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摘要 以玉米品种沃玉964及其亲本为试验材料，进行了沃玉964玉米品种SSR指纹图谱的构建研究。结果表明，从72对玉米SSR引物中筛选出在沃玉964双亲间多态性好、重复性高的6对引物（分别为Phi090、umc2105、bnlg2305、umc1125、phi065和umc1506），可用于沃玉964的真实性检测，同时可为鉴定种子纯度提供参考。该方法准确可靠、实用性强，为生产上沃玉964真实性的快速、有效鉴定提供了科学依据。
关键词 玉米；沃玉964；SSR标记；指纹图谱
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）15-0001-01
Abstract Taking Woyu 964 and its parents as test material，fingerprint construction of corn variety Woyu 964 was studied.The results showed that six pairs of primers（Phi090，umc2105，bnlg2305，umc1125，phi065 and umc1506） screening from 72 pairs of maize SSR primers could be applied in authenticity detection of Woyu 964，which presented polymorphism，stable and clear between the parents. The method with high accuracy and strong practicality was applicable for testing seed purity of Woyu 964 rapidly and efficiently.
Key words maize；Woyu 964；SSR marker；fingerprinting
玉米品种的真实性检验和纯度鉴定对玉米种子质量管理具有重要意义。SSR标记具有数量丰富、信息含量高、呈共显性、检验程序简单等优点，被广泛应用于许多作物的DNA指纹图谱构建。近年来，前人在利用SSR分子标记技术构建DNA指纹图谱方面做了大量的研究工作。王凤格等[1]利用10个SSR引物对420份已知玉米杂交种进行DNA指纹分析，确定bnlg161和bnlg1450为玉米杂交种纯度鉴定的首选核心引物，5个引物bnlg439、bnlg125、umc2105、umcl705和bnlg1792为玉米杂交种纯度鉴定的备选核心引物。赵 静等[2]采用100对玉米SSR引物分析了陕西省23个主要玉米自交系的遗传多态性，从中筛选出扩增带型清晰、稳定的30对引物作为构建23个玉米自交系指纹图谱的核心引物。邱红波等[3]利用86对SSR引物分析了36份喀斯特高海拔山区玉米骨干自交系的多态性，从中确立了多态性、重复性均较好的34对核心引物。
盖树鹏等[4]分别利用74对SSR引物对35份骨干自交系和19份主栽杂交种进行了SSR分析，分别筛选出10对和20对适于玉米自交系和杂交种分析的核心引物。王文洁等[5]从50对SSR引物中筛选出双亲间多态性明显、重复性较好的5对引物bmc1792、bmc1496、umc2105、bnlg2291和phi065，可用于鉴定玉米品种新科19的真实性，同时为鉴定该种子的纯度提供参考。邸仕忠等[6]选用32对玉米SSR引物检测重庆市部分常用及新选玉米自交系间的遗传差异，从中筛选出10对引物作为构建66个玉米自交系指纹图谱的核心引物。
沃玉964是河北沃土种业股份有限公司选育的高产广适多抗玉米品种，目前已通过河北、河南两省审定、天津市引种认定和山西省引种备案。为了准确、高效地鉴定沃玉964，本研究对该品种及其亲本进行了分子指纹图谱构建。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料为沃玉964杂交种及其亲本ND140和Z598，均由河北沃土种业股份有限公司提供。DNA聚合酶、dNTP购自宝生物工程（大连）有限公司。SSR分析中所用的72对引物序列由玉米基因组数据库（http：//www.maizegdb.org/ssr.php）获得，分布在玉米10条染色体上[7-8]，由上海英骏生物工程有限公司合成。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA的提取。将沃玉964杂交种及其亲本种子在25 ℃培养箱内暗培养8 d左右，取黄化叶片混样，置于液氮中冷冻、研磨，用CTAB法提取基因组DNA[7]。紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将DNA样品浓度稀释至20 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.2.2 扩增体系及电泳分析。20 μL的反应体系包括2 μL 10×PCR Buffer、1 U Taq DNA 聚合酶、0.2 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物和20 ng模板DNA。PCR扩增程序：94 ℃預变性5 min；94 ℃ 变性40 s，60 ℃ 退火35 s，72 ℃延伸 45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR仪上进行。反应结束后置于4 ℃贮藏备用。反应产物变性后用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（75W， 1 h），银染[9-10]。
2 结果与分析
2.1 SSR多态性引物筛选
用分布在玉米10条染色体上的72对SSR标记引物，对沃玉964的2个亲本DNA进行扩增，初步筛选到能够扩增出条带并在亲本间有差异的10对引物。用这10对引物扩增沃玉964及其亲本，通过多次重复和比较最终选择出6对引物，可以用于构建沃玉964的指纹图谱（表1）。 2.2 指纹图谱构建
在扩增条带中，引物Phi090、umc2105、bnlg2305、umc1125、phi065、umc1506的指纹图谱中（图1）沃玉964及其亲本均表现出较好的杂种共显性图谱特征，而且这些引物所扩增出的主带大小集中在100～400 bp之间。
3 结论与讨论
SSR分子标记技术在遗传图谱构建、遗传多样性分析、自交系系谱研究、杂种优势类群划分和DNA指纹图谱构建等方面的研究都有很好的应用价值[11-12]。本研究筛选出6对SSR引物对沃玉964杂交种和亲本进行了SSR图谱的构建，这6对SSR引物重复性好，可为沃玉964真实性鉴定和纯度检验提供参考。
4 参考文献
[1] 王凤格，赵久然，王璐，等.适于玉米杂交种纯度鉴定的SSR核心引物的确定[J].农业生物技术学报，2007，15（6）：964-969.
[2] 赵静，张仁和，张兴华，等.利用SSR技术构建陕西省主要玉米自交系的指纹图谱[J].玉米科学，2008，16（2）：26-29.
[3] 邱红波，叶雨胜，彭忠华.喀斯特高海拔山区玉米骨干自交系SSR指纹图谱的构建[J].玉米科学，2010，18（4）：63-65.
[4] 盖树鹏，王日新，黄进勇.山东省玉米骨干自交系和杂交种的SSR指纹图谱构建[J].中国农学通报，2011，27（24）：40-44.
[5] 王文洁，周联东，郭玉霞，等.构建玉米新品种新科19指纹图谱的SSR引物筛选[J].湖北农业科学，2011，50（17）：3635-3636.
[6] 邸仕忠，孙小红，罗永统，等.重庆市常用及新选玉米自交系SSR指纹图谱构建[J].安徽大学学报（自然科学版），2015，39（5）：96-102.
[7] 王关林，方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京：科学出版社，2002：744.
[8] 赵久然，王凤格，郭景伦，等.中国玉米新品种DNA指纹库建立系列研究Ⅱ.适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的SSR核心引物的确定[J].玉米科学，2003，11（2）：3-5.
[9] 王伟，杨文鹏，张文龙，等.贵州48个玉米杂交种及其亲本SSR指纹图谱的构建与分析[J].贵州农业科学，2009（11）：1-8.
[10] 朱正梅，赵军华，胡贤女. SSR指纹图谱技术在玉米种子鉴定中的应用[J].农業科技通讯，2008（10）：93-95.
[11] 李丽华，魏昕，潘光堂.20个骨干玉米自交系的SSR指纹图谱构建[J].西南农业学报，2007（6）：1172-1175.
[12] 吴渝生，杨文鹏，郑用琏.3个玉米杂交种和亲本SSR指纹图谱的构建[J].作物学报，2003（4）：496-500.
关键词 玉米；沃玉964；SSR标记；指纹图谱
中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）15-0001-01
Abstract Taking Woyu 964 and its parents as test material，fingerprint construction of corn variety Woyu 964 was studied.The results showed that six pairs of primers（Phi090，umc2105，bnlg2305，umc1125，phi065 and umc1506） screening from 72 pairs of maize SSR primers could be applied in authenticity detection of Woyu 964，which presented polymorphism，stable and clear between the parents. The method with high accuracy and strong practicality was applicable for testing seed purity of Woyu 964 rapidly and efficiently.
Key words maize；Woyu 964；SSR marker；fingerprinting
玉米品种的真实性检验和纯度鉴定对玉米种子质量管理具有重要意义。SSR标记具有数量丰富、信息含量高、呈共显性、检验程序简单等优点，被广泛应用于许多作物的DNA指纹图谱构建。近年来，前人在利用SSR分子标记技术构建DNA指纹图谱方面做了大量的研究工作。王凤格等[1]利用10个SSR引物对420份已知玉米杂交种进行DNA指纹分析，确定bnlg161和bnlg1450为玉米杂交种纯度鉴定的首选核心引物，5个引物bnlg439、bnlg125、umc2105、umcl705和bnlg1792为玉米杂交种纯度鉴定的备选核心引物。赵 静等[2]采用100对玉米SSR引物分析了陕西省23个主要玉米自交系的遗传多态性，从中筛选出扩增带型清晰、稳定的30对引物作为构建23个玉米自交系指纹图谱的核心引物。邱红波等[3]利用86对SSR引物分析了36份喀斯特高海拔山区玉米骨干自交系的多态性，从中确立了多态性、重复性均较好的34对核心引物。
盖树鹏等[4]分别利用74对SSR引物对35份骨干自交系和19份主栽杂交种进行了SSR分析，分别筛选出10对和20对适于玉米自交系和杂交种分析的核心引物。王文洁等[5]从50对SSR引物中筛选出双亲间多态性明显、重复性较好的5对引物bmc1792、bmc1496、umc2105、bnlg2291和phi065，可用于鉴定玉米品种新科19的真实性，同时为鉴定该种子的纯度提供参考。邸仕忠等[6]选用32对玉米SSR引物检测重庆市部分常用及新选玉米自交系间的遗传差异，从中筛选出10对引物作为构建66个玉米自交系指纹图谱的核心引物。
沃玉964是河北沃土种业股份有限公司选育的高产广适多抗玉米品种，目前已通过河北、河南两省审定、天津市引种认定和山西省引种备案。为了准确、高效地鉴定沃玉964，本研究对该品种及其亲本进行了分子指纹图谱构建。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料为沃玉964杂交种及其亲本ND140和Z598，均由河北沃土种业股份有限公司提供。DNA聚合酶、dNTP购自宝生物工程（大连）有限公司。SSR分析中所用的72对引物序列由玉米基因组数据库（http：//www.maizegdb.org/ssr.php）获得，分布在玉米10条染色体上[7-8]，由上海英骏生物工程有限公司合成。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA的提取。将沃玉964杂交种及其亲本种子在25 ℃培养箱内暗培养8 d左右，取黄化叶片混样，置于液氮中冷冻、研磨，用CTAB法提取基因组DNA[7]。紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将DNA样品浓度稀释至20 ng/μL，-20 ℃保存备用。
1.2.2 扩增体系及电泳分析。20 μL的反应体系包括2 μL 10×PCR Buffer、1 U Taq DNA 聚合酶、0.2 mmol/L dNTPs、0.25 μmol/L引物和20 ng模板DNA。PCR扩增程序：94 ℃預变性5 min；94 ℃ 变性40 s，60 ℃ 退火35 s，72 ℃延伸 45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应在BIOER TC-96/G/H（b）型PCR仪上进行。反应结束后置于4 ℃贮藏备用。反应产物变性后用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（75W， 1 h），银染[9-10]。
2 结果与分析
2.1 SSR多态性引物筛选
用分布在玉米10条染色体上的72对SSR标记引物，对沃玉964的2个亲本DNA进行扩增，初步筛选到能够扩增出条带并在亲本间有差异的10对引物。用这10对引物扩增沃玉964及其亲本，通过多次重复和比较最终选择出6对引物，可以用于构建沃玉964的指纹图谱（表1）。 2.2 指纹图谱构建
在扩增条带中，引物Phi090、umc2105、bnlg2305、umc1125、phi065、umc1506的指纹图谱中（图1）沃玉964及其亲本均表现出较好的杂种共显性图谱特征，而且这些引物所扩增出的主带大小集中在100～400 bp之间。
3 结论与讨论
SSR分子标记技术在遗传图谱构建、遗传多样性分析、自交系系谱研究、杂种优势类群划分和DNA指纹图谱构建等方面的研究都有很好的应用价值[11-12]。本研究筛选出6对SSR引物对沃玉964杂交种和亲本进行了SSR图谱的构建，这6对SSR引物重复性好，可为沃玉964真实性鉴定和纯度检验提供参考。
4 参考文献
[1] 王凤格，赵久然，王璐，等.适于玉米杂交种纯度鉴定的SSR核心引物的确定[J].农业生物技术学报，2007，15（6）：964-969.
[2] 赵静，张仁和，张兴华，等.利用SSR技术构建陕西省主要玉米自交系的指纹图谱[J].玉米科学，2008，16（2）：26-29.
[3] 邱红波，叶雨胜，彭忠华.喀斯特高海拔山区玉米骨干自交系SSR指纹图谱的构建[J].玉米科学，2010，18（4）：63-65.
[4] 盖树鹏，王日新，黄进勇.山东省玉米骨干自交系和杂交种的SSR指纹图谱构建[J].中国农学通报，2011，27（24）：40-44.
[5] 王文洁，周联东，郭玉霞，等.构建玉米新品种新科19指纹图谱的SSR引物筛选[J].湖北农业科学，2011，50（17）：3635-3636.
[6] 邸仕忠，孙小红，罗永统，等.重庆市常用及新选玉米自交系SSR指纹图谱构建[J].安徽大学学报（自然科学版），2015，39（5）：96-102.
[7] 王关林，方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京：科学出版社，2002：744.
[8] 赵久然，王凤格，郭景伦，等.中国玉米新品种DNA指纹库建立系列研究Ⅱ.适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的SSR核心引物的确定[J].玉米科学，2003，11（2）：3-5.
[9] 王伟，杨文鹏，张文龙，等.贵州48个玉米杂交种及其亲本SSR指纹图谱的构建与分析[J].贵州农业科学，2009（11）：1-8.
[10] 朱正梅，赵军华，胡贤女. SSR指纹图谱技术在玉米种子鉴定中的应用[J].农業科技通讯，2008（10）：93-95.
[11] 李丽华，魏昕，潘光堂.20个骨干玉米自交系的SSR指纹图谱构建[J].西南农业学报，2007（6）：1172-1175.
[12] 吴渝生，杨文鹏，郑用琏.3个玉米杂交种和亲本SSR指纹图谱的构建[J].作物学报，2003（4）：496-500.