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【摘要】目的：探讨Th1型细胞因子IL－2和IFN－γ在自身免疫性卵巢功能早衰（POF）中的表达。方法：分别用猪卵透明带（PZP）抗原和PBS缓冲液注射免疫Balb/c小鼠，共免疫3次，每2W免疫1次，经过3次免疫后，观察各组卵巢组织病理形态，并测定各组IL－2和IFN－γ水平。结果：PZP免疫小鼠卵巢组织形态明显改变，且Th1性细胞因子IL－2和IFN－γ表达均明显高于对照组。结论：自身免疫性卵巢功能早衰与T细胞介导的Th1型免疫应答有关。
【关键词】卵巢透明带抗原 自身免疫性卵巢早衰 IL-2IFN-γ
The expression of IL-2 and IFN-γ of premature ovarian failure in murine autoimmune oophoritis immunized by procine zona pellucida
Yang Gui hua 1Ke Dan 2
【Abstract】Objective to investigate the expression of IL-2 and IFN-γ of premature ovarian failure in murine autoimmune oophoritis immunized by procine zona pellucida.Methods:Each female Balb/c mouse receive 0.1ml of adjuvant emulsion and porcine ZP(or PBS), at two weeks intervals for three times. The histopathology of ovaries and expression of IL-2,IFN-γ in the splenism. Results: There was a noticeable change in the ovaries of immunized group mice compared with the control group mices. The expression of IL-2 and IFN-γ increased compared to controls. Conclusion: The results suggested that the Th1 type immune response was related to premature ovarian failure.
【Key words】Ovarian zona pellicidaPemature ovarian failureIL-2IFN-γ
近年来研究发现,卵巢自身免疫应答可能参与卵巢早衰(POF)的发病过程,并影响正常生育［1］。Smith等首次报道抗卵透明带抗体与POF相关［2］。透明带抗原（zone pellucida,ZP）蛋白是围绕在所有哺乳动物卵母细胞、受精卵和分裂胚胎外层，由三种糖蛋白组成的胞外基质［3］，参与诸如特意性的精子－ZP识别与结合，诱发精子顶体反映，精子穿透ZP，阻止多精子入卵以及保护着床前胚胎等一系列重要的生殖事件［4］。因而ZP一直是生殖生物学和生殖免疫学领域中最受关注研究最多的靶蛋白之一。目前,已经能够用猪透明带抗原免疫动物构建人类POF模型［5,6］,从而更好的研究POF的发病机制。本研究利用猪卵透明带(PZP)免疫Balb/c小鼠测定脾胞体外诱生的IL-2及IFN-γ含量,观察免疫小鼠的卵巢形态学改变,探讨透明带在卵巢功能损伤中的作用机理。
1 材料与方法
1.1抗原的制备：收集的猪卵子70℃水浴1h后，离心收集上清［7］。上清液经Sephadex G-100凝胶层析，收集主峰蛋白，透析浓缩，常规蛋白定量（20mg/l）。
1.2动物免疫： 8~10周龄雌性Balb/c小鼠，免疫前通过阴道细胞涂片筛选正常性周期小鼠，随机分成两组，每组10只。模型组小鼠两脚掌和皮下多点注射5μgPZP加CFA混合乳化液，共0.1ml；对照组以同样注射方式给予0.1mlPBS。共免疫3次，每次间隔2周，第三次免疫后1周眼球放血处死小鼠，无菌收集卵巢和脾脏。
1.3卵巢组织形态学观察：收集的卵巢10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色。
1.4脾脏组织IL-2和IFN-Γ的检测：常规制备Balb/c小鼠脾脏细胞悬液，台盼蓝染色计数，活细胞大于95％，调整细胞数为1×109，加入RPMI-1640,37℃，4％CO2培养箱至所需时间，收集上清，采用夹心ELISA法，按照试剂盒说明测定IL-2和IFN-γ的浓度。
1.5统计分析：实验数据以x±s表示，所有数据经SPSS12.0统计软件进行分析。
2 实验结果
2.1巢组织形态学观察：显微镜下观察模型组和对照组卵巢组织HE染色，模型组所有的Balb/c小鼠都不同程度的以大量淋巴细胞和浆细胞浸润为特征的自身免疫性卵巢炎。（图A.B.C.D）图A是对照组卵巢组织形态,显示不同阶段的滤泡和黄体。图B是模型组卵巢组织形态,显示卵巢变小,黄体消失,滤泡破坏增多数量减少。图C出现凋亡小体及滤泡内淋巴细胞浸润。图D卵透明带塌陷或者断裂,卵母细胞出现核碎裂,形成凋亡小体,滤泡间有炎性细胞浸润,局部间质黄素化。
2.2射电镜观察小鼠卵巢组织形态学改变：在透射电子显微镜下观察卵母细胞透明带（ZP），见ZP由现为和颗粒组成，并可见颗粒细胞和卵母细胞插入ZP的微绒毛。在本次实验中，对照组小鼠的卵母细胞ZP未见明显改变，而模型组小鼠的卵母细胞ZP厚度不均，边界不清，ZP内微绒毛增多，透明带内出现髓样小体和少量小空泡，于颗粒细胞间可见多个固缩细胞。（图2）
2.3鼠脾脏组织IL-2和IFN-γ的水平：PZP免疫的模型组小鼠IL-2和IFN-γ水平均明显升高，与对照组相比有统计学意义。（数据以x±s表示）（P<0.01）（见表1）
3 讨论
大约有1％的生育期妇女患有自身免疫性卵巢功能早衰（POF）［8］，且35％POF患者与免疫功能紊乱有关［9,10］。透明带（zone pellucida，ZP）抗原是卵母细胞最主要的表达抗原，哺乳动物的卵透明带是由卵母细胞分泌的并包裹在卵母细胞周围额一层很薄的透明基质膜构成，其主要成分是糖蛋白。ZP具有诱导精子顶体反映、促进精子与卵细胞结合的作用，同时也具有阻止多精子受精作用。20世纪70年代后期，人们就已证实ZP具有很强的抗原性抗ZP抗体不仅能够阻止卵细胞受精，也能引起卵泡的闭锁，影响卵泡的发育。完整的ZP抗原既有T细胞抗原依赖区，又有B细胞依赖区。其中有些T细胞抗原依赖区的决定簇刺激Th1型细胞分泌细胞因子，主要介导细胞免疫，导致卵巢功能受损。近年来研究表明ZP抗体可能是导致POF的重要原因，但T细胞介导的细胞免疫也可能是原因之一［11］。在本实验中，卵透明带免疫激活致CD4+T细胞，从而分泌IL-2、IFN-Γ。IL-2、IFN-γ在调节机体免疫功能方面具有非常重要的作用，同时也是调节Th细胞亚型Th1和Th2细胞功能的关键因素之一。IL-2和IFN-γ的分泌可以促进Th1细胞的增值与分化，同时抑制Th2细胞的增值。实验数据显示模型组Th1型细胞因子IL-1和IFN-γ相比较对照组均有明显升高（P<0.01），提示自身免疫性卵巢功能损伤和Th1型免疫应答有关。人类POF的发病机制还有待临床上的进一步研究。
参考文献
1 Andrew R L ,Michael MM,Carole O et al .Autoimmune etiology in premature ovarian failure［J］. AmJ Reprod Immunol Microbiol ,1998 ;16 :115
2Smith S ,Hosid S. Premature ovarian failure associated with autoantibodies to the zona pellucida［J］. Int J Fertil ,1994 ;39(6) :316
3Dunbar BS , Avery S , Lee V , et al. The mammalian zona pellucida : its biochemistry immunochemistry , molecular biology and developmental expression. Reprod Fertil Dev ,1994 ,6 :59
4Skinner SM , Prasd SV , Nddlo TM , et al. Zona pellucida antigens : targets for contraceptive vaccines. Am J Reprod Immunol , 1996 ,35 :163
5Rhin S H, Millar S E, Robey F et al. Autoimmune disease of the ovary induced by a ZP3 peptide from the mouse zona pellucida.J Clin Invest,1992;89:28
6Lou Y H, McElveen F, Adaams S et al. Altered target organ: a mechanism of postrecovery resistance to murine autoimmune oophoritis. J Immunol, 1995:155:3667
7Skinner SM,Mills T ,Kirchick HJ et al . Immunization with zona pellucida proterns results in abnormal ovarina follicular differentiations and inhibition of gonadotropin2induced steroid secretion［J］.Endocrinology ,1984 ;115:2418
8 Davis S R. Premature ovarian failure. Maturitas, 1996;23:1
9Coulam C B ,Adamson S C ,Annegers J F. Incidence of premature ovarian failure［J ］. Obstet Gynecol ,1986 ;67 :604
10Alper M M, Garner P R ,Seibel M M. Premature ovarian failure -gurrent concepts［J ］. J Reprod Med ,1986 ;31 :699
11Rhim S H ,Millar S E ,Robey F et al . Autoimmune disease of the ovary induced by a ZP3 peptide from the nouse zona pellucida［J ］.Clin Invest ,1992 ;89 :28
作者单位:437000湖北省咸宁市咸安区中医院
430030华中科技大学同济医学院附属同济医院
【关键词】卵巢透明带抗原 自身免疫性卵巢早衰 IL-2IFN-γ
The expression of IL-2 and IFN-γ of premature ovarian failure in murine autoimmune oophoritis immunized by procine zona pellucida
Yang Gui hua 1Ke Dan 2
【Abstract】Objective to investigate the expression of IL-2 and IFN-γ of premature ovarian failure in murine autoimmune oophoritis immunized by procine zona pellucida.Methods:Each female Balb/c mouse receive 0.1ml of adjuvant emulsion and porcine ZP(or PBS), at two weeks intervals for three times. The histopathology of ovaries and expression of IL-2,IFN-γ in the splenism. Results: There was a noticeable change in the ovaries of immunized group mice compared with the control group mices. The expression of IL-2 and IFN-γ increased compared to controls. Conclusion: The results suggested that the Th1 type immune response was related to premature ovarian failure.
【Key words】Ovarian zona pellicidaPemature ovarian failureIL-2IFN-γ
近年来研究发现,卵巢自身免疫应答可能参与卵巢早衰(POF)的发病过程,并影响正常生育［1］。Smith等首次报道抗卵透明带抗体与POF相关［2］。透明带抗原（zone pellucida,ZP）蛋白是围绕在所有哺乳动物卵母细胞、受精卵和分裂胚胎外层，由三种糖蛋白组成的胞外基质［3］，参与诸如特意性的精子－ZP识别与结合，诱发精子顶体反映，精子穿透ZP，阻止多精子入卵以及保护着床前胚胎等一系列重要的生殖事件［4］。因而ZP一直是生殖生物学和生殖免疫学领域中最受关注研究最多的靶蛋白之一。目前,已经能够用猪透明带抗原免疫动物构建人类POF模型［5,6］,从而更好的研究POF的发病机制。本研究利用猪卵透明带(PZP)免疫Balb/c小鼠测定脾胞体外诱生的IL-2及IFN-γ含量,观察免疫小鼠的卵巢形态学改变,探讨透明带在卵巢功能损伤中的作用机理。
1 材料与方法
1.1抗原的制备：收集的猪卵子70℃水浴1h后，离心收集上清［7］。上清液经Sephadex G-100凝胶层析，收集主峰蛋白，透析浓缩，常规蛋白定量（20mg/l）。
1.2动物免疫： 8~10周龄雌性Balb/c小鼠，免疫前通过阴道细胞涂片筛选正常性周期小鼠，随机分成两组，每组10只。模型组小鼠两脚掌和皮下多点注射5μgPZP加CFA混合乳化液，共0.1ml；对照组以同样注射方式给予0.1mlPBS。共免疫3次，每次间隔2周，第三次免疫后1周眼球放血处死小鼠，无菌收集卵巢和脾脏。
1.3卵巢组织形态学观察：收集的卵巢10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色。
1.4脾脏组织IL-2和IFN-Γ的检测：常规制备Balb/c小鼠脾脏细胞悬液，台盼蓝染色计数，活细胞大于95％，调整细胞数为1×109，加入RPMI-1640,37℃，4％CO2培养箱至所需时间，收集上清，采用夹心ELISA法，按照试剂盒说明测定IL-2和IFN-γ的浓度。
1.5统计分析：实验数据以x±s表示，所有数据经SPSS12.0统计软件进行分析。
2 实验结果
2.1巢组织形态学观察：显微镜下观察模型组和对照组卵巢组织HE染色，模型组所有的Balb/c小鼠都不同程度的以大量淋巴细胞和浆细胞浸润为特征的自身免疫性卵巢炎。（图A.B.C.D）图A是对照组卵巢组织形态,显示不同阶段的滤泡和黄体。图B是模型组卵巢组织形态,显示卵巢变小,黄体消失,滤泡破坏增多数量减少。图C出现凋亡小体及滤泡内淋巴细胞浸润。图D卵透明带塌陷或者断裂,卵母细胞出现核碎裂,形成凋亡小体,滤泡间有炎性细胞浸润,局部间质黄素化。
2.2射电镜观察小鼠卵巢组织形态学改变：在透射电子显微镜下观察卵母细胞透明带（ZP），见ZP由现为和颗粒组成，并可见颗粒细胞和卵母细胞插入ZP的微绒毛。在本次实验中，对照组小鼠的卵母细胞ZP未见明显改变，而模型组小鼠的卵母细胞ZP厚度不均，边界不清，ZP内微绒毛增多，透明带内出现髓样小体和少量小空泡，于颗粒细胞间可见多个固缩细胞。（图2）
2.3鼠脾脏组织IL-2和IFN-γ的水平：PZP免疫的模型组小鼠IL-2和IFN-γ水平均明显升高，与对照组相比有统计学意义。（数据以x±s表示）（P<0.01）（见表1）
3 讨论
大约有1％的生育期妇女患有自身免疫性卵巢功能早衰（POF）［8］，且35％POF患者与免疫功能紊乱有关［9,10］。透明带（zone pellucida，ZP）抗原是卵母细胞最主要的表达抗原，哺乳动物的卵透明带是由卵母细胞分泌的并包裹在卵母细胞周围额一层很薄的透明基质膜构成，其主要成分是糖蛋白。ZP具有诱导精子顶体反映、促进精子与卵细胞结合的作用，同时也具有阻止多精子受精作用。20世纪70年代后期，人们就已证实ZP具有很强的抗原性抗ZP抗体不仅能够阻止卵细胞受精，也能引起卵泡的闭锁，影响卵泡的发育。完整的ZP抗原既有T细胞抗原依赖区，又有B细胞依赖区。其中有些T细胞抗原依赖区的决定簇刺激Th1型细胞分泌细胞因子，主要介导细胞免疫，导致卵巢功能受损。近年来研究表明ZP抗体可能是导致POF的重要原因，但T细胞介导的细胞免疫也可能是原因之一［11］。在本实验中，卵透明带免疫激活致CD4+T细胞，从而分泌IL-2、IFN-Γ。IL-2、IFN-γ在调节机体免疫功能方面具有非常重要的作用，同时也是调节Th细胞亚型Th1和Th2细胞功能的关键因素之一。IL-2和IFN-γ的分泌可以促进Th1细胞的增值与分化，同时抑制Th2细胞的增值。实验数据显示模型组Th1型细胞因子IL-1和IFN-γ相比较对照组均有明显升高（P<0.01），提示自身免疫性卵巢功能损伤和Th1型免疫应答有关。人类POF的发病机制还有待临床上的进一步研究。
参考文献
1 Andrew R L ,Michael MM,Carole O et al .Autoimmune etiology in premature ovarian failure［J］. AmJ Reprod Immunol Microbiol ,1998 ;16 :115
2Smith S ,Hosid S. Premature ovarian failure associated with autoantibodies to the zona pellucida［J］. Int J Fertil ,1994 ;39(6) :316
3Dunbar BS , Avery S , Lee V , et al. The mammalian zona pellucida : its biochemistry immunochemistry , molecular biology and developmental expression. Reprod Fertil Dev ,1994 ,6 :59
4Skinner SM , Prasd SV , Nddlo TM , et al. Zona pellucida antigens : targets for contraceptive vaccines. Am J Reprod Immunol , 1996 ,35 :163
5Rhin S H, Millar S E, Robey F et al. Autoimmune disease of the ovary induced by a ZP3 peptide from the mouse zona pellucida.J Clin Invest,1992;89:28
6Lou Y H, McElveen F, Adaams S et al. Altered target organ: a mechanism of postrecovery resistance to murine autoimmune oophoritis. J Immunol, 1995:155:3667
7Skinner SM,Mills T ,Kirchick HJ et al . Immunization with zona pellucida proterns results in abnormal ovarina follicular differentiations and inhibition of gonadotropin2induced steroid secretion［J］.Endocrinology ,1984 ;115:2418
8 Davis S R. Premature ovarian failure. Maturitas, 1996;23:1
9Coulam C B ,Adamson S C ,Annegers J F. Incidence of premature ovarian failure［J ］. Obstet Gynecol ,1986 ;67 :604
10Alper M M, Garner P R ,Seibel M M. Premature ovarian failure -gurrent concepts［J ］. J Reprod Med ,1986 ;31 :699
11Rhim S H ,Millar S E ,Robey F et al . Autoimmune disease of the ovary induced by a ZP3 peptide from the nouse zona pellucida［J ］.Clin Invest ,1992 ;89 :28
作者单位:437000湖北省咸宁市咸安区中医院
430030华中科技大学同济医学院附属同济医院