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摘 要 以微波辐照诱变获得的红豆草根瘤菌和苜蓿根瘤菌耐氨苄青霉素突变株为供试菌株，发酵培养至菌液活菌量达1×1010 cfu/mL时加氨苄青霉素至终浓度为200 mg/L，以该菌液制备液体抗污染菌剂或添加到灭菌泥炭中制成固体防污染菌剂。结果表明：菌剂中菌株生长正常，菌株繁殖速度与无抗生素菌剂无显著差异，加入灭菌泥炭制成的防污染菌剂储藏120 d后的杂菌率仅为市面上购得的普通根瘤菌剂杂菌率的11.89%～4.7%。表明该菌剂制备技术具有设备简单、成本低廉、活菌数高、杂菌率低的特点，能有效提高根瘤菌剂质量。
关键词 氨苄青霉素；抗污染根瘤菌剂；制备技术
中图分类号：S144.9 文献标志码：A文章编号：1673-890X（2014）21--02
目前，根瘤菌剂已广泛应用于豆科作物及牧草栽培生产中，增产幅度可达10%～30%，用于新垦或低产田的增产效果更达71.2%～241%[1]。由于制备成本低，用量少，无毒害，无污染和增产明显，根瘤菌剂的生产规模逐渐扩大，并发展了一些新的品种和剂型。目前，根瘤菌剂产品面临的主要问题有：（1）高污染率。菌剂中有适宜包括环境杂菌在内的多种微生物繁衍的养分条件。在产品制备运输过程中，微小破损也极易造成杂菌侵入引起菌剂严重污染，施用后不能发挥增产效应甚至造成减产[2]，造成厂家和菌剂使用者严重的经济损失。目前，根瘤菌剂面临着8%～32%的高污染率。寻求降低污染率的方法成为菌剂生产中的核心问题。（2）目标菌种与土著根瘤菌间的竞争。土著根瘤菌已适应了原生土壤环境，竞争力强，新施入的目标根瘤菌很难形成优势群落，因此占瘤率低下，高效根瘤比例少，增产作用受限。提高目标菌株在土壤环境中的竞争力也是菌剂研发人员关注的重点问题；由此，拟探讨以优良根瘤菌的耐药突变株，结合适当浓度的氨苄青霉素制备抗污染菌剂解决上述问题的可能性，为根瘤菌剂的研究应用提供新的方法。
1 利用抗生素和耐药菌株制作抗污染根瘤菌剂的方法
利用微波辐照（约800 W，1 min）处理红豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌后，在含氨苄青霉素的选择培养基上筛选，并进行宿主植物回接实验。获得固氮酶及结瘤能力不弱于原始菌株，在含300 mg/L氨苄青霉素的环境中生长良好的红豆草根瘤菌耐青霉素突变株RSW96[3]和苜蓿根瘤菌耐青霉素突变株LW107[4]。
取2种菌株活菌含量达到1×1010 cfu/mL的部分发酵菌液中缓慢加入氨苄青霉素并逐渐搅拌，使菌液中氨苄青霉素终浓度达到200 mg/mL，將此菌液加入磷酸缓冲液后制成液体菌剂在15～4 ℃下保存，或将该菌液添加入灭菌草炭后制成抗污染菌剂[5]；另取部分培养菌液加入800 mg/mL的氨苄青霉素，参照上文制成含高浓度抗生素的试样，与含200 mg/mL氨苄青霉素的菌剂同条件下储藏；再取部分培养菌液制成无抗生素的普通菌剂。对各试样储存65 d后进行活菌数、杂菌数的测定；对菌剂进行宿主回接实验测定目标菌株占瘤率[5]。
2 菌剂测定结果
2.1 菌剂污染率
在高杂菌污染环境下放置90 d后，普通固体菌剂的平均杂菌含量为2.27×108 cfu/g，杂菌率达19.53%，而含200 mg/L氨苄青霉素的防污染固体菌剂平均杂菌率仅为0.3%～1.7%，杂菌中真菌和细菌的含量比普通菌剂分别降低14.5倍和11.12倍，能够有效降低杂菌的污染[4]。
2.2 菌剂有效活菌数
红豆草和苜蓿抗污染固体根瘤菌剂在保存65 d后活菌含量分别达到6.26×109 cfu/g和2.11×1010 cfu/g，分别是其普通固体菌剂活菌含量的302.41%和418.65%，差异极显著（P<0.01）[3]。
2.3 抑制土著根瘤菌，提高占瘤率
通过抗药平板检测法对使用普通菌剂和抗药菌剂处理苜蓿（红豆草）植株上的根瘤进行检测，普通菌剂目标菌的平均占瘤率为58.07%（红豆草）和73.12%（苜蓿），而抗污染菌剂处理的植株，目标菌的占瘤率为68.67%和89.33%，差异显著（P<0.05）。
3 优点
3.1 适宜规模推广和应用
该技术可直接利用现有常规菌剂的生产设备和发酵工艺，菌株的诱变方法简便易行，抗生素和泥炭等原料易于购置。降低了企业的技术改造和生产成本。
3.2 降低菌剂的污染率，提高活菌数
由于菌剂中含有广谱抗菌物质，菌剂在生产运输中即使接触到少量杂菌也不会引起严重污染。贮藏过程中，随着菌剂水分的散失，抑菌剂的浓度略增，对菌株会有微弱的代谢抑制，可促使菌株快速进入休眠，减少菌种在储存过程中因过量繁殖、营养耗尽引起菌体大量死亡[4]。
3.3 抑制土著根瘤菌，提高占瘤率
菌剂施用后，尽管抑菌剂稀释后浓度降低，但仍对土著根瘤菌有抑制，会为目的菌株创造利于竞争结瘤的环境，使占瘤率增大，菌剂肥效作用更为明显。
3.4 抑制土壤群落中的有害菌，减少农药使用量
氨苄青霉素会抑制土壤中的诸多病原菌。根瘤菌剂多用于拌种和苗期使用，菌剂中抗生素的降解过程与植物的生长过程同步，在降解完成、药效失去作用之前，可为幼苗期植株根系提供保护，减少农药的使用量，降低了土壤的农药污染。
3.5 降低菌剂生产过程对无菌环境的要求
该技术能够降低菌剂生产过程中对无菌环境的严格要求，菌剂生产厂家在设备和厂房上无需增加投入，在保证品质的前提下降低了菌剂的生产成本。
3.6 使用简便，易于掌握
该技术原理简单易于理解，涉及的菌种筛选方法在科研和生产中已比较成熟，便于学习和操作，能够适应不同的生产和研发环境。适宜于大范围的推广和应用。
4 与其他根瘤菌剂制备相关技术的区别
目前，严格控制生产和存储环境净度，严密封装，菌剂低营养化，冻干及固定化包埋菌种等方法均取得了良好的效果，但或者对生产设备和工艺有一定要求，不利于降低成本，或者可能以损失大量的活菌，以降低菌肥品质为代价降低污染。难以被中小菌剂厂家接受。而该技术利用常规菌株育种手段，不改变现有菌剂生产的设备和封装条件，不涉及昂贵的仪器和复杂的技术，原料易购易得，工艺简单，低成本，高收益，便于推广[4]。
另外，目前多以基因工程手段提高菌株结瘤因子的表达强度来提高目的菌株的结瘤竞争力。但根瘤菌互接种族种类繁多，作物生境多样，难以就每种作物在各具体生境下进行基因改良。该技术能抑制作物根际土著根瘤菌的繁殖，使有抗性的目的菌在时间和空间上获得优势。不同于转基因技术构建的工程菌，诱变筛选得到的抗性菌株不存在转基因菌株的生态风险，使用的抑菌剂为氨苄青霉素，属于可降解物质，无污染，高效安全。但在施用时，菌剂需要稀释以控制合理的抗生素释放浓度，降低生物安全风险[4]。
参考文献
[1]常玮，王炜，屈新兰. 苜蓿根瘤菌菌剂的研究[J]. 新疆农业科学，2004，41（2）： 103-104.
[2]Lupwayi NZ，Olsen PE，Sande ES，et al. Inoculant quality and its evaluation [J]. Field Crops Research，2000，65： 259-270.
[3]李剑峰，张淑卿，师尚礼.微波诱变选育高产生长素及耐药性根瘤菌株研究[J]. 核农学报，2009，（6）：981-985.
[4]李剑峰. 解磷根瘤菌诱变选育及抗污染菌剂制备关键技术研究[D].甘肃农业大学，2011，97-112.
[5]师尚礼，李剑峰，曹文侠，等. 一种抗污染根瘤菌剂及其制作方法： 中国，CN101935238A[P]. 2009-07-02.
（责任编辑：刘昀）
关键词 氨苄青霉素；抗污染根瘤菌剂；制备技术
中图分类号：S144.9 文献标志码：A文章编号：1673-890X（2014）21--02
目前，根瘤菌剂已广泛应用于豆科作物及牧草栽培生产中，增产幅度可达10%～30%，用于新垦或低产田的增产效果更达71.2%～241%[1]。由于制备成本低，用量少，无毒害，无污染和增产明显，根瘤菌剂的生产规模逐渐扩大，并发展了一些新的品种和剂型。目前，根瘤菌剂产品面临的主要问题有：（1）高污染率。菌剂中有适宜包括环境杂菌在内的多种微生物繁衍的养分条件。在产品制备运输过程中，微小破损也极易造成杂菌侵入引起菌剂严重污染，施用后不能发挥增产效应甚至造成减产[2]，造成厂家和菌剂使用者严重的经济损失。目前，根瘤菌剂面临着8%～32%的高污染率。寻求降低污染率的方法成为菌剂生产中的核心问题。（2）目标菌种与土著根瘤菌间的竞争。土著根瘤菌已适应了原生土壤环境，竞争力强，新施入的目标根瘤菌很难形成优势群落，因此占瘤率低下，高效根瘤比例少，增产作用受限。提高目标菌株在土壤环境中的竞争力也是菌剂研发人员关注的重点问题；由此，拟探讨以优良根瘤菌的耐药突变株，结合适当浓度的氨苄青霉素制备抗污染菌剂解决上述问题的可能性，为根瘤菌剂的研究应用提供新的方法。
1 利用抗生素和耐药菌株制作抗污染根瘤菌剂的方法
利用微波辐照（约800 W，1 min）处理红豆根瘤菌和苜蓿根瘤菌后，在含氨苄青霉素的选择培养基上筛选，并进行宿主植物回接实验。获得固氮酶及结瘤能力不弱于原始菌株，在含300 mg/L氨苄青霉素的环境中生长良好的红豆草根瘤菌耐青霉素突变株RSW96[3]和苜蓿根瘤菌耐青霉素突变株LW107[4]。
取2种菌株活菌含量达到1×1010 cfu/mL的部分发酵菌液中缓慢加入氨苄青霉素并逐渐搅拌，使菌液中氨苄青霉素终浓度达到200 mg/mL，將此菌液加入磷酸缓冲液后制成液体菌剂在15～4 ℃下保存，或将该菌液添加入灭菌草炭后制成抗污染菌剂[5]；另取部分培养菌液加入800 mg/mL的氨苄青霉素，参照上文制成含高浓度抗生素的试样，与含200 mg/mL氨苄青霉素的菌剂同条件下储藏；再取部分培养菌液制成无抗生素的普通菌剂。对各试样储存65 d后进行活菌数、杂菌数的测定；对菌剂进行宿主回接实验测定目标菌株占瘤率[5]。
2 菌剂测定结果
2.1 菌剂污染率
在高杂菌污染环境下放置90 d后，普通固体菌剂的平均杂菌含量为2.27×108 cfu/g，杂菌率达19.53%，而含200 mg/L氨苄青霉素的防污染固体菌剂平均杂菌率仅为0.3%～1.7%，杂菌中真菌和细菌的含量比普通菌剂分别降低14.5倍和11.12倍，能够有效降低杂菌的污染[4]。
2.2 菌剂有效活菌数
红豆草和苜蓿抗污染固体根瘤菌剂在保存65 d后活菌含量分别达到6.26×109 cfu/g和2.11×1010 cfu/g，分别是其普通固体菌剂活菌含量的302.41%和418.65%，差异极显著（P<0.01）[3]。
2.3 抑制土著根瘤菌，提高占瘤率
通过抗药平板检测法对使用普通菌剂和抗药菌剂处理苜蓿（红豆草）植株上的根瘤进行检测，普通菌剂目标菌的平均占瘤率为58.07%（红豆草）和73.12%（苜蓿），而抗污染菌剂处理的植株，目标菌的占瘤率为68.67%和89.33%，差异显著（P<0.05）。
3 优点
3.1 适宜规模推广和应用
该技术可直接利用现有常规菌剂的生产设备和发酵工艺，菌株的诱变方法简便易行，抗生素和泥炭等原料易于购置。降低了企业的技术改造和生产成本。
3.2 降低菌剂的污染率，提高活菌数
由于菌剂中含有广谱抗菌物质，菌剂在生产运输中即使接触到少量杂菌也不会引起严重污染。贮藏过程中，随着菌剂水分的散失，抑菌剂的浓度略增，对菌株会有微弱的代谢抑制，可促使菌株快速进入休眠，减少菌种在储存过程中因过量繁殖、营养耗尽引起菌体大量死亡[4]。
3.3 抑制土著根瘤菌，提高占瘤率
菌剂施用后，尽管抑菌剂稀释后浓度降低，但仍对土著根瘤菌有抑制，会为目的菌株创造利于竞争结瘤的环境，使占瘤率增大，菌剂肥效作用更为明显。
3.4 抑制土壤群落中的有害菌，减少农药使用量
氨苄青霉素会抑制土壤中的诸多病原菌。根瘤菌剂多用于拌种和苗期使用，菌剂中抗生素的降解过程与植物的生长过程同步，在降解完成、药效失去作用之前，可为幼苗期植株根系提供保护，减少农药的使用量，降低了土壤的农药污染。
3.5 降低菌剂生产过程对无菌环境的要求
该技术能够降低菌剂生产过程中对无菌环境的严格要求，菌剂生产厂家在设备和厂房上无需增加投入，在保证品质的前提下降低了菌剂的生产成本。
3.6 使用简便，易于掌握
该技术原理简单易于理解，涉及的菌种筛选方法在科研和生产中已比较成熟，便于学习和操作，能够适应不同的生产和研发环境。适宜于大范围的推广和应用。
4 与其他根瘤菌剂制备相关技术的区别
目前，严格控制生产和存储环境净度，严密封装，菌剂低营养化，冻干及固定化包埋菌种等方法均取得了良好的效果，但或者对生产设备和工艺有一定要求，不利于降低成本，或者可能以损失大量的活菌，以降低菌肥品质为代价降低污染。难以被中小菌剂厂家接受。而该技术利用常规菌株育种手段，不改变现有菌剂生产的设备和封装条件，不涉及昂贵的仪器和复杂的技术，原料易购易得，工艺简单，低成本，高收益，便于推广[4]。
另外，目前多以基因工程手段提高菌株结瘤因子的表达强度来提高目的菌株的结瘤竞争力。但根瘤菌互接种族种类繁多，作物生境多样，难以就每种作物在各具体生境下进行基因改良。该技术能抑制作物根际土著根瘤菌的繁殖，使有抗性的目的菌在时间和空间上获得优势。不同于转基因技术构建的工程菌，诱变筛选得到的抗性菌株不存在转基因菌株的生态风险，使用的抑菌剂为氨苄青霉素，属于可降解物质，无污染，高效安全。但在施用时，菌剂需要稀释以控制合理的抗生素释放浓度，降低生物安全风险[4]。
参考文献
[1]常玮，王炜，屈新兰. 苜蓿根瘤菌菌剂的研究[J]. 新疆农业科学，2004，41（2）： 103-104.
[2]Lupwayi NZ，Olsen PE，Sande ES，et al. Inoculant quality and its evaluation [J]. Field Crops Research，2000，65： 259-270.
[3]李剑峰，张淑卿，师尚礼.微波诱变选育高产生长素及耐药性根瘤菌株研究[J]. 核农学报，2009，（6）：981-985.
[4]李剑峰. 解磷根瘤菌诱变选育及抗污染菌剂制备关键技术研究[D].甘肃农业大学，2011，97-112.
[5]师尚礼，李剑峰，曹文侠，等. 一种抗污染根瘤菌剂及其制作方法： 中国，CN101935238A[P]. 2009-07-02.
（责任编辑：刘昀）