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【摘 要】 目的：研究并完善藜芦的质量控制。方法：采用薄层色谱法鉴别藜芦;采用HPLC法同时测定藜芦中虎杖苷和白藜芦醇的含量，采用Thermo C18色谱柱（4.6mm× 250mm 5μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱流速1.0mL/min;检测波长306nm，柱温30℃。结果：薄层色谱斑点清晰分离度较好;虎杖苷和白藜芦醇分别在0.2004～2.004μg、0.4056～4.0563μg范围内呈现良好的线性关系，加样回收率分别为99.6%和100.1%，RSD分别为1.1%、1.0%。结论：该方法操作简单，准确度高，灵敏度高，重现性好，专属性强，可用于藜芦的质量控制。
【关键词】 藜芦;虎杖苷;白藜芦醇;薄层色谱;HPLC
Abstract：Objective To study and improve the quality of Veratrum.Methods TLC was used to identify Veratrum;The Polydatin and Resveratrol was eluted on Thermo C18（250mm×4.6mm，5μm） with mobile phase of acetonitrile（A）- water（B） for gradient elution at the column temperature of 30℃. The flow rate of 1.0mL/ min and the detection wavelength was 306nm.Results The TLC spots were clear and showed a good separation;Polydatin and Resveratrol showed good linear relationships in the ranges of 0.2004～2.004μg and 0.4056～4.0563μg respectively.The sample recovery rates were 99.6% and 100.1%，the RSDs were 1.1% and 1.0%.Conclusion The method is simple，accurate，high sensitivity，good reproducibility，high specificity，and can be used for quality control of Veratrum.
Keywords：Veratrum; Polydatin; Resveratrol; HPLC
藜芦在2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中系指藜芦Veratrum nigrum L.、黑紫藜芦Veratrum japonicum（Baker）Loes.f.、 蒙自藜芦Veratrum mengtzeanum Loes.f.及狭叶藜芦Veratrum stenophyllum Diels的干燥根或根茎。 秋季采挖，洗净，晒干，可催吐、祛痰、杀虫，用于中风痰涌、风痫癲疾、疥癣、恶疮[1]。本次实验研究的藜芦为藜芦Veratrum nigrum L.，由贵州省食品药品检验所李杨老师鉴定，藜芦中含有虎杖苷和白藜芦醇，虎杖苷具有较强的生物活性，对心肌细胞、血管平滑肌细胞、抗血小板聚集、改善微循环等有显著作用，此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用[2]。白藜芦醇具有抗癌、抗菌、抗炎、抗心血管疾病、抗衰老和抗神经退行性疾病等药理作用[3]，质量标准中有显微鉴别和理化鉴别，故增加TLC鉴别及虎杖苷和白藜芦醇的含量测定对完善藜芦的质量控制提供重要的科学依据。
1 仪器材料
1.1 仪器 ThermoFisher UItimate 3000高效液相色谱仪;梅特勒托勒多 MS202TS型电子天平（十万分之一）;梅特勒托勒多 XP26型电子天平（百万分之一）;KQ-500DB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）;millipore超纯水机。
1.2 材料 虎杖苷对照品（111575-200502）、白藜芦醇对照品（111535-201703）均来自中国食品药品检定研究院;藜芦（批号301）采自安顺市关岭县、藜芦（批号302）采自安顺市关岭县、藜芦（批号303）采自安顺市紫云县、对照药材由贵州省食品药品检验所李杨老师鉴定为藜芦Veratrum nigrum L.。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯，青岛海洋化工硅胶G薄层板。
2 方法与结果
[JP2]
2.1 藜芦的薄层色谱鉴别方法[4] 取本品粉末1g，加浓氨试液1.5mL使浸润，放置30min，加二氯甲烷30mL加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取藜芦对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5～l0μL，分别点于同一硅胶G薄层板上以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（5∶[KG-*3/5]3∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]1.5∶0.5∶[KG-*3/5]1）为展开剂，展开，取出，晾干，再喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。[JP]
2.2 藜芦的薄层色谱鉴别结果 经过薄层色谱对温度、湿度的方法学验证，图1表明此鉴别方法分离度良好，斑点清晰，信息全面，用于藜芦的薄层鉴别方法可行。
2.3 HPLC同时测定虎杖苷和白藜芦醇的方法[5-7]
2.3.1 波長选择 分别取虎杖苷、白藜芦醇对照品在200～400nm波长范围内进行紫外波长扫描，虎杖苷和白藜芦醇均在306nm处有较大吸收，又结合HPLC-DAD光谱图对比，确定306nm为最佳检测波长。光谱图如图2所示。 2.3.2 色谱条件 色谱柱Thermo C18（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1进行梯度洗脱。检测波长：306nm;流速：1.0mL/min;柱温：30℃;进样量：10μL。
2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取虎杖苷、白藜芦醇对照品，加甲醇制成每1mL各含虎杖苷10μg、白藜芦醇20μg的混合溶液，摇匀，即得。
2.3.4 供试品溶液的制备 取过三号筛的粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足失去重量，摇匀，0.45μm微孔滤过，即得（实验全程需避光操作）。
2.3.5 系统适应性试验 取对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，供试品色谱中呈现与虎杖苷对照品、白藜芦醇对照品保留时间相同的色谱峰。色谱图如图3所示。
2.3.6 线性关系实验 精密吸取虎杖苷对照品（0.2004mg/mL）和白藜芦醇对照品（0.4056mg/mL）各1mL、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL分别置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得虎杖苷浓度分别为20.04μg/mL、50.10μg/mL、100.2μg/mL、150.3μg/mL、200.4μg/mL;白藜芦醇浓度分别为40.56μg/mL、101.4μg/mL、202.8μg/mL、304.2μg/mL、405.6μg/mL的对照品溶液，分别吸取上述对照品溶液各10μL，按2.3.2色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，以对照品质量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制工作曲线，进行回归处理，虎杖苷回归方程为y=462.8668x+2159.6973（r=0.9998），白藜芦醇回归方程为y=525.4858x-302.5944（r=0.9999），结果表明虎杖苷在0.2004～2.004μg范围内呈现良好的线性关系，白藜芦醇在0.4056～4.0560μg范围内呈现良好的线性关系。
2.3.7 精密度实验 分别精密吸取对混合照品溶液10μL，在同一色谱条件下，连续进样6次，测定峰面积，虎杖苷对照品峰面积RSD%为1.0%，白藜芦醇对照品峰面积RSD%为0.9%，表明仪器精密度良好。
2.3.8 稳定性实验 精密称取一份样品，按2.3.4制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，分别于配制后0、3、6、18、24h，按2.3.2项下色谱条件进样测定，测定虎杖苷峰面积RSD%为1.7%，白藜芦醇峰面积RSD%为1.3%，结果表明供试品溶液中虎杖苷和白藜芦醇在24h内稳定。[JP]
2.3.9 重复性实验 精密称取同一批号样品6份，按2.3.4方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，按2.3.2项下色谱条件进样测定，虎杖苷平均含量为0.3701mg/g，RSD=0.5%，白藜芦醇平均含量0.8781mg/g，RSD=0.7%，表明该方法重复性良好。
2.3.10 回收率实验 精密称定已知含有量的样品（虎杖苷平均含量0.3701mg/g、白藜芦醇平均含量0.8781mg/g）6份，精密加入对照品虎杖苷0.240mg，白藜芦醇0.483mg，按2.3.4方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，按2.3.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果虎杖苷和白藜芦醇的平均回收率分别为99.6%和100.1%，RSD（n=6）分别为1.1%和0.95%，表明实验方法准确度较高，结果见表2。
2.3.11 耐用性试验 分别采用3支不同品牌的C18色谱柱waters xbridge（4.6mm×250mm，5μm）、迪马（4.6mm×250mm，5μm）、Thermo（4.6mm×250mm，5μm）在戴安U3000高效液相色谱仪上对同一批藜芦样品进行测定，精密吸取供试品溶液10μL，按2.3.2色谱条件进样测定，记录峰面积，结果虎杖苷和白藜芦醇的RSD%分别为2.2%、2.0%。
2.4 样品含量测定结果 取上述3批藜芦药材，按2.3.4项下方法制备供试品溶液并测定色谱峰面积，计算藜芦药材虎杖苷和白藜芦醇的含量，结果见表3。
3 讨论
根据参考文献，选择甲醇-水、乙腈-水流动相按表1梯度洗脱表进行洗脱，结果乙腈-水在表1梯度洗脱条件下可以使供试品目标化合物有效分离，再选择乙腈-1%磷酸溶液、乙腈-2%磷酸溶液、乙腈-4%磷酸溶液照表1梯度洗脱表进行比较，结果上述各系统均可以使供试品目标化合物有效分离，峰型也较理想，但因乙腈-水系统配制方便，成本低，毒性低，故最终选择乙腈-水为最佳流动相系统。
虎杖苷和白藜芦醇对光照不稳定，在进行虎杖苷和白藜芦醇含量测定操作时均要避光操作，如不避光操作，对照品色谱图中会出现杂峰，疑为对照品在光照条件下被降解转化为其他化合物，后续会对供试品中化合物的光照降解途径进行进一步研究。
用甲醇、乙醇超声提取1h，甲醇效果较好;再用25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇提取，结果用50%甲醇提取溶剂提取所测得的虎杖苷和白藜芦醇峰面积最高，含量较高，甲醇提取次之;但是在50%甲醇提取溶剂下反复进行准确度实验，虎杖苷的回收率满足要求，白藜芦醇的回收率仅为50%～60%，选用甲醇作为提取溶剂进行准确度实验，虎杖苷和白藜芦醇的回收率均能达到药品质量标准分析方法验证指导原则要求。
本实验对藜芦Veratrum nigrum L.的TLC鉴别及HPLC含量测定的研究，方法可靠稳定，简便易行，可较全面、可靠地控制藜芦的质量，为其质量标准的提升制定提供可靠依据。
参考文献
[1]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[S].贵阳：贵州科技出版社，2003：416.
[2]高守红，杨少麟，范国荣.虎杖苷的研究进展[J].药学实践杂志，2005，23（3）：145-147.
[3]孙治刚，李志娜，李敏.白藜芦醇研究进展[J].淮海工学院学报（自然科学版），2017，2（26）：40-43.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：208.
[5]从悦，王金辉，李铣.HPLC法测定藜芦中虎杖苷和白藜芦醇的含量[J].中药研究与信息，2005，7（7）：16-19.
[6]鄭可利，郑小林，李凤兰.正交法研究虎杖白藜芦醇提取工艺[J].三明学院学报，2008，2（2）：21-23.
[7]朱立贤，金征宇，陶冠军.HPLC测定虎杖中的白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量[J].中成药，2005，27（8）：944 -946.
【关键词】 藜芦;虎杖苷;白藜芦醇;薄层色谱;HPLC
Abstract：Objective To study and improve the quality of Veratrum.Methods TLC was used to identify Veratrum;The Polydatin and Resveratrol was eluted on Thermo C18（250mm×4.6mm，5μm） with mobile phase of acetonitrile（A）- water（B） for gradient elution at the column temperature of 30℃. The flow rate of 1.0mL/ min and the detection wavelength was 306nm.Results The TLC spots were clear and showed a good separation;Polydatin and Resveratrol showed good linear relationships in the ranges of 0.2004～2.004μg and 0.4056～4.0563μg respectively.The sample recovery rates were 99.6% and 100.1%，the RSDs were 1.1% and 1.0%.Conclusion The method is simple，accurate，high sensitivity，good reproducibility，high specificity，and can be used for quality control of Veratrum.
Keywords：Veratrum; Polydatin; Resveratrol; HPLC
藜芦在2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中系指藜芦Veratrum nigrum L.、黑紫藜芦Veratrum japonicum（Baker）Loes.f.、 蒙自藜芦Veratrum mengtzeanum Loes.f.及狭叶藜芦Veratrum stenophyllum Diels的干燥根或根茎。 秋季采挖，洗净，晒干，可催吐、祛痰、杀虫，用于中风痰涌、风痫癲疾、疥癣、恶疮[1]。本次实验研究的藜芦为藜芦Veratrum nigrum L.，由贵州省食品药品检验所李杨老师鉴定，藜芦中含有虎杖苷和白藜芦醇，虎杖苷具有较强的生物活性，对心肌细胞、血管平滑肌细胞、抗血小板聚集、改善微循环等有显著作用，此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用[2]。白藜芦醇具有抗癌、抗菌、抗炎、抗心血管疾病、抗衰老和抗神经退行性疾病等药理作用[3]，质量标准中有显微鉴别和理化鉴别，故增加TLC鉴别及虎杖苷和白藜芦醇的含量测定对完善藜芦的质量控制提供重要的科学依据。
1 仪器材料
1.1 仪器 ThermoFisher UItimate 3000高效液相色谱仪;梅特勒托勒多 MS202TS型电子天平（十万分之一）;梅特勒托勒多 XP26型电子天平（百万分之一）;KQ-500DB型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）;millipore超纯水机。
1.2 材料 虎杖苷对照品（111575-200502）、白藜芦醇对照品（111535-201703）均来自中国食品药品检定研究院;藜芦（批号301）采自安顺市关岭县、藜芦（批号302）采自安顺市关岭县、藜芦（批号303）采自安顺市紫云县、对照药材由贵州省食品药品检验所李杨老师鉴定为藜芦Veratrum nigrum L.。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯，青岛海洋化工硅胶G薄层板。
2 方法与结果
[JP2]
2.1 藜芦的薄层色谱鉴别方法[4] 取本品粉末1g，加浓氨试液1.5mL使浸润，放置30min，加二氯甲烷30mL加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取藜芦对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5～l0μL，分别点于同一硅胶G薄层板上以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（5∶[KG-*3/5]3∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]1.5∶0.5∶[KG-*3/5]1）为展开剂，展开，取出，晾干，再喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。[JP]
2.2 藜芦的薄层色谱鉴别结果 经过薄层色谱对温度、湿度的方法学验证，图1表明此鉴别方法分离度良好，斑点清晰，信息全面，用于藜芦的薄层鉴别方法可行。
2.3 HPLC同时测定虎杖苷和白藜芦醇的方法[5-7]
2.3.1 波長选择 分别取虎杖苷、白藜芦醇对照品在200～400nm波长范围内进行紫外波长扫描，虎杖苷和白藜芦醇均在306nm处有较大吸收，又结合HPLC-DAD光谱图对比，确定306nm为最佳检测波长。光谱图如图2所示。 2.3.2 色谱条件 色谱柱Thermo C18（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表1进行梯度洗脱。检测波长：306nm;流速：1.0mL/min;柱温：30℃;进样量：10μL。
2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取虎杖苷、白藜芦醇对照品，加甲醇制成每1mL各含虎杖苷10μg、白藜芦醇20μg的混合溶液，摇匀，即得。
2.3.4 供试品溶液的制备 取过三号筛的粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足失去重量，摇匀，0.45μm微孔滤过，即得（实验全程需避光操作）。
2.3.5 系统适应性试验 取对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，供试品色谱中呈现与虎杖苷对照品、白藜芦醇对照品保留时间相同的色谱峰。色谱图如图3所示。
2.3.6 线性关系实验 精密吸取虎杖苷对照品（0.2004mg/mL）和白藜芦醇对照品（0.4056mg/mL）各1mL、2.5mL、5mL、7.5mL、10mL分别置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制得虎杖苷浓度分别为20.04μg/mL、50.10μg/mL、100.2μg/mL、150.3μg/mL、200.4μg/mL;白藜芦醇浓度分别为40.56μg/mL、101.4μg/mL、202.8μg/mL、304.2μg/mL、405.6μg/mL的对照品溶液，分别吸取上述对照品溶液各10μL，按2.3.2色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，以对照品质量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制工作曲线，进行回归处理，虎杖苷回归方程为y=462.8668x+2159.6973（r=0.9998），白藜芦醇回归方程为y=525.4858x-302.5944（r=0.9999），结果表明虎杖苷在0.2004～2.004μg范围内呈现良好的线性关系，白藜芦醇在0.4056～4.0560μg范围内呈现良好的线性关系。
2.3.7 精密度实验 分别精密吸取对混合照品溶液10μL，在同一色谱条件下，连续进样6次，测定峰面积，虎杖苷对照品峰面积RSD%为1.0%，白藜芦醇对照品峰面积RSD%为0.9%，表明仪器精密度良好。
2.3.8 稳定性实验 精密称取一份样品，按2.3.4制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，分别于配制后0、3、6、18、24h，按2.3.2项下色谱条件进样测定，测定虎杖苷峰面积RSD%为1.7%，白藜芦醇峰面积RSD%为1.3%，结果表明供试品溶液中虎杖苷和白藜芦醇在24h内稳定。[JP]
2.3.9 重复性实验 精密称取同一批号样品6份，按2.3.4方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，按2.3.2项下色谱条件进样测定，虎杖苷平均含量为0.3701mg/g，RSD=0.5%，白藜芦醇平均含量0.8781mg/g，RSD=0.7%，表明该方法重复性良好。
2.3.10 回收率实验 精密称定已知含有量的样品（虎杖苷平均含量0.3701mg/g、白藜芦醇平均含量0.8781mg/g）6份，精密加入对照品虎杖苷0.240mg，白藜芦醇0.483mg，按2.3.4方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10μL，按2.3.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果虎杖苷和白藜芦醇的平均回收率分别为99.6%和100.1%，RSD（n=6）分别为1.1%和0.95%，表明实验方法准确度较高，结果见表2。
2.3.11 耐用性试验 分别采用3支不同品牌的C18色谱柱waters xbridge（4.6mm×250mm，5μm）、迪马（4.6mm×250mm，5μm）、Thermo（4.6mm×250mm，5μm）在戴安U3000高效液相色谱仪上对同一批藜芦样品进行测定，精密吸取供试品溶液10μL，按2.3.2色谱条件进样测定，记录峰面积，结果虎杖苷和白藜芦醇的RSD%分别为2.2%、2.0%。
2.4 样品含量测定结果 取上述3批藜芦药材，按2.3.4项下方法制备供试品溶液并测定色谱峰面积，计算藜芦药材虎杖苷和白藜芦醇的含量，结果见表3。
3 讨论
根据参考文献，选择甲醇-水、乙腈-水流动相按表1梯度洗脱表进行洗脱，结果乙腈-水在表1梯度洗脱条件下可以使供试品目标化合物有效分离，再选择乙腈-1%磷酸溶液、乙腈-2%磷酸溶液、乙腈-4%磷酸溶液照表1梯度洗脱表进行比较，结果上述各系统均可以使供试品目标化合物有效分离，峰型也较理想，但因乙腈-水系统配制方便，成本低，毒性低，故最终选择乙腈-水为最佳流动相系统。
虎杖苷和白藜芦醇对光照不稳定，在进行虎杖苷和白藜芦醇含量测定操作时均要避光操作，如不避光操作，对照品色谱图中会出现杂峰，疑为对照品在光照条件下被降解转化为其他化合物，后续会对供试品中化合物的光照降解途径进行进一步研究。
用甲醇、乙醇超声提取1h，甲醇效果较好;再用25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇提取，结果用50%甲醇提取溶剂提取所测得的虎杖苷和白藜芦醇峰面积最高，含量较高，甲醇提取次之;但是在50%甲醇提取溶剂下反复进行准确度实验，虎杖苷的回收率满足要求，白藜芦醇的回收率仅为50%～60%，选用甲醇作为提取溶剂进行准确度实验，虎杖苷和白藜芦醇的回收率均能达到药品质量标准分析方法验证指导原则要求。
本实验对藜芦Veratrum nigrum L.的TLC鉴别及HPLC含量测定的研究，方法可靠稳定，简便易行，可较全面、可靠地控制藜芦的质量，为其质量标准的提升制定提供可靠依据。
参考文献
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[3]孙治刚，李志娜，李敏.白藜芦醇研究进展[J].淮海工学院学报（自然科学版），2017，2（26）：40-43.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：208.
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[7]朱立贤，金征宇，陶冠军.HPLC测定虎杖中的白藜芦醇和白藜芦醇苷的含量[J].中成药，2005，27（8）：944 -946.