【摘 要】
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目的克隆Vero细胞基因组DNA的长串联重复序列(Long tandem repeats,LTR),并建立Vero细胞DNA定量PCR检测方法。方法提取Vero细胞基因组DNA,经HindⅢ酶切后,克隆至pET-30a(+)载
【基金项目】
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“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项(2009ZX10004-804)
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目的克隆Vero细胞基因组DNA的长串联重复序列(Long tandem repeats,LTR),并建立Vero细胞DNA定量PCR检测方法。方法提取Vero细胞基因组DNA,经HindⅢ酶切后,克隆至pET-30a(+)载体上,酶切及测序鉴定,并与Gen-Bank中登录的序列进行同源性比较。以172 bp序列为靶基因设计定量PCR引物和Taq探针,建立Vero细胞DNA定量PCR检测方法,并进行特异性验证。结果经酶切及测序鉴定,共获得8个阳性克隆质粒pET-30a-172,与GenBank中登录的基因序列同源性在98.3%～99.4%之间;建立的Vero细胞DNA定量PCR检测方法的灵敏度可达1×10-6 ng/μl,线性范围为1 ng/μl～1×10-6 ng/μl;以建立的方法检测鸡胚细胞、CHO细胞和地鼠肾细胞DNA,均未见扩增曲线,仅人二倍体细胞(MRC-5)DNA有明显的扩增曲线,表明该法特异性良好。结论已成功建立了以172 bp LTR为靶基因的Vero细胞DNA定量PCR检测方法,可用于疫苗中Vero细胞DNA残留量的检测。
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