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摘 要 实验目的 构建小鼠端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase， TERT）基因启动子调控EGFP基因表达载体，并研究其在细胞中的转录活性。实验方法 从小鼠肌肉组织中提取全基因组，以它为模板，克隆得到mTERT启动子基因（mTERTp）片段。得到的片段经Sac I/Xba I双酶切后插入到载体pGL3-Enhancer上，得到重组质粒pmTERTp。以pEGFP-N1为模板PCR扩增得到EGFP片段，片段EGFP经Nde I/Xba I双酶切后插入到载体pmTERTp上，得到重组质粒pmTERTp-EGFP。通过脂质体介导重组质粒pmTERTp-EGFP瞬时转染NIH-3T3细胞和B16细胞，观察EGFP蛋白的表达情况。实验结果 重组质粒pmTERTp-EGFP转染B16细胞48h后，可以看到EGFP蛋白大量表达。而在NIH-3T3细胞中EGFP蛋白不表达。结论 mTERT启动子在正常细胞中无明显的转录活性，而在肿瘤细胞中的转录活性很高，说明mTERT启动子能特异性调控目的基因只在肿瘤细胞中表达。
关键词mTERT启动子 基因治疗 靶向转录
【分类号】：R346
端粒酶是一种核糖核蛋白，由端粒酶RNA（TR）、端粒酶相关蛋白（TP）和端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase， TERT）组成。其中TR和TP在正常组织和肿瘤组织中都会持续表达，无组织特异性。而TRET在过表达的情况下， 即使细胞端粒已经缩短同样会导致小鼠形成肿瘤[1，2].这说明决定端粒酶活性的主要因素是端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase， TERT）。研究表明，它在大多数人和小鼠的肿瘤细胞中表达上调[3，4，5]，而在人的正常体细胞中不表达， 在小鼠正常体细胞中表达量很低[6]。在这一过程中TERT基因启动子的转录活性扮演重要角色，TERT启动子转录活性具有肿瘤特异性。端粒酶逆转录酶启动子在肿瘤组织有很高活性，而在正常组织中活性很低。这样抗肿瘤基因在肿瘤细胞中靶向性表达就有可能性。端粒酶的功能在于能够以自身携带的RNA为模板，逆转录合成端粒DNA并添加于染色体末端，这样就阻止细胞分裂过程中端粒的进行性降解，从而维持了染色体端粒长度的稳定。因此，它是细胞无限增殖的必要条件之一，与细胞的增殖、衰老、凋亡、永生有关[7]。
将抗肿瘤基因置于TERT启动子的调控下，端粒酶阴性的正常细胞中，TERT启动子的活性明显受到抑制，这样就不能表达目的蛋白；端粒酶阳性的肿瘤细胞中，TERT启动子被明显激活，因而就能特异性的表达目的蛋白，这样可以使目的基因选择性的在肿瘤细胞中表达，并且不会影响正常组织，从而准确的杀伤肿瘤细胞[8]。
目前，对小鼠的TERT启动子区研究相对较少。鉴于TERT启动子的人源和鼠源序列差异较大，本研究中我们从小鼠基因组中克隆了小鼠TERT启动子（mTERTp）片段，将mTERTp片段和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）构建到真核载体pGL3-Enhancer上，得到重组质粒pmTERTp-EGFP，利用绿色荧光蛋白报告基因检测mTERTp启动子在小鼠成纤维细胞NIH-3T3和小鼠黑色素瘤细胞B16中的转录活性，为下一步利用小鼠动物模型研究肿瘤基因靶向治疗奠定基础。
1实验材料与方法
1.1 实验材料
1.2实验方法
1.2.1 mTERT启动子基因片段的PCR扩增和鉴定
取正常小鼠的腿部肌肉30 mg，按照Biomiga 公司的基因组提取试剂盒的说明书提取小鼠的全基因组。然后以小鼠基因组为模板，以FW（mTERTp）01/RV（mTERTp）03为上下游引物进行PCR扩增，获得mTERTp基因片段。将得到的目的片段连接到pEASY-T1载体上并转化至大肠杆菌DH5α。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落提取质粒，进行PCR和双酶切验证。阳性转化子由华大基因生物技術有限公司进行测序验证。
1.2.2 重组质粒pmTERTp的构建
以质粒pEASY-T1- mTERTp为模板，以FW（mTERTp）01/RV（mTERTp）03为上下游引物进行PCR扩增mTERTp基因片段，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并对PCR片段采用胶回收试剂盒进行回收，然后于37 ℃经Sac I/Xba I双酶切4 h。然后与经过相同酶切的载体pGL3-Enhancer在16 ℃过夜连接。次日将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，利用菌体PCR筛选阳性转化菌株提取质粒，质粒用Sac I/Xba I进行酶切鉴定，获得的重组质粒pmTERTp由华大基因生物技术有限公司进行测序验证。
1.2.3重组质粒pmTERTp-EGFP的构建
以质粒pEGFP-N1为模板，以FW（EGFP）/RV（EGFP）为上下游引物进行PCR扩增EGFP基因片段，PCR产物用1%琼脂糖凝胶回收并纯化，然后于37 ℃经Nde I/Xba I双酶切4 h。然后与经过相同酶切的载体pmTERTp在16 ℃过夜连接，连接产物全部转化到E.coli DH5α感受态细胞，利用菌体PCR筛选阳性转化菌株提取质粒，质粒用NdeI/Xba I进行双酶切鉴定，获得的重组质粒pmTERTp-EGFP由华大基因生物技术有限公司进行测序验证。
1.2.4 细胞培养、瞬时转染分析EGFP在细胞中表达
小鼠成纤维细胞NIH-3T3和小鼠黑色素瘤细胞B16常规在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DMEM/ RPMI-1640培养液中培养，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中孵育培养。 检测mTERT启动子在B16细胞和正常细胞NIH-3T3中的转录活性。首先，将上述两种细胞（1×105个/孔）接种到6孔板中，24 h后细胞至60%融合后用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂介导重组质粒pmTERTp- EGFP和對照质粒pEGFP-N1分别转染上述两种细胞。转染方法按照脂质体说明书操作。转染后继续培养48h后，用去卷积活细胞工作站Delta Vision观察报告基因EGFP的表达情况。
2 实验结果
2.1 mTERT启动子片段的PCR扩增
以小鼠肌肉细胞基因组DNA为模板， 以FW（mTERTp）01/RV（mTERTp）03为引物进行PCR扩增，获得mTERTp片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示，结果显示mTERTp片段大小约1100bp，与预期结果一致。然后将mTERTp片段连接到pEASY-T1载体上，得到重组质粒pEASY-T1-mTERTp。阳性克隆由华大基因生物技术有限公司进行测序验证，测序结果表明克隆的mTERT启动子基因序列与Genebank中mTERT启动子的序列一致。
讨论
端粒酶活性主要是由于TERT基因的转录受到严格的调控，TERT启动子一般只在肿瘤细胞中具有转录活性。所以用TERT基因启动子来调控抗肿瘤基因的表达，从而降低基因治疗中对正常组织的毒性，这已经成为肿瘤基因治疗的关键。本研究以小鼠基因组为模板PCR扩增得到小鼠TERT启动子（mTERTp）片段，将mTERTp片段和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）构建到载体pGL3-Enhancer上，得到重组质粒pmTERTp-EGFP。通过瞬时转染NIH-3T3和B16细胞，观察绿色荧光蛋白的表达。转染后48h观察到EGFP在B16细胞中大量表达，在NIH-3T3细胞中几乎不表达。说明我们构建的mTERT启动子元件可以特异性地调控目的基因在肿瘤细胞内表达。
参考文献
1. Artandi SE， Alson S，Tietze MK， etal. Constitutive telomerase expression， promotes mammary carcinomas in aging mice [J].Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99： 8191-8196.
2. Gonzalez Suarez E， Samper E， Ramirez A， etal. Increased epidermal tumors and increased skin wound healing in transgenic mice over expressing the catalytic subunit of telomerase， mTERT， in basal keratinocytes [J]. EMBO J， 2001， 20： 2619-2630.
3. Foddis R， De Rienzo A， Broccoli D， etal. SV40 infection induces telomerase activity in human mesothelial cells [J]. Oncogene， 2002， 21： 1434-14426.
4. Kimura M， Koida T，Yanagita Y. A study on telomerase activity and prognosis in breast cancer [J]. Med Oncol， 2003， 20： 117-126.
5. Bednarek A Budunova I， Slaga TJ， etal. Increased telomerase activity in mouse skin premalignant progression [J]. Cancer Res， 1995， 55： 4566-4569.
6. Autexier C，Greider CW.Telomerase and cancer revisiting the telomere hypothesis[J]. Trends Biochem Sci， 1996， 21： 10：387-391.
7. David T. Breault，Irene M. Min， Diana L.， etal.Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells [J]. PNAS， 2008， 105：10420-10425.
8. Marie Meznikova，Natalie Erdmann， etal. Telomerase reverse transcriptase-dependent telomere equilibration mitigates tissue dysfunction in mTert heterozygotes[J]. Disease Models & Mechanisms， 2009， 50： 2620-2026.
关键词mTERT启动子 基因治疗 靶向转录
【分类号】：R346
端粒酶是一种核糖核蛋白，由端粒酶RNA（TR）、端粒酶相关蛋白（TP）和端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase， TERT）组成。其中TR和TP在正常组织和肿瘤组织中都会持续表达，无组织特异性。而TRET在过表达的情况下， 即使细胞端粒已经缩短同样会导致小鼠形成肿瘤[1，2].这说明决定端粒酶活性的主要因素是端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase， TERT）。研究表明，它在大多数人和小鼠的肿瘤细胞中表达上调[3，4，5]，而在人的正常体细胞中不表达， 在小鼠正常体细胞中表达量很低[6]。在这一过程中TERT基因启动子的转录活性扮演重要角色，TERT启动子转录活性具有肿瘤特异性。端粒酶逆转录酶启动子在肿瘤组织有很高活性，而在正常组织中活性很低。这样抗肿瘤基因在肿瘤细胞中靶向性表达就有可能性。端粒酶的功能在于能够以自身携带的RNA为模板，逆转录合成端粒DNA并添加于染色体末端，这样就阻止细胞分裂过程中端粒的进行性降解，从而维持了染色体端粒长度的稳定。因此，它是细胞无限增殖的必要条件之一，与细胞的增殖、衰老、凋亡、永生有关[7]。
将抗肿瘤基因置于TERT启动子的调控下，端粒酶阴性的正常细胞中，TERT启动子的活性明显受到抑制，这样就不能表达目的蛋白；端粒酶阳性的肿瘤细胞中，TERT启动子被明显激活，因而就能特异性的表达目的蛋白，这样可以使目的基因选择性的在肿瘤细胞中表达，并且不会影响正常组织，从而准确的杀伤肿瘤细胞[8]。
目前，对小鼠的TERT启动子区研究相对较少。鉴于TERT启动子的人源和鼠源序列差异较大，本研究中我们从小鼠基因组中克隆了小鼠TERT启动子（mTERTp）片段，将mTERTp片段和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）构建到真核载体pGL3-Enhancer上，得到重组质粒pmTERTp-EGFP，利用绿色荧光蛋白报告基因检测mTERTp启动子在小鼠成纤维细胞NIH-3T3和小鼠黑色素瘤细胞B16中的转录活性，为下一步利用小鼠动物模型研究肿瘤基因靶向治疗奠定基础。
1实验材料与方法
1.1 实验材料
1.2实验方法
1.2.1 mTERT启动子基因片段的PCR扩增和鉴定
取正常小鼠的腿部肌肉30 mg，按照Biomiga 公司的基因组提取试剂盒的说明书提取小鼠的全基因组。然后以小鼠基因组为模板，以FW（mTERTp）01/RV（mTERTp）03为上下游引物进行PCR扩增，获得mTERTp基因片段。将得到的目的片段连接到pEASY-T1载体上并转化至大肠杆菌DH5α。经蓝白斑筛选，挑取白色菌落提取质粒，进行PCR和双酶切验证。阳性转化子由华大基因生物技術有限公司进行测序验证。
1.2.2 重组质粒pmTERTp的构建
以质粒pEASY-T1- mTERTp为模板，以FW（mTERTp）01/RV（mTERTp）03为上下游引物进行PCR扩增mTERTp基因片段，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并对PCR片段采用胶回收试剂盒进行回收，然后于37 ℃经Sac I/Xba I双酶切4 h。然后与经过相同酶切的载体pGL3-Enhancer在16 ℃过夜连接。次日将连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞，利用菌体PCR筛选阳性转化菌株提取质粒，质粒用Sac I/Xba I进行酶切鉴定，获得的重组质粒pmTERTp由华大基因生物技术有限公司进行测序验证。
1.2.3重组质粒pmTERTp-EGFP的构建
以质粒pEGFP-N1为模板，以FW（EGFP）/RV（EGFP）为上下游引物进行PCR扩增EGFP基因片段，PCR产物用1%琼脂糖凝胶回收并纯化，然后于37 ℃经Nde I/Xba I双酶切4 h。然后与经过相同酶切的载体pmTERTp在16 ℃过夜连接，连接产物全部转化到E.coli DH5α感受态细胞，利用菌体PCR筛选阳性转化菌株提取质粒，质粒用NdeI/Xba I进行双酶切鉴定，获得的重组质粒pmTERTp-EGFP由华大基因生物技术有限公司进行测序验证。
1.2.4 细胞培养、瞬时转染分析EGFP在细胞中表达
小鼠成纤维细胞NIH-3T3和小鼠黑色素瘤细胞B16常规在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DMEM/ RPMI-1640培养液中培养，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中孵育培养。 检测mTERT启动子在B16细胞和正常细胞NIH-3T3中的转录活性。首先，将上述两种细胞（1×105个/孔）接种到6孔板中，24 h后细胞至60%融合后用脂质体LipofectamineTM2000转染试剂介导重组质粒pmTERTp- EGFP和對照质粒pEGFP-N1分别转染上述两种细胞。转染方法按照脂质体说明书操作。转染后继续培养48h后，用去卷积活细胞工作站Delta Vision观察报告基因EGFP的表达情况。
2 实验结果
2.1 mTERT启动子片段的PCR扩增
以小鼠肌肉细胞基因组DNA为模板， 以FW（mTERTp）01/RV（mTERTp）03为引物进行PCR扩增，获得mTERTp片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示，结果显示mTERTp片段大小约1100bp，与预期结果一致。然后将mTERTp片段连接到pEASY-T1载体上，得到重组质粒pEASY-T1-mTERTp。阳性克隆由华大基因生物技术有限公司进行测序验证，测序结果表明克隆的mTERT启动子基因序列与Genebank中mTERT启动子的序列一致。
讨论
端粒酶活性主要是由于TERT基因的转录受到严格的调控，TERT启动子一般只在肿瘤细胞中具有转录活性。所以用TERT基因启动子来调控抗肿瘤基因的表达，从而降低基因治疗中对正常组织的毒性，这已经成为肿瘤基因治疗的关键。本研究以小鼠基因组为模板PCR扩增得到小鼠TERT启动子（mTERTp）片段，将mTERTp片段和增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）构建到载体pGL3-Enhancer上，得到重组质粒pmTERTp-EGFP。通过瞬时转染NIH-3T3和B16细胞，观察绿色荧光蛋白的表达。转染后48h观察到EGFP在B16细胞中大量表达，在NIH-3T3细胞中几乎不表达。说明我们构建的mTERT启动子元件可以特异性地调控目的基因在肿瘤细胞内表达。
参考文献
1. Artandi SE， Alson S，Tietze MK， etal. Constitutive telomerase expression， promotes mammary carcinomas in aging mice [J].Proc Natl Acad Sci USA， 2002， 99： 8191-8196.
2. Gonzalez Suarez E， Samper E， Ramirez A， etal. Increased epidermal tumors and increased skin wound healing in transgenic mice over expressing the catalytic subunit of telomerase， mTERT， in basal keratinocytes [J]. EMBO J， 2001， 20： 2619-2630.
3. Foddis R， De Rienzo A， Broccoli D， etal. SV40 infection induces telomerase activity in human mesothelial cells [J]. Oncogene， 2002， 21： 1434-14426.
4. Kimura M， Koida T，Yanagita Y. A study on telomerase activity and prognosis in breast cancer [J]. Med Oncol， 2003， 20： 117-126.
5. Bednarek A Budunova I， Slaga TJ， etal. Increased telomerase activity in mouse skin premalignant progression [J]. Cancer Res， 1995， 55： 4566-4569.
6. Autexier C，Greider CW.Telomerase and cancer revisiting the telomere hypothesis[J]. Trends Biochem Sci， 1996， 21： 10：387-391.
7. David T. Breault，Irene M. Min， Diana L.， etal.Generation of mTert-GFP mice as a model to identify and study tissue progenitor cells [J]. PNAS， 2008， 105：10420-10425.
8. Marie Meznikova，Natalie Erdmann， etal. Telomerase reverse transcriptase-dependent telomere equilibration mitigates tissue dysfunction in mTert heterozygotes[J]. Disease Models & Mechanisms， 2009， 50： 2620-2026.