地区采集的样品进行检测，结果发现不同鸭群中乙型肝炎的感染率差异较大，没有明显的时空分布规律。其它家禽品种如鸡、鸽中未检测到鸭乙型肝炎病毒的感染，而鹅可以感染鸭乙型肝炎病毒，应引起养殖户的重视。
为进一步探讨鸭乙型肝炎自然感染率与品种和日龄的关系，本研究对2019年不同日龄和品种的鸭进行采样检测，结果发现肉鸭和麻鸭的自然感染率均较高，有些甚至达到100%，但不同日龄之间无明显规律。种鸭的自然感染率较低，这可能与种鸭场生物安全制度落实到位有关。但随着日龄的增大，种鸭感染率略有升高。
综合上述检测结果，目前鸭乙型肝炎的自然感染已很普遍[5]，所以在选择鸭群作为动物感染模型时，优先选用SPF鸭，但因國内SPF鸭数量有限，所以动物感染试验前应对鸭群进行逐一排查，才能保证试验的准确性。本研究建立的PCR方法可为鸭乙型肝炎的普查和人乙型肝炎药物的评价提供技术支持。 參考文献：
[1] 周翊钟，寇平原，邵龙琪.一种可能与鸭肝炎和肝癌相关的病毒[J].上海医学，1980，3（11）：1-3。
[2] ZUCKERMAN A J.Screening of antibiral drugs for hepadna virus infection in Peking ducks：a review[J].J Virol Methods，1987，17（1）：119-126.
[3] W.S. Mason， G. Seal， J. Summers， Virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human hepatitis B virus[J]. J Virol，1980（36）：829-836.
[4] 高骏，孙凤萍，魏晓峰，等，鸭乙型肝炎病毒PCR诊断方法的建立及应用[J].上海农业学报，2013，29（6）：4-6。
[5] 杨晓雪，王玉，王敬谕，等，鸭乙型肝炎病毒的流行病学调查与全基因组序列分析[J].中国兽医学报，2018，38（10）：1878-1882。
Abstract：Polymerase chain reaction （PCR） with good specificity and high sensitivity was developed to quantification of DHBV DNA.146pg DNA of DHBV were detected by the method. There were different infection rate and no obviously spatial and temporal distribution of the sera from different areas in 2015～2018.The results showed that the infection rate of cherry valley ducks and shelducks was higher，but no changing regulation with variant age.While the infection rate of breeding duck is the lowest and there was a growing trend with age increasing in breeding ducks.Duck hepatitis B virus was existed in some goose.
Key words：duck hepatitis B virus;epidemiology