论文部分内容阅读
摘 要：目的：分析研究并改进乳中地塞米松残留量的测定方法，以期缩短检测时间，保障过程安全。方法：针对GB/T 22978—2008和农业部1031号公告-2-2008中的方法前处理中的复杂的问题，优化检验方法，提高检验结果准确性。结果：改进的方法标准曲线线性良好，精密度与回收率均符合要求，检测结果与国标方法比较无显著统计学差异。结论：该试验改进的方法准确性更高，解决实验室资源配置问题。
关键词：乳;地塞米松;检测方法
地塞米松是一种人工合成的肾上腺皮质激素，具有抗病毒、消炎、促进泌乳等多种功效，在养殖业中被频繁使用，造成动物乳源不同程度的药物残留，人体摄入过量可能会引起激素代谢紊乱、肥胖、骨质疏松等病症，并可能产生致畸、致癌等风险[1-2]。
地塞米松残留量项目为国家监管机构重点抽检指标，根据我国《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）、中华人民共和国农业部公告第235号的规定，地塞米松在牛奶中的最大残留限量为0.3 μg/kg[3-4]。目前，地塞米松检测方法主要有胶体金免疫层析法[5]、酶联免疫法[6]、气相色谱法[7]、气相色谱-质谱法[8]和液相色谱-质谱法[9-11]等。其中液相色谱-质谱联用法具有灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点被广泛应用[12-14]。本文基于《牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB/T 22978—2008）和农业部1031号公告《动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱-串联质谱法》，通过简化色谱条件、优化样品前处理，更换离子源，建立一种快速有效的检测方法，提高检验结果精准性。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
XSE204电子天平;UPLC-TQD高效液相色谱-质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI-）;涡旋混合仪;旋转蒸发仪;高速冷冻离心机;氮吹仪;固相萃取装置。
1.1.2 试剂
色谱纯乙腈、甲醇、色谱纯甲酸;地塞米松标准物质（纯度>99%）。HLB固相萃取柱;鸡心瓶150 mL;一次性有机过滤器0.22 μm。
1.2 实验方法
1.2.1 标准曲线的制备
准确量取地塞米松标准溶液，用基质空白配制0.5 ng/mL、1 ng/mL、2.0ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL的标准工作液，绘制标准曲线，相关系数≥0.99。（现用现配）。
1.2.2 样品处理
称取5～10 g样品（精确到0.000 1 g）置于50 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋混匀3 min，以8 000 r/min离心10 min，取上清液至鸡心瓶中，用旋转蒸发仪（50±5）℃水浴上减压蒸发，将提取液浓缩至体积小于5 mL。
1.2.3 净化
将提取液移至经预处理的HLB固相萃取柱中，分别用两次10 mL一级水洗涤鸡心瓶，将洗涤液移至HLB固相萃取柱中，弃去全部流出液，抽干，用8 mL甲醇以≤3 mL/min流速洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，（50±5）℃水浴中氮气吹干，用1 mL的20%乙腈水溶解残渣，经过0.22 μm一次性有机过滤器过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定。
1.2.4 测定
（1）液相色谱仪参考条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18;柱温：35 ℃;进样量：10 μL;流速：0.3 mL/min。
（2）质谱参考条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：负离子扫描;定量离子对：437.0/361.0，定性离子对：437.0/391.5;正离子扫描：定量离子对：393.2/373.2，定性离子对：393.2/355.2;流动相：A相：乙腈，B相：0.1%甲酸水，流动相梯度洗脱条件和流速见表1。
1.2.5 结果计算：
X=（CxVx1000）/（mx1000）
式中：X-试样中地塞米松残留量，单位为μg/kg;C-从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为ng/mL;V-试样溶液定容体积，单位为mL;m-最终试样溶液所代表的的试样质量，单位为g。
2 结果与分析
2.1 改进研究试验结果
2.1.1 标准曲线
依据1.2.1制作标准曲线，得出标准曲线y=155.845x+4.171 81，相关系数为r2=0.997 456，符合相关系数≥0.99的要求。
2.1.2 方法檢出限
由表2可知，依据《食品卫生检验方法 理化部分总则》（GB/T 5009.1—2003）附录A中色谱法检出限为3倍仪器噪音/标准曲线回归方程中的斜率[15]，理论计算出该方法检出限为0.2 μg/kg，故添加0.2 μg/kg浓度的样品，该浓度加标样品能够检出，色谱峰型正常，回收率结果均在《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[16]中60%～120%，结果符合要求。
2.1.3 回收率
由表3可知，添加浓度为0.2 μg/kg、 0.3 μg/kg、 1.0 μg/kg共3个浓度点，每个点6次平行测试，回收率结果均在《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）中60%～120%范围内，结果符合要求。
2.1.4 精密度
由表4可知，添加定量检测限、限量值、5倍定量检测限3个浓度样品，连续检测6个平行样，相对标准偏差RSD%分别为：12.4%、7.3%、7.3%。依据《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）F.3中精密度的要求，即当被测组分含量在0.1 μg/kg时，实验室内变异系数≤43%，当被测组分含量在1 μg/kg时，实验室内变异系数≤30%，符合方法要求。 2.2 改进后方法对比
使用改进方法与国标方法分别检测定量检测限、限量值、5倍定量检测限3个浓度样品平行试验，回收率结果对比，改进方法优于国标方法，具体见表5。
3 结论与讨论
本研究是应用高效液相色谱串联质谱法建立一种快速有效检测乳中地塞米松的检测方法，与国家标准中的方法相比，本方法更改了液相色谱-串联四级杆质谱仪的离子源，优化了前处理过程，简化了操作步骤，重新设定了质谱参数，缩短了分析时间，本研究标准曲线线性良好，回收率70.0%～102.7%，精密度7.3%～12.4%，满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的标准要求，有效提高了检测结果的准确性，满足日常检测需求，解决了实验室资源配置问题，为保证乳的质量安全提供了技术保障，值得在实验室中推广。
参考文献
[1]汤丽华.液相色谱-串联质谱法测定牛奶中地塞米松残留量的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2018，9（13）：3258-3262.
[2]任宏彬，花锦，杨蒲晨，等.固相萃取-高效液相色谱-质谱联用检测牛奶中地塞米松残留[J].农产品质量与安全，2021（2）：45-48.
[3]中华人民共和国农业农村部，国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量：GB 31650—2019[S]北京：中国标准出版社，2019.
[4]中华人民共和国农业农村部.中华人民共和国农业农村部公告第235号[EB/OL].（2020-04-13）[2021-08-18].http：//www.moa.gov.cn/nybgb/2019/201912/202004/t20200413_6341433.htm.
[5]李小会，李海星，段亚军，等.免疫分析技术在乳及乳制品抗生素类兽药残留检测中的应用[J].食品安全质量检测学报，2018，9（4）：776-780.
[6]罗晓琴，郝士元，杨昌松，等.酶联免疫法检测鸡肉中的地塞米松残留[J].黑龙江畜牧兽医，2013（19）：77-78.
[7]陈丽萍，丁邦东，谭志刚，等.顶空气相色谱法测定醋酸地塞米松原料药中残留溶剂的含量[J].天津药学，2012，24（1）：12-14.
[8]CASALS G，MARCOS J，POZO O J，et al.Gas chromatography mass spectrometry profiling of steroids in urine of patients with acute intermittent porphyria[J].Clinical Biochemistry，2013，46（9）：819-824.
[9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定：GB/T 22978—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[10]中华人民共和国农业部.动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱-串联质谱法：农业部1031号公告-2-2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.畜肉中地塞米松残留量的测定：GB/T 20741—2006[S].北京：中国标准出版社，
[12]田海偉，冯浩彬，李晋，等.QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定牛奶中18种糖皮质激素类药物残留[J].食品科学，2017，38（12）：310-314.
[13]李首道，涂凤琴，陈烨超，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中地塞米松[J].食品研究与开发，2019，40（20）：185-189.
[14]陈少莉.吴学贵.王一晨.等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定动物源性食品中的地塞米松残留量[J].食品安全质量检测学报，2019，10（21）：7395-7400.
[15]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.食品卫生检验方法 理化部分 总则：GB/T 5009.1—2003[S].北京：中国标准出版社，2003.
[16]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
关键词：乳;地塞米松;检测方法
地塞米松是一种人工合成的肾上腺皮质激素，具有抗病毒、消炎、促进泌乳等多种功效，在养殖业中被频繁使用，造成动物乳源不同程度的药物残留，人体摄入过量可能会引起激素代谢紊乱、肥胖、骨质疏松等病症，并可能产生致畸、致癌等风险[1-2]。
地塞米松残留量项目为国家监管机构重点抽检指标，根据我国《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）、中华人民共和国农业部公告第235号的规定，地塞米松在牛奶中的最大残留限量为0.3 μg/kg[3-4]。目前，地塞米松检测方法主要有胶体金免疫层析法[5]、酶联免疫法[6]、气相色谱法[7]、气相色谱-质谱法[8]和液相色谱-质谱法[9-11]等。其中液相色谱-质谱联用法具有灵敏度高、特异性强、分析速度快等优点被广泛应用[12-14]。本文基于《牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB/T 22978—2008）和农业部1031号公告《动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱-串联质谱法》，通过简化色谱条件、优化样品前处理，更换离子源，建立一种快速有效的检测方法，提高检验结果精准性。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
XSE204电子天平;UPLC-TQD高效液相色谱-质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI-）;涡旋混合仪;旋转蒸发仪;高速冷冻离心机;氮吹仪;固相萃取装置。
1.1.2 试剂
色谱纯乙腈、甲醇、色谱纯甲酸;地塞米松标准物质（纯度>99%）。HLB固相萃取柱;鸡心瓶150 mL;一次性有机过滤器0.22 μm。
1.2 实验方法
1.2.1 标准曲线的制备
准确量取地塞米松标准溶液，用基质空白配制0.5 ng/mL、1 ng/mL、2.0ng/mL、5.0 ng/mL和10.0 ng/mL的标准工作液，绘制标准曲线，相关系数≥0.99。（现用现配）。
1.2.2 样品处理
称取5～10 g样品（精确到0.000 1 g）置于50 mL塑料离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋混匀3 min，以8 000 r/min离心10 min，取上清液至鸡心瓶中，用旋转蒸发仪（50±5）℃水浴上减压蒸发，将提取液浓缩至体积小于5 mL。
1.2.3 净化
将提取液移至经预处理的HLB固相萃取柱中，分别用两次10 mL一级水洗涤鸡心瓶，将洗涤液移至HLB固相萃取柱中，弃去全部流出液，抽干，用8 mL甲醇以≤3 mL/min流速洗脱，收集洗脱液于玻璃试管中，（50±5）℃水浴中氮气吹干，用1 mL的20%乙腈水溶解残渣，经过0.22 μm一次性有机过滤器过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定。
1.2.4 测定
（1）液相色谱仪参考条件。色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18;柱温：35 ℃;进样量：10 μL;流速：0.3 mL/min。
（2）质谱参考条件。离子源：电喷雾离子源（ESI）;扫描方式：负离子扫描;定量离子对：437.0/361.0，定性离子对：437.0/391.5;正离子扫描：定量离子对：393.2/373.2，定性离子对：393.2/355.2;流动相：A相：乙腈，B相：0.1%甲酸水，流动相梯度洗脱条件和流速见表1。
1.2.5 结果计算：
X=（CxVx1000）/（mx1000）
式中：X-试样中地塞米松残留量，单位为μg/kg;C-从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为ng/mL;V-试样溶液定容体积，单位为mL;m-最终试样溶液所代表的的试样质量，单位为g。
2 结果与分析
2.1 改进研究试验结果
2.1.1 标准曲线
依据1.2.1制作标准曲线，得出标准曲线y=155.845x+4.171 81，相关系数为r2=0.997 456，符合相关系数≥0.99的要求。
2.1.2 方法檢出限
由表2可知，依据《食品卫生检验方法 理化部分总则》（GB/T 5009.1—2003）附录A中色谱法检出限为3倍仪器噪音/标准曲线回归方程中的斜率[15]，理论计算出该方法检出限为0.2 μg/kg，故添加0.2 μg/kg浓度的样品，该浓度加标样品能够检出，色谱峰型正常，回收率结果均在《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[16]中60%～120%，结果符合要求。
2.1.3 回收率
由表3可知，添加浓度为0.2 μg/kg、 0.3 μg/kg、 1.0 μg/kg共3个浓度点，每个点6次平行测试，回收率结果均在《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）中60%～120%范围内，结果符合要求。
2.1.4 精密度
由表4可知，添加定量检测限、限量值、5倍定量检测限3个浓度样品，连续检测6个平行样，相对标准偏差RSD%分别为：12.4%、7.3%、7.3%。依据《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）F.3中精密度的要求，即当被测组分含量在0.1 μg/kg时，实验室内变异系数≤43%，当被测组分含量在1 μg/kg时，实验室内变异系数≤30%，符合方法要求。 2.2 改进后方法对比
使用改进方法与国标方法分别检测定量检测限、限量值、5倍定量检测限3个浓度样品平行试验，回收率结果对比，改进方法优于国标方法，具体见表5。
3 结论与讨论
本研究是应用高效液相色谱串联质谱法建立一种快速有效检测乳中地塞米松的检测方法，与国家标准中的方法相比，本方法更改了液相色谱-串联四级杆质谱仪的离子源，优化了前处理过程，简化了操作步骤，重新设定了质谱参数，缩短了分析时间，本研究标准曲线线性良好，回收率70.0%～102.7%，精密度7.3%～12.4%，满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）的标准要求，有效提高了检测结果的准确性，满足日常检测需求，解决了实验室资源配置问题，为保证乳的质量安全提供了技术保障，值得在实验室中推广。
参考文献
[1]汤丽华.液相色谱-串联质谱法测定牛奶中地塞米松残留量的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2018，9（13）：3258-3262.
[2]任宏彬，花锦，杨蒲晨，等.固相萃取-高效液相色谱-质谱联用检测牛奶中地塞米松残留[J].农产品质量与安全，2021（2）：45-48.
[3]中华人民共和国农业农村部，国家卫生健康委员会，国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量：GB 31650—2019[S]北京：中国标准出版社，2019.
[4]中华人民共和国农业农村部.中华人民共和国农业农村部公告第235号[EB/OL].（2020-04-13）[2021-08-18].http：//www.moa.gov.cn/nybgb/2019/201912/202004/t20200413_6341433.htm.
[5]李小会，李海星，段亚军，等.免疫分析技术在乳及乳制品抗生素类兽药残留检测中的应用[J].食品安全质量检测学报，2018，9（4）：776-780.
[6]罗晓琴，郝士元，杨昌松，等.酶联免疫法检测鸡肉中的地塞米松残留[J].黑龙江畜牧兽医，2013（19）：77-78.
[7]陈丽萍，丁邦东，谭志刚，等.顶空气相色谱法测定醋酸地塞米松原料药中残留溶剂的含量[J].天津药学，2012，24（1）：12-14.
[8]CASALS G，MARCOS J，POZO O J，et al.Gas chromatography mass spectrometry profiling of steroids in urine of patients with acute intermittent porphyria[J].Clinical Biochemistry，2013，46（9）：819-824.
[9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定：GB/T 22978—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[10]中华人民共和国农业部.动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱-串联质谱法：农业部1031号公告-2-2008[S].北京：中国标准出版社，2008.
[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.畜肉中地塞米松残留量的测定：GB/T 20741—2006[S].北京：中国标准出版社，
[12]田海偉，冯浩彬，李晋，等.QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定牛奶中18种糖皮质激素类药物残留[J].食品科学，2017，38（12）：310-314.
[13]李首道，涂凤琴，陈烨超，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中地塞米松[J].食品研究与开发，2019，40（20）：185-189.
[14]陈少莉.吴学贵.王一晨.等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定动物源性食品中的地塞米松残留量[J].食品安全质量检测学报，2019，10（21）：7395-7400.
[15]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.食品卫生检验方法 理化部分 总则：GB/T 5009.1—2003[S].北京：中国标准出版社，2003.
[16]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.