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摘要：针对茶叶中出现的高氯酸盐污染问题，建立液相色谱一串联质谱联用仪测定方法。样品经100mL热水提取，于10000 r/min下离心10min，上清液经C18固相萃取柱净化，ZORBAX SAX色谱柱分离，以100mmol/L乙酸铵溶液一甲醇一乙腈为流动相进行梯度洗脱，多重反应监测（MRM），外标法定量。结果表明，高氯酸盐质量浓度在O.5～200.0ug/L范围内与峰面积呈现良好线性关系，方法的加标回收率为98.9%～101.9%，相对标准偏差均<6%，检出限为0.004mg/kg，定量限为0.01mg，kg，具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优点，可很好地满足茶叶中高氯酸盐的检测和质量监管需要。
关键词：茶叶；高氯酸盐；液相色谱一串联质谱联用仪；多重反应监测
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2016）04-0001-04
0.引言
茶叶作为我国传统健康饮品，深受国内外消费者的青睐。然而，茶叶质量安全一直是制约我国茶产业健康发展的关键问题之一。近期，输欧茶叶含“高氯酸盐”事件再次把茶叶推向食品安全的风口浪尖。高氯酸盐是一种持久性的无机污染物，被广泛应用于军事、烟火、皮革加工、橡胶制造、涂料生产等领域。茶树种植过程中使用的化肥、灌溉用水、工业废水或者自来水，加工过程中含氯消毒剂的使用以及包装材料的迁移都可能成为茶叶中高氯酸盐污染的来源。高氯酸盐会干扰人体甲状腺素的合成与分泌，阻碍人体的生长发育，甚至导致甲状腺癌。2002年，美国环境保护署（EPA）就建议规定饮用水中高氯酸盐的最大容许浓度为1ug/L。当前，欧盟虽尚未正式出台食品中高氯酸盐的限量标准，但已考虑把食品中高氯酸盐的限量设定在0.75mg/kg，应该引起我国有关部门的高度重视。
目前，针对高氯酸盐的分析研究主要集中在地表水、污水、污泥等环境样品和饮料、蔬菜、牛奶、奶粉等食品样品方面，测定方法主要有离子色谱法、离子色谱一质谱法、液相色谱一串联质谱法等。离子色谱法虽然是最常见方法，但其对目标物的测定只能依靠保留时间定性，而且易受其他共存离子干扰，测定复杂基质样品时灵敏度往往会降低：离子色谱一质谱法虽然较离子色谱法有很大的优势，但离子色谱采用的流动相多为无机酸碱，不适合直接进入离子源，需经过抑制性转换成水，检测成本较高、操作较复杂。液相色谱一串联质谱法已经应用于饮用水、奶粉等样品中高氯酸盐的测定，尚未见到有关茶叶中高氯酸盐测定方法的报道。本文建立了茶叶中高氯酸盐的液相色谱一串联质谱测定方法，具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优势，可很好地满足茶叶中高氯酸盐的检测和质量监管需要。
1.材料与方法
1.1仪器与设备
Agilent 1260/G 6420型液相色谱一串联质谱联用仪（配ESI源）；Eppendorf 5810R型高速冷冻离心机：Saa06us BP 211D型电子天平：Millipore Milli-Q型超纯水器：XW-80A型漩涡混合器：DZKW-4型电热恒温水浴锅。
1.2材料与试剂
材料与试剂：ProElut C18固相萃取柱（500mg/6mL）；甲醇、甲酸和乙腈（美国Sigma-Aldrich公司），色谱纯；高氯酸钠（含量≥99.5%）和乙酸铵（成都科龙化工试剂厂），分析纯。
样品：市售茶叶，编号A、B、C、D。
高氯酸盐标准储备液：准确称取高氯酸钠0.1000g，用超纯水溶解并定容至1000mL容量瓶中，配制成质量浓度为100mg/L的高氯酸盐标准储备液，4℃保存，有效期为2个月。使用时根据需要稀释成适当质量浓度的标准工作溶液。
1.3样品前处理
准确称取5g（精确到0.0001g）茶叶样品于250mL具塞三角瓶中，加入100mL超纯水，于80℃恒温水浴锅中浸提10min，冷却至室温后取5mL浸提液10000r/min离心10min，取0.5mL上清液过事先用2mL乙腈和2mL超纯水活化过的C18固相萃取柱，弃去流出液，再吸取1mL上清液过C18固相萃取柱，收集流出液，涡旋振荡30s，供液相色谱一串联质谱测定。
1.4液相色谱与质谱条件1.4.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SAX色谱柱（150mmx4.6mm，5um）：流动相：A为100mmol/L乙酸铵溶液，B为甲醇，c为乙腈；梯度洗脱程序见表1；流量：0.7mL/min；色谱柱温度：25℃；进样量：5ul，分流比：l：1。
1.4.2质谱条件
离子源：ESI源，负离子模式：扫描方式：多重反应监测（MRM）；干燥气（N2）温度：350℃；雾化气（N2）压力：35 psi；干燥气流量：12.0L/min；喷雾电压：3500v；监测离子对m/z：98.9—83.0（定量）、101.0—85.0；碎裂电压：120v；碰撞能：30v；扫描时间：300ms。
2.结果与验证
2.1方法专属性验证
准确称取空白茶叶样品A2份，其中1份加入适量的高氯酸盐标准工作溶液，按照本文方法进行前处理，制得空白基质溶液和空白基质加标溶液。分别取超纯水（空白溶液）、标准工作溶液、空白基质溶液和空白基质加标溶液进行测定，考察本方法的专属性，谱图如图1所示。结果表明，高氯酸盐峰形尖锐、对称，保留时间稳定，空白溶液和样品基质溶液对高氯酸盐的分离和测定无干扰，表明本方法具有良好的专属性，适合茶叶样品中高氯酸盐的测定。
2.2方法灵敏度验证
取适量的高氯酸盐标准储备液，用超纯水稀释成不同浓度的高氯酸盐标准工作溶液，按照本方法进行测定，以信噪比法考察本方法的灵敏度。以3倍信噪比（3S/N）确定本方法中高氯酸盐的检出限为0.004mg/kg，以10倍信噪比（10S/N）确定本方法中高氯酸盐的定量限为0.01mg/kg，表明本方法具有良好的灵敏度，完全满足欧盟（EU）2015/682号法规对茶叶中高氯酸盐分析方法定量限不高于0.02 mg/kg的要求。
2.3方法线性与范围验证
取适量的高氯酸盐标准储备液，用超纯水逐级稀释成质量浓度为0.5，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0，200.0 wg/L的系列标准工作溶液，按照本方法进行测定，以峰面积y与对应的质量浓度x（wg/L）绘制标准曲线，考察本方法的线性与范围。结果表明，高氯酸盐质量浓度在0.5～200.0ug/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为y=42.086x+33.424，相关系数为0.9997。
2.4方法准确度验证
准确称取茶叶样品A12份，等分成4组，其中3组分别添加10.0，50.0，100.0ug/kg的高氯酸盐标准溶液，按照本方法进行测定，考察本方法的准确度，测定结果见表2。由表可知，本方法测定茶叶中高氯酸盐的回收率在98.9%～101.9%之间，相对标准偏差均<6%，表明本方法具有良好的准确度。
2.5方法精密度验证
准确称取茶叶样品B、C、D各6份，按照本方法进行测定，连续3天重复测定，考察本方法的日内精密度和日间精密度，测定结果见表3。由表可知，本方法测定3种茶叶中高氯酸盐的日内和日间精密度相对标准偏差均<5%，表明本方法具有良好的精密度。
2.6方法稳定性验证
准确称取茶叶样品B、C、D各1份，按照本方法进行前处理，待测液分别于室温下放置1，2，4，8，12，24，48，72h后进行测定，考察本方法的日内稳定性和日间稳定性，测定结果见表4。由表可知，本方法测定3种茶叶中高氯酸盐的日内和日间稳定性相对标准偏差均<2%，表明本方法具有良好的稳定性。
3.结束语
本文考察了茶叶样品的提取净化方法，优化了色谱条件和质谱参数，方法的加标回收率为98.9%～101.9%，相对标准偏差均<6%，检出限为0.004mg]kg，定量限为0.01 mg/kg，具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优势，能够很好地满足茶叶中高氯酸盐的检测和质量监管需要。
关键词：茶叶；高氯酸盐；液相色谱一串联质谱联用仪；多重反应监测
文献标志码：A
文章编号：1674-5124（2016）04-0001-04
0.引言
茶叶作为我国传统健康饮品，深受国内外消费者的青睐。然而，茶叶质量安全一直是制约我国茶产业健康发展的关键问题之一。近期，输欧茶叶含“高氯酸盐”事件再次把茶叶推向食品安全的风口浪尖。高氯酸盐是一种持久性的无机污染物，被广泛应用于军事、烟火、皮革加工、橡胶制造、涂料生产等领域。茶树种植过程中使用的化肥、灌溉用水、工业废水或者自来水，加工过程中含氯消毒剂的使用以及包装材料的迁移都可能成为茶叶中高氯酸盐污染的来源。高氯酸盐会干扰人体甲状腺素的合成与分泌，阻碍人体的生长发育，甚至导致甲状腺癌。2002年，美国环境保护署（EPA）就建议规定饮用水中高氯酸盐的最大容许浓度为1ug/L。当前，欧盟虽尚未正式出台食品中高氯酸盐的限量标准，但已考虑把食品中高氯酸盐的限量设定在0.75mg/kg，应该引起我国有关部门的高度重视。
目前，针对高氯酸盐的分析研究主要集中在地表水、污水、污泥等环境样品和饮料、蔬菜、牛奶、奶粉等食品样品方面，测定方法主要有离子色谱法、离子色谱一质谱法、液相色谱一串联质谱法等。离子色谱法虽然是最常见方法，但其对目标物的测定只能依靠保留时间定性，而且易受其他共存离子干扰，测定复杂基质样品时灵敏度往往会降低：离子色谱一质谱法虽然较离子色谱法有很大的优势，但离子色谱采用的流动相多为无机酸碱，不适合直接进入离子源，需经过抑制性转换成水，检测成本较高、操作较复杂。液相色谱一串联质谱法已经应用于饮用水、奶粉等样品中高氯酸盐的测定，尚未见到有关茶叶中高氯酸盐测定方法的报道。本文建立了茶叶中高氯酸盐的液相色谱一串联质谱测定方法，具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优势，可很好地满足茶叶中高氯酸盐的检测和质量监管需要。
1.材料与方法
1.1仪器与设备
Agilent 1260/G 6420型液相色谱一串联质谱联用仪（配ESI源）；Eppendorf 5810R型高速冷冻离心机：Saa06us BP 211D型电子天平：Millipore Milli-Q型超纯水器：XW-80A型漩涡混合器：DZKW-4型电热恒温水浴锅。
1.2材料与试剂
材料与试剂：ProElut C18固相萃取柱（500mg/6mL）；甲醇、甲酸和乙腈（美国Sigma-Aldrich公司），色谱纯；高氯酸钠（含量≥99.5%）和乙酸铵（成都科龙化工试剂厂），分析纯。
样品：市售茶叶，编号A、B、C、D。
高氯酸盐标准储备液：准确称取高氯酸钠0.1000g，用超纯水溶解并定容至1000mL容量瓶中，配制成质量浓度为100mg/L的高氯酸盐标准储备液，4℃保存，有效期为2个月。使用时根据需要稀释成适当质量浓度的标准工作溶液。
1.3样品前处理
准确称取5g（精确到0.0001g）茶叶样品于250mL具塞三角瓶中，加入100mL超纯水，于80℃恒温水浴锅中浸提10min，冷却至室温后取5mL浸提液10000r/min离心10min，取0.5mL上清液过事先用2mL乙腈和2mL超纯水活化过的C18固相萃取柱，弃去流出液，再吸取1mL上清液过C18固相萃取柱，收集流出液，涡旋振荡30s，供液相色谱一串联质谱测定。
1.4液相色谱与质谱条件1.4.1色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SAX色谱柱（150mmx4.6mm，5um）：流动相：A为100mmol/L乙酸铵溶液，B为甲醇，c为乙腈；梯度洗脱程序见表1；流量：0.7mL/min；色谱柱温度：25℃；进样量：5ul，分流比：l：1。
1.4.2质谱条件
离子源：ESI源，负离子模式：扫描方式：多重反应监测（MRM）；干燥气（N2）温度：350℃；雾化气（N2）压力：35 psi；干燥气流量：12.0L/min；喷雾电压：3500v；监测离子对m/z：98.9—83.0（定量）、101.0—85.0；碎裂电压：120v；碰撞能：30v；扫描时间：300ms。
2.结果与验证
2.1方法专属性验证
准确称取空白茶叶样品A2份，其中1份加入适量的高氯酸盐标准工作溶液，按照本文方法进行前处理，制得空白基质溶液和空白基质加标溶液。分别取超纯水（空白溶液）、标准工作溶液、空白基质溶液和空白基质加标溶液进行测定，考察本方法的专属性，谱图如图1所示。结果表明，高氯酸盐峰形尖锐、对称，保留时间稳定，空白溶液和样品基质溶液对高氯酸盐的分离和测定无干扰，表明本方法具有良好的专属性，适合茶叶样品中高氯酸盐的测定。
2.2方法灵敏度验证
取适量的高氯酸盐标准储备液，用超纯水稀释成不同浓度的高氯酸盐标准工作溶液，按照本方法进行测定，以信噪比法考察本方法的灵敏度。以3倍信噪比（3S/N）确定本方法中高氯酸盐的检出限为0.004mg/kg，以10倍信噪比（10S/N）确定本方法中高氯酸盐的定量限为0.01mg/kg，表明本方法具有良好的灵敏度，完全满足欧盟（EU）2015/682号法规对茶叶中高氯酸盐分析方法定量限不高于0.02 mg/kg的要求。
2.3方法线性与范围验证
取适量的高氯酸盐标准储备液，用超纯水逐级稀释成质量浓度为0.5，1.0，5.0，10.0，50.0，100.0，200.0 wg/L的系列标准工作溶液，按照本方法进行测定，以峰面积y与对应的质量浓度x（wg/L）绘制标准曲线，考察本方法的线性与范围。结果表明，高氯酸盐质量浓度在0.5～200.0ug/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为y=42.086x+33.424，相关系数为0.9997。
2.4方法准确度验证
准确称取茶叶样品A12份，等分成4组，其中3组分别添加10.0，50.0，100.0ug/kg的高氯酸盐标准溶液，按照本方法进行测定，考察本方法的准确度，测定结果见表2。由表可知，本方法测定茶叶中高氯酸盐的回收率在98.9%～101.9%之间，相对标准偏差均<6%，表明本方法具有良好的准确度。
2.5方法精密度验证
准确称取茶叶样品B、C、D各6份，按照本方法进行测定，连续3天重复测定，考察本方法的日内精密度和日间精密度，测定结果见表3。由表可知，本方法测定3种茶叶中高氯酸盐的日内和日间精密度相对标准偏差均<5%，表明本方法具有良好的精密度。
2.6方法稳定性验证
准确称取茶叶样品B、C、D各1份，按照本方法进行前处理，待测液分别于室温下放置1，2，4，8，12，24，48，72h后进行测定，考察本方法的日内稳定性和日间稳定性，测定结果见表4。由表可知，本方法测定3种茶叶中高氯酸盐的日内和日间稳定性相对标准偏差均<2%，表明本方法具有良好的稳定性。
3.结束语
本文考察了茶叶样品的提取净化方法，优化了色谱条件和质谱参数，方法的加标回收率为98.9%～101.9%，相对标准偏差均<6%，检出限为0.004mg]kg，定量限为0.01 mg/kg，具有操作简单、灵敏度高、稳定性好等优势，能够很好地满足茶叶中高氯酸盐的检测和质量监管需要。