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摘要：目的 观察香青兰总黄酮对支气管哮喘大鼠肺功能及肺组织Ⅲ型胶原的影响。方法 SD大鼠60只随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组和香青兰总黄酮低、中、高剂量组。除正常对照组外，其余各组采用卵白蛋白（OVA）致敏和激发建立大鼠哮喘模型。模型建立后，正常对照组和模型组给予双蒸水灌胃，各给药组分别给予香青兰总黄酮和地塞米松灌胃，1次/d，连续30 d。末次给药后，采用美国Buxco公司的整体体积描记系统，检测香青兰总黄酮对支气管哮喘大鼠呼吸频率（F）、每分钟通气量（MVb）、吸气流量峰值（PIFb）及呼气流量峰值（PEFb）及增强的呼吸间歇（Penh）的影响，ELISA法检测肺组织Ⅲ型胶原含量变化。结果 香青兰总黄酮180、360 mg/kg可降低支气管哮喘大鼠F和Penh（P<0.05，P<0.01），升高MVb、PIFb和PEFb（P<0.05），降低肺组织Ⅲ型胶原含量（P<0.05，P<0.01）。结论 香青兰总黄酮可改善支气管哮喘大鼠肺功能，降低气道反应性，改善哮喘气道重塑。
关键词：香青兰总黄酮；支气管哮喘；气道高反应性；Ⅲ型胶原；肺功能；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.009
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0024-02
支气管哮喘（以下简称“哮喘”）是一种反复发作的慢性气道炎症性疾病，具有可逆性支气管收缩、气道反应性增高、嗜酸性粒细胞募集和黏液高分泌等特征[1]。据《维吾尔药志（上）》[2]记载，唇形科植物香青兰（Dracocephalum moldavica L.）具有镇咳、袪痰、平喘作用。本课题组从香青兰中提取的
有效部位香青兰总黄酮，采用Buxco大、小鼠肺功能检测仪观察香青兰总黄酮对哮喘大鼠肺功能、气道反应性的影响，以期为香青兰总黄酮的新药开发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 药物
香青兰药材购自安徽省亳州市德昌药业有限公司，经新疆维吾尔自治区药物研究所何江研究员鉴定为正品。经40%乙醇回流提取1次，3 h，提取液用HPD100型大孔吸附树脂纯化，70%乙醇洗脱，浓缩干燥，得香青兰总黄酮，经UV测定，总黄酮含量为60%以上。临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶解，配制成所需浓度。醋酸地塞米松片，浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号110356。
1.2 动物
清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量180～220 g，新疆实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK（新）2003-0002。
1.3 试剂与仪器
卵白蛋白（OVA），Sigma公司，批号1001115808；氢氧化铝，西安化学试剂厂，批号20100912；磷酸组胺，上海三杰生物技术有限公司，批号20110901；氯化乙酰胆碱，上海三爱思试剂有限公司，批号20120222；大鼠Ⅲ型胶原（Col Ⅲ）ELISA试剂盒，上海将来试剂公司，批号201204；二辛可宁酸蛋白定量试剂盒，江苏碧云天生物技术研究所，批号20120415。超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备公司；Buxco大、小鼠肺功能检测仪，美国Buxco公司；酶标仪，美国BIO-RAD公司。
2 实验方法
2.1 分组与造模
SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组及香青兰总黄酮小、中、大剂量组，每组10只。采用OVA致敏法制备动物模型。除正常对照组外，其他5组动物第1、2、3日用含OVA 10 mg、Al（OH）3干粉100 mg的生理盐水混悬液l mL腹腔注射致敏，第8日重复致敏1次，第15日开始超声雾化1%OVA进行激发，约30 min/次，于每日早上8-9时进行。直至大鼠出现哮喘样发作，共4周。雾化时见大鼠出现烦躁不安、打喷嚏、大小便失禁、抓耳朵、紫绀等症状，说明哮喘模型复制成功。第5周起各给药组分别灌胃给予香青兰总黄酮90、180、360 mg/kg，地塞米松1 mg/kg，正常对照组及模型组灌胃给予生理盐水，每日1次，共30 d。
2.2 大鼠肺功能测定
末次给药后1 h，使用美国 Buxco公司的整体体积描记系统测定肺功能，参考文献[1，3]方法。大鼠放入流量型整体体积描记箱，每个箱内放置1只大鼠，每轮测量4只大鼠，将大鼠直接放进一个密闭的腔内，大鼠能自由活动，无须麻醉，呼吸接近自然，观察并让动物在腔内适应5～10 min。首先用0.4%磷酸组胺-2%氯化乙酰胆碱（1∶2）进行激发，激发剂经雾化系统进入每个放置大鼠的整体体积描记箱，每个整体体积描记箱内雾化50 ?L，雾化器的雾化时间为1 min。传感器记录小鼠呼吸时引起的体描箱内压力变化，由放大器处理后，信号传输给系统，由计算机计算出大鼠的呼吸频率（F）、每分种通气量（MVb）、吸气流量峰值（PIFb）、呼气流量峰值（PEFb）及增强的呼吸间歇（Penh）。
2.3 大鼠肺组织中Ⅲ型胶原含量测定
末次给药后1 h，用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，处死后，取右肺，称重，加入一定量的生理盐水，用组织匀浆机充分研碎，制成10%组织匀浆。制备好的匀浆放入离心机中以3500 r/min离心10 min，提取上清液分装，首先用二辛可宁酸蛋白定量试剂盒测定肺组织匀浆中蛋白浓度，ELISA试剂盒检测匀浆液中Col Ⅲ含量，操作按试剂盒说明书进行，测定结果以每毫升匀浆液中蛋白含量（pg/mg）进行校正。
3 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件进行分析。数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果（见表1～表3） 5 讨论
目前比较成熟的实验动物肺功能检查方法为体内有创检查法和体内无创检查法，无创气道反应性测量以增强的呼吸间歇（Penh）为代表，1997年Hamelmann等[3]
建立了整体体积描记法（WBP），并通过一个定量指标——Penh来反映气道的反应性。WBP是一种测定肺力学相关指标的无创检查方法，不能直接测定气道阻力（sRaw）。根据呼吸道发生堵塞或缩窄时，鼻部气流落后于胸部气流的相位差增加，这种相位差使WBP波形在吸气与呼气的过渡区域发生显著变化，通过量化支气管收缩程度的指标Penh来定量反映气流受限程度。Bergren等[4]比较了Penh和sRaw 在豚鼠的支气管反应性中的变化，结果也显示二者具有良好的相关性，认为两者都适合评价实验动物的气道反应性。由于WBP具有明显的优点，如检测时，动物被放进一个密闭的腔内，能自由的活动、饮水，动物的活动和饮食均可不受限制、更易操作；操作者的熟练程度对实验的影响相对较小、不存在漏气和动物挣扎的影响等，故该方法得到广泛应用。因此，本实验以Penh来定量反映哮喘大鼠的气道反应性。结果表明，香青兰总黄酮中、大剂量组可降低哮喘大鼠F，升高MVb、PIFb和PEFb，显著降低大鼠Penh，提示香青兰总黄酮通过改善哮喘大鼠肺功能，降低气道反应性，从而起到改善哮喘气道高反应性的作用。
气道重塑是哮喘反复发作的重要病理生理基础，在轻度哮喘或哮喘的早期即可出现，它与哮喘肺功能损害及气道高反应性密切相关，表现为基底膜增厚、上皮纤维化、平滑肌增生、胶原蛋白沉积等[5]。近年来研究表明，Ⅲ型胶原是肺内细胞外基质中胶原的主要成分，在哮喘气道重塑过程中，Ⅲ型胶原的生成为细胞外基质沉积的主要病理基础，Ⅲ型胶原可致黏膜下层显著增生[6]。因此，气道壁Ⅲ型胶原的增多可作为气道重塑的标志。本研究显示，香青兰总黄酮中、大剂量组可通过降低肺组织Ⅲ型胶原含量，减缓哮喘大鼠的气道重塑过程，达到治疗哮喘的目的。
参考文献：
[1] 丁礼仁，王凯，徐卫华，等.无创及有创方法在哮喘小鼠气道反应性检测中的应用[J].中国病理生理杂志，2009，25（7）：1451-1453.
[2] 刘勇民.维吾尔药志（上）[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：405-407.
[3] Hamelmann E， Schwarze J， Takeda K， et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography[J]. Am J Respir Crit Care Med，1997， 156（3Pt1）：766-775.
[4] Bergren DR. Chronic tobacco smoke exposure increases airway sensitivity to capsaicin in awake guinea pigs[J]. J Appl Physiology，2001，90：695-704.
[5] 王静连，张宏，张旭亚，等.平喘汤对哮喘大鼠气道转化生长因子-β1 mRNA和Ⅲ型胶原表达的影响[J].中国妇幼保健杂志，2010，25（16）：2283-2285.
[6] 杨牧祥，于文涛，徐华洲，等.咳喘宁对支气管哮喘大鼠气道重塑及肺组织Ⅲ型胶原含量的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2008，15（2）：89-91.
（收稿日期：2013-03-27，编辑：华强）
关键词：香青兰总黄酮；支气管哮喘；气道高反应性；Ⅲ型胶原；肺功能；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.009
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0024-02
支气管哮喘（以下简称“哮喘”）是一种反复发作的慢性气道炎症性疾病，具有可逆性支气管收缩、气道反应性增高、嗜酸性粒细胞募集和黏液高分泌等特征[1]。据《维吾尔药志（上）》[2]记载，唇形科植物香青兰（Dracocephalum moldavica L.）具有镇咳、袪痰、平喘作用。本课题组从香青兰中提取的
有效部位香青兰总黄酮，采用Buxco大、小鼠肺功能检测仪观察香青兰总黄酮对哮喘大鼠肺功能、气道反应性的影响，以期为香青兰总黄酮的新药开发提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 药物
香青兰药材购自安徽省亳州市德昌药业有限公司，经新疆维吾尔自治区药物研究所何江研究员鉴定为正品。经40%乙醇回流提取1次，3 h，提取液用HPD100型大孔吸附树脂纯化，70%乙醇洗脱，浓缩干燥，得香青兰总黄酮，经UV测定，总黄酮含量为60%以上。临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶解，配制成所需浓度。醋酸地塞米松片，浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号110356。
1.2 动物
清洁级SD大鼠60只，雌雄各半，体质量180～220 g，新疆实验动物研究中心提供，合格证号：SCXK（新）2003-0002。
1.3 试剂与仪器
卵白蛋白（OVA），Sigma公司，批号1001115808；氢氧化铝，西安化学试剂厂，批号20100912；磷酸组胺，上海三杰生物技术有限公司，批号20110901；氯化乙酰胆碱，上海三爱思试剂有限公司，批号20120222；大鼠Ⅲ型胶原（Col Ⅲ）ELISA试剂盒，上海将来试剂公司，批号201204；二辛可宁酸蛋白定量试剂盒，江苏碧云天生物技术研究所，批号20120415。超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备公司；Buxco大、小鼠肺功能检测仪，美国Buxco公司；酶标仪，美国BIO-RAD公司。
2 实验方法
2.1 分组与造模
SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组及香青兰总黄酮小、中、大剂量组，每组10只。采用OVA致敏法制备动物模型。除正常对照组外，其他5组动物第1、2、3日用含OVA 10 mg、Al（OH）3干粉100 mg的生理盐水混悬液l mL腹腔注射致敏，第8日重复致敏1次，第15日开始超声雾化1%OVA进行激发，约30 min/次，于每日早上8-9时进行。直至大鼠出现哮喘样发作，共4周。雾化时见大鼠出现烦躁不安、打喷嚏、大小便失禁、抓耳朵、紫绀等症状，说明哮喘模型复制成功。第5周起各给药组分别灌胃给予香青兰总黄酮90、180、360 mg/kg，地塞米松1 mg/kg，正常对照组及模型组灌胃给予生理盐水，每日1次，共30 d。
2.2 大鼠肺功能测定
末次给药后1 h，使用美国 Buxco公司的整体体积描记系统测定肺功能，参考文献[1，3]方法。大鼠放入流量型整体体积描记箱，每个箱内放置1只大鼠，每轮测量4只大鼠，将大鼠直接放进一个密闭的腔内，大鼠能自由活动，无须麻醉，呼吸接近自然，观察并让动物在腔内适应5～10 min。首先用0.4%磷酸组胺-2%氯化乙酰胆碱（1∶2）进行激发，激发剂经雾化系统进入每个放置大鼠的整体体积描记箱，每个整体体积描记箱内雾化50 ?L，雾化器的雾化时间为1 min。传感器记录小鼠呼吸时引起的体描箱内压力变化，由放大器处理后，信号传输给系统，由计算机计算出大鼠的呼吸频率（F）、每分种通气量（MVb）、吸气流量峰值（PIFb）、呼气流量峰值（PEFb）及增强的呼吸间歇（Penh）。
2.3 大鼠肺组织中Ⅲ型胶原含量测定
末次给药后1 h，用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，处死后，取右肺，称重，加入一定量的生理盐水，用组织匀浆机充分研碎，制成10%组织匀浆。制备好的匀浆放入离心机中以3500 r/min离心10 min，提取上清液分装，首先用二辛可宁酸蛋白定量试剂盒测定肺组织匀浆中蛋白浓度，ELISA试剂盒检测匀浆液中Col Ⅲ含量，操作按试剂盒说明书进行，测定结果以每毫升匀浆液中蛋白含量（pg/mg）进行校正。
3 统计学方法
采用SPSS11.0统计软件进行分析。数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果（见表1～表3） 5 讨论
目前比较成熟的实验动物肺功能检查方法为体内有创检查法和体内无创检查法，无创气道反应性测量以增强的呼吸间歇（Penh）为代表，1997年Hamelmann等[3]
建立了整体体积描记法（WBP），并通过一个定量指标——Penh来反映气道的反应性。WBP是一种测定肺力学相关指标的无创检查方法，不能直接测定气道阻力（sRaw）。根据呼吸道发生堵塞或缩窄时，鼻部气流落后于胸部气流的相位差增加，这种相位差使WBP波形在吸气与呼气的过渡区域发生显著变化，通过量化支气管收缩程度的指标Penh来定量反映气流受限程度。Bergren等[4]比较了Penh和sRaw 在豚鼠的支气管反应性中的变化，结果也显示二者具有良好的相关性，认为两者都适合评价实验动物的气道反应性。由于WBP具有明显的优点，如检测时，动物被放进一个密闭的腔内，能自由的活动、饮水，动物的活动和饮食均可不受限制、更易操作；操作者的熟练程度对实验的影响相对较小、不存在漏气和动物挣扎的影响等，故该方法得到广泛应用。因此，本实验以Penh来定量反映哮喘大鼠的气道反应性。结果表明，香青兰总黄酮中、大剂量组可降低哮喘大鼠F，升高MVb、PIFb和PEFb，显著降低大鼠Penh，提示香青兰总黄酮通过改善哮喘大鼠肺功能，降低气道反应性，从而起到改善哮喘气道高反应性的作用。
气道重塑是哮喘反复发作的重要病理生理基础，在轻度哮喘或哮喘的早期即可出现，它与哮喘肺功能损害及气道高反应性密切相关，表现为基底膜增厚、上皮纤维化、平滑肌增生、胶原蛋白沉积等[5]。近年来研究表明，Ⅲ型胶原是肺内细胞外基质中胶原的主要成分，在哮喘气道重塑过程中，Ⅲ型胶原的生成为细胞外基质沉积的主要病理基础，Ⅲ型胶原可致黏膜下层显著增生[6]。因此，气道壁Ⅲ型胶原的增多可作为气道重塑的标志。本研究显示，香青兰总黄酮中、大剂量组可通过降低肺组织Ⅲ型胶原含量，减缓哮喘大鼠的气道重塑过程，达到治疗哮喘的目的。
参考文献：
[1] 丁礼仁，王凯，徐卫华，等.无创及有创方法在哮喘小鼠气道反应性检测中的应用[J].中国病理生理杂志，2009，25（7）：1451-1453.
[2] 刘勇民.维吾尔药志（上）[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：405-407.
[3] Hamelmann E， Schwarze J， Takeda K， et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography[J]. Am J Respir Crit Care Med，1997， 156（3Pt1）：766-775.
[4] Bergren DR. Chronic tobacco smoke exposure increases airway sensitivity to capsaicin in awake guinea pigs[J]. J Appl Physiology，2001，90：695-704.
[5] 王静连，张宏，张旭亚，等.平喘汤对哮喘大鼠气道转化生长因子-β1 mRNA和Ⅲ型胶原表达的影响[J].中国妇幼保健杂志，2010，25（16）：2283-2285.
[6] 杨牧祥，于文涛，徐华洲，等.咳喘宁对支气管哮喘大鼠气道重塑及肺组织Ⅲ型胶原含量的影响[J].中国中西医结合急救杂志，2008，15（2）：89-91.
（收稿日期：2013-03-27，编辑：华强）